專利名稱：一種斷端對(duì)接式發(fā)夾型dna探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物分子診斷和生物芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針。
背景技術(shù)：
發(fā)夾型DNA探針(原始結(jié)構(gòu)又叫分子信標(biāo)molecular beacon)是根據(jù)核酸堿基配對(duì)原則和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluores-cence resonance energy transfer, FRET)現(xiàn)象設(shè)計(jì)、常溫下空間結(jié)構(gòu)上呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)的一種DNA分子探針。環(huán)序列與靶核酸互補(bǔ)；莖由與靶序列無(wú)關(guān)的互補(bǔ)序列結(jié)合構(gòu)成；兩末端分別標(biāo)記熒光/淬滅分子。熒光FRET現(xiàn)象常溫下發(fā)夾探針呈完整莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)(折疊發(fā)夾狀態(tài))，熒光/淬滅分子接觸緊密，因淬滅作用熒光信號(hào)很弱(抑光態(tài))；當(dāng)溫度升高或環(huán)序列與靶序列結(jié)合后，莖環(huán)打開(展開狀態(tài))，熒光/淬滅分子對(duì)分離，淬滅作用減弱，熒光信號(hào)較強(qiáng)(發(fā)光態(tài))；溫度下降可復(fù)原，呈現(xiàn)隨溫度變化引起的可逆循環(huán)“展開發(fā)光態(tài)-折疊抑光態(tài)”。發(fā)夾探針這種折展?fàn)顟B(tài)導(dǎo)致“熒光釋放-抑制”與溫度和靶序列等高度相關(guān)。與常規(guī)線型核酸探針相比，隨結(jié)構(gòu)變化而引起熒光信號(hào)顯著改變的發(fā)夾探針具有明顯優(yōu)勢(shì)1.非常的高特異性和靈敏度發(fā)夾探針對(duì)單個(gè)堿基錯(cuò)配、缺失或插入突變具有更強(qiáng)的檢測(cè)能力，特別適用于SNP位點(diǎn)(單核苷酸多態(tài)性)一類的單堿基改變檢測(cè)；2.性能穩(wěn)定可重復(fù)使用等。目前常作為游離態(tài)探針應(yīng)用于熒光定量PCR、 活體內(nèi)核酸檢測(cè)等無(wú)固載技術(shù)領(lǐng)域。生物固載技術(shù)指生物分子(如探針等)固定在芯片、磁珠、微球等載體表面作識(shí)別探針的技術(shù)，核心是探針分子。發(fā)夾探針?biāo)赜小肮忾_關(guān)”之稱，折_展?fàn)顟B(tài)與靶環(huán)單堿基匹配程度高度關(guān)聯(lián)，設(shè)計(jì)嚴(yán)密的發(fā)夾靶環(huán)錯(cuò)一個(gè)堿基也不能打開莖環(huán)，因此特別適用于單鹼基位點(diǎn)檢測(cè)。但長(zhǎng)久以來(lái)受結(jié)構(gòu)限制(探針兩末端分別修飾熒光-淬滅分子對(duì)而占用，缺少一個(gè)連接臂固定在載體表面)，常為游離狀態(tài)的發(fā)夾探針在芯片在固載表面的固定難題一直制約著其在生物固載領(lǐng)域的運(yùn)用，并嚴(yán)重影響其優(yōu)越性能發(fā)揮。為解決固定難題，按常規(guī)思路需要加一條連接臂與載體連接，環(huán)不能動(dòng)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者只能在探針的莖臂上修飾，這也是目前的主研方向。莖臂修飾的發(fā)夾探針(國(guó)內(nèi)外報(bào)道最多見)是莖臂修飾生物素方式 生物素(biotin)修飾到探針莖臂，親和素(avidin)固定到芯片表面，通過(guò)biotin-avidin 結(jié)合力固定，問(wèn)題1，發(fā)夾探針莖臂修飾有很高技術(shù)難度。2，莖臂修飾生物素的游離態(tài)發(fā)夾探針與芯片表面親和素結(jié)合無(wú)特異性難以應(yīng)用檢測(cè)多分子，國(guó)外有少量研究報(bào)道目前主要限于單分子檢測(cè)。