專利名稱：棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因及其在提高植物抗逆性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因及其在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗壞血酸過氧化物酶(ascortate peroxidase, APX )，又稱維生素C過氧化物酶， 存在于高等植物、真核藻類及某些藍細菌中，在某些昆蟲中也檢測出APX活性。在高等植物中，抗壞血酸(ascorbic acid, AsA)-谷胱甘肽(glutathione，GSH)循環(huán)對于清除活性氧具有極其重要的作用。其中抗壞血酸過氧化物酶(APX)是AsA -GSH循環(huán)中的關(guān)鍵酶。APX 參與活性氧清除的最大特點在于對底物AsA有極高的專一性，且能夠在較低水平的AsA下發(fā)揮作用。對抗壞血酸過氧化物酶的功能研究表明，APX對提高植物的抗逆性起到了顯著的作用。因此，克隆植物APX基因并通過轉(zhuǎn)基因的方法來增強該基因的表達，對于提高植物抗逆性以及改良植物品種具有重要的現(xiàn)實意義。目前，已有多種植物的APX基因被克隆并應(yīng)用于提高植物的抗逆性。1976年，F(xiàn)oyer和Hailiwell首先發(fā)現(xiàn)了以AsA為電子供體的一種過氧化物酶。 1980年，Nakano和Asada正式確定