另一種中間修飾方式莖臂單側(cè)延長(zhǎng)末端修飾固定、與互補(bǔ)鏈熒光素對(duì)應(yīng)中間位置修飾淬滅分子以達(dá)到熒光淬滅效應(yīng)。但仍然存在兩個(gè)問(wèn)題1，發(fā)夾探針的莖臂中間修飾淬滅素分子仍然存在較高技術(shù)難度和較高的修飾合成成本；2，中間標(biāo)記對(duì)熒光分子(或淬滅分子)本身具有高選擇性，許多性能優(yōu)良的常用熒光分子由于技術(shù)原因無(wú)法中間修飾，從而影響到使用。以上“莖臂修飾”(即中間修飾)都存在較高技術(shù)難度和修飾昂貴等痼疾；第二種還存在只能標(biāo)記高選擇性熒光/淬滅分子問(wèn)題。核心問(wèn)題是解決發(fā)夾探針在固載表面的固定難題。我們對(duì)問(wèn)題進(jìn)行了深入剖析熒光-淬滅分子對(duì)的距離遠(yuǎn)近引起的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)現(xiàn)象是發(fā)夾探針諸多優(yōu)勢(shì)的原始技術(shù)來(lái)源，因此設(shè)計(jì)原則上離不開熒光/淬滅這兩個(gè)分子對(duì)，而要固定到固載支持物表面就必須還要接一個(gè)連接分子(如生物素/氨基/巰基等)。發(fā)夾探針展開后是一條完整的單鏈核酸(一般30-40bp)，只有兩個(gè)末端(3'、5'端)；而熒光分子、淬滅分子、連接分子，這三個(gè)必須分開的大分子按照常規(guī)思路設(shè)計(jì)是無(wú)論如何也不能同時(shí)放到兩端的， 如果兩末端分別修飾熒光/淬滅分子而占用，必然有第三個(gè)分子被“擠”在被占用的探針兩末端以外，這就是造成國(guó)內(nèi)外在該領(lǐng)域研究中必須要涉及核酸單鏈中間修飾的根本原因。 這也是長(zhǎng)期以來(lái)弓丨起發(fā)夾探針固定難題及其運(yùn)用的根本原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是避開“單鏈核酸中間修飾”這個(gè)常規(guī)思路設(shè)計(jì)，保證無(wú)靶序列存在時(shí)熒光-淬滅分子對(duì)緊鄰(無(wú)熒光)、有靶序列存在并雜交后分離(發(fā)出熒光)，即保證熒光FRET現(xiàn)象前題下，把“熒光分子、淬滅分子、連接分子”三者放到發(fā)夾探針上，更充分發(fā)揮發(fā)夾型DNA探針的優(yōu)勢(shì)。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種將熒光素及淬滅素分段標(biāo)記的斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針，其技術(shù)方案如下?！N斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針，包括主鏈與輔鏈；其中主鏈包括依次相連的第一莖序列、環(huán)序列、第二莖序列、延長(zhǎng)臂序列，其中環(huán)序列是與靶序列完全匹配的堿基序列， 第一、二莖序列堿基互補(bǔ)且互補(bǔ)結(jié)合；第一莖序列的一端與環(huán)序列相連，另一端修飾有熒光分子或淬滅分子，延長(zhǎng)臂序列的一端與第二莖序列相連，另一端修飾有用于與生物載體表面相固定的固定基團(tuán)；輔鏈?zhǔn)桥c所述延長(zhǎng)臂序列堿基互補(bǔ)且互補(bǔ)結(jié)合的單鏈核酸，在輔鏈上、與第一莖序列相近的末端修飾有與上述熒光分子或淬滅分子相對(duì)應(yīng)的淬滅分子或熒光分子，主、輔鏈結(jié)合形成熒光一淬滅分子對(duì)。進(jìn)一步，所述生物載體包括生物分子固定化基片、殼聚糖。進(jìn)一步，所述固定基團(tuán)包括氨基基團(tuán)。 上述斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針，探針分為由主鏈和輔鏈兩段，主鏈呈帶延長(zhǎng)臂的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，延長(zhǎng)臂末端修飾氨基等常規(guī)固定基團(tuán)以方便固定在芯片、磁珠、殼聚糖等生物載體表面，以常規(guī)成熟方式完成固定過(guò)程，第一莖序列末端按常規(guī)方式修飾熒光分子；輔鏈呈一短片段的單鏈核酸，根據(jù)堿基配對(duì)輔鏈上預(yù)設(shè)與第一莖序列相近的末端按常規(guī)方式修飾與主鏈修飾的熒光分子或淬滅分子相對(duì)應(yīng)的淬滅分子或熒光分子。輔鏈序列與主鏈的延長(zhǎng)臂序列堿基互補(bǔ)，主、輔鏈互補(bǔ)結(jié)合后，輔鏈末端的淬滅分子或熒光分子與主鏈末端的熒光分子或淬滅分子正好斷端對(duì)接緊密靠近，形成具有熒光FRET現(xiàn)象的熒光-淬滅分子對(duì)。構(gòu)建過(guò)程包括以下步驟(1)構(gòu)建斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針的主鏈，包括依次相連的第一莖序列、環(huán)序列、第二莖序列、延長(zhǎng)臂序列，其中環(huán)序列是與靶序列完全匹配的堿基序列，兩莖序列堿基互補(bǔ)且互補(bǔ)結(jié)合；第一莖序列的一端與環(huán)序列相連，另一端修飾熒光分子或淬滅分子，延長(zhǎng)臂序列的一端與第二莖序列相連，另一端修飾用于與生物載體表面相固定的固定基團(tuán)；
(2)構(gòu)建斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針的輔鏈，是與所述延長(zhǎng)臂序列完全堿基互補(bǔ)的單鏈核酸；將輔鏈的預(yù)設(shè)相近末端修飾與步驟(1)中的熒光分子或淬滅分子相對(duì)應(yīng)的淬滅分子或熒光分子；所述預(yù)設(shè)相近末端，即根據(jù)堿基配對(duì)原則，主、輔鏈互補(bǔ)結(jié)合后輔鏈兩末端中將與第一莖序列相近的一端；(3)將上述主、輔鏈互補(bǔ)結(jié)合。最后用軟件驗(yàn)證生成物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并經(jīng)genbank比對(duì)，驗(yàn)證合格后即完成斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針。本發(fā)明斷接式發(fā)夾探針使用時(shí)，主鏈延長(zhǎng)臂末端修飾氨基等常規(guī)固定基團(tuán)固定在芯片、磁珠等生物載體表面，輔鏈與主鏈延長(zhǎng)臂互補(bǔ)形成雙鏈，輔鏈末端的淬滅分子或熒光分子與主鏈莖序列末端的熒光分子或淬滅分子正好斷端對(duì)接緊密靠近，形成熒光-淬滅分子對(duì)的完整結(jié)構(gòu)而具有顯著的淬滅作用。當(dāng)有靶序列存在時(shí)，與互補(bǔ)的主鏈環(huán)序列雜交結(jié)合拉開主鏈的莖結(jié)構(gòu)，從而使斷端對(duì)接的熒光-淬滅分子對(duì)分開，發(fā)生熒光FRET現(xiàn)象淬滅作用消失，在激發(fā)光照射下發(fā)出熒光，從而檢測(cè)到靶序列的存在；沒有靶序列時(shí)，則探針結(jié)構(gòu)完整檢測(cè)不到熒光。本發(fā)明相比于現(xiàn)有的發(fā)夾型DNA探針技術(shù)，具有以下有益效果及優(yōu)點(diǎn)(1)合成技術(shù)難度低，技術(shù)成熟非常容易實(shí)現(xiàn)。無(wú)論是主鏈兩末端修飾熒光分子和固定基團(tuán)(即所述的連接分子)，還是輔助鏈末端修飾淬滅分子，都是成熟的末端標(biāo)記(修飾)常規(guī)技術(shù)，沒有任何一點(diǎn)困難也沒有合成成本提高的問(wèn)題，通過(guò)巧妙設(shè)計(jì)的互補(bǔ)雙鏈核酸斷端對(duì)接，使熒光素和淬滅素緊密接觸，使傳統(tǒng)發(fā)夾型DNA探針的技術(shù)核心一一熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)現(xiàn)象得以變位實(shí)現(xiàn)。當(dāng)靶分子與探針雜交結(jié)合后莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，熒光分子遠(yuǎn)離淬滅分子而發(fā)出熒光。(2)避開了傳統(tǒng)設(shè)計(jì)最主要的技術(shù)難點(diǎn)發(fā)夾探針莖臂中間修飾技術(shù)難。(3)該探針在設(shè)計(jì)使用上具有較好的適用性。如在針對(duì)高通量多分子檢測(cè)時(shí)要設(shè)計(jì)相應(yīng)的高通量探針群，設(shè)計(jì)者只需專注設(shè)計(jì)主鏈環(huán)序列的雜交特異性，其余如主鏈莖結(jié)構(gòu)及單側(cè)延長(zhǎng)臂序列、輔助鏈序列均只使用一種設(shè)計(jì)，并可通用于所有的高通量探針群，減化了設(shè)計(jì)難度。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)一步說(shuō)明圖1本發(fā)明方法構(gòu)建的斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針結(jié)構(gòu)示意圖。圖2本發(fā)明方法構(gòu)建的斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針使用性能示意圖。圖3本發(fā)明方法構(gòu)建的斷接式發(fā)夾型DNA探針實(shí)際檢測(cè)結(jié)核基因片段結(jié)果
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明方法所構(gòu)建的探針圖1、圖2是本發(fā)明方法構(gòu)建的斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針結(jié)構(gòu)和使用性能示意圖，是針對(duì)如該圖2中所示的靶序列所構(gòu)建，由圖2可見，主鏈(A鏈)延長(zhǎng)臂末端修飾氨基等常規(guī)固定基團(tuán)固定在芯片、殼聚糖、磁珠等生物載體表面，輔鏈(B鏈)與主鏈(A鏈)延長(zhǎng)臂下段互補(bǔ)形成雙鏈，輔鏈(B鏈)末端的淬滅分子與主鏈(A鏈)莖序列末端的熒光分子正好斷端對(duì)接緊密靠近，形成熒光-淬滅分子對(duì)的完整結(jié)構(gòu)而具有顯著的淬滅作用。當(dāng)有靶序列存在時(shí)，與互補(bǔ)的主鏈(A鏈)環(huán)序列雜交結(jié)合拉開主鏈(A鏈)的莖結(jié)構(gòu)，從而使 斷端對(duì)接的熒光-淬滅分子對(duì)分開，發(fā)生熒光FRET現(xiàn)象淬滅作用消失，在激發(fā)光照射下發(fā)出熒光，從而檢測(cè)到靶序列的存在；沒有靶序列時(shí)，則探針結(jié)構(gòu)完整檢測(cè)不到熒光。實(shí)施例2靈敏性試驗(yàn)以不同濃度靶序列做靈敏性試驗(yàn)，先觀察第一組10mg/L、5mg/L、lmg/L ；第二組 500ug/L、100ug/L、10ug/L、lug/L ；、第三組500pg/L、100pg/L、10pg/L、lpg/L 等不同濃度組別靶序列與預(yù)先設(shè)計(jì)好的斷接式發(fā)夾探針雜交后，在芯片掃描儀上觀測(cè)熒光強(qiáng)度，確定檢測(cè)的最低濃度組別單位(mg\ug\pg)，再往下作某一濃度組別單位的精確濃度靈敏性試驗(yàn)，如 pg 級(jí)500pg/L、400pg/L、300pg/L、100pg/L、50pg/L、40pg/L、30pg/L、20pg/L、10pg/ L—試驗(yàn)結(jié)果在芯片掃描儀上觀測(cè)熒光強(qiáng)度最低濃度與陰性對(duì)照熒光具有明顯區(qū)別。(一般以陽(yáng)性熒光/陰性熒光> 1. 5為判斷標(biāo)準(zhǔn))說(shuō)明本發(fā)明的方法構(gòu)建的探針具有高靈敏性。實(shí)施例3特異性試驗(yàn)預(yù)先設(shè)計(jì)好靶序列及對(duì)應(yīng)斷接式發(fā)夾探針，另外設(shè)計(jì)合成10條與預(yù)先設(shè)計(jì)好的靶序列及斷接式發(fā)夾探針無(wú)關(guān)的干擾序列(經(jīng)比對(duì)證明不能雜交結(jié)合)，在雜交條件固定情況下分別與特異性斷接式發(fā)夾探針雜交，在芯片掃描儀上觀測(cè)熒光，比較特異性靶序列和無(wú)關(guān)干擾序列與特異探針雜交的熒光信號(hào)強(qiáng)弱。試驗(yàn)結(jié)果特異性靶序列與特異性斷接式發(fā)夾探針雜交熒光信號(hào)強(qiáng)，而無(wú)關(guān)干擾序列與特異探針無(wú)雜交熒光背境信號(hào)弱。說(shuō)明斷接式發(fā)夾探針能特異性檢測(cè)特異靶序列。實(shí)施例4本發(fā)明的探針能進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)的試驗(yàn)預(yù)先設(shè)計(jì)好針對(duì)某病原體(如結(jié)核分支桿菌TB)特異片段的靶序列及對(duì)應(yīng)斷接式發(fā)夾探針，收集臨床相應(yīng)某病原菌標(biāo)本(如TB)若干(> 400份)，標(biāo)本處理后分別與對(duì)應(yīng)探針雜交，觀察雜交的熒光信號(hào)，設(shè)陰性對(duì)照，從而證明該探針能大規(guī)模進(jìn)行臨床檢測(cè)。芯片表面高密度點(diǎn)樣，一份樣本雙份點(diǎn)樣，統(tǒng)一設(shè)陰性對(duì)照，雜交沖洗后，熒光掃描儀下掃描，以陽(yáng)性熒光/陰性熒光> 1. 5為判斷標(biāo)準(zhǔn)(以儀器軟件分析)。實(shí)施例5本發(fā)明的斷接式發(fā)夾探針設(shè)計(jì)方法及其在對(duì)結(jié)核桿菌基因檢測(cè)上的應(yīng)用步驟一針對(duì)結(jié)核桿菌保守序列IS986通過(guò)軟件Primer 5. 0設(shè)計(jì)靶序列(1)下表中間為擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物為245bp(加粗)，兩端為擴(kuò)增引物(字下加線表示)Primerl :5，-CGTGAGGGATCGAGGTGGC-3，Primer2 :5， -GCGTAGGCTCGGTGACAAA-3，
權(quán)利要求
1.一種斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針，其特征是，包括主鏈與輔鏈；其中主鏈包括依次相連的第一莖序列、環(huán)序列、第二莖序列、延長(zhǎng)臂序列，其中環(huán)序列是與靶序列完全匹配的堿基序列，第一、二莖序列堿基互補(bǔ)且互補(bǔ)結(jié)合；第一莖序列的一端與環(huán)序列相連，另一端修飾有熒光分子或淬滅分子，延長(zhǎng)臂序列的一端與第二莖序列相連，另一端修飾有用于與生物載體表面相固定的固定基團(tuán)；輔鏈?zhǔn)桥c所述延長(zhǎng)臂序列堿基互補(bǔ)且互補(bǔ)結(jié)合的單鏈核酸；在輔鏈上、與第一莖序列相近的末端修飾有與上述熒光分子或淬滅分子相對(duì)應(yīng)的淬滅分子或熒光分子，主、輔鏈結(jié)合形成熒光-淬滅分子對(duì)。
2.權(quán)利要求1所述的斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針，其特征是，所述生物載體包括生物分子固定化基片、殼聚糖。
3.權(quán)利要求1所述的斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針，其特征是，所述固定基團(tuán)包括氨基基團(tuán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種斷端對(duì)接式發(fā)夾型DNA探針，包括主鏈與輔鏈；其中主鏈包括依次相連的第一莖序列、環(huán)序列、第二莖序列、延長(zhǎng)臂序列，其中環(huán)序列是與靶序列完全匹配的堿基序列，兩莖序列互補(bǔ)結(jié)合，主鏈的莖序列末端修飾有熒光分子或淬滅分子，主鏈的延長(zhǎng)臂序列末端修飾有用于與生物載體表面相固定的固定基團(tuán)；輔鏈?zhǔn)桥c所述延長(zhǎng)臂序列互補(bǔ)結(jié)合的單鏈核酸；在輔鏈上、與第一莖序列相近的末端修飾有與上述熒光分子或淬滅分子相對(duì)應(yīng)的淬滅分子或熒光分子，主、輔鏈結(jié)合形成熒光-淬滅分子對(duì)。本發(fā)明克服了中間修飾存在的高技術(shù)難度和修飾昂貴的技術(shù)缺陷，通過(guò)互補(bǔ)雙鏈核酸斷端對(duì)接，使熒光素和淬滅素緊鄰，使熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)現(xiàn)象得以變位實(shí)現(xiàn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102154276SQ20111004722
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月28日
發(fā)明者陳慶海 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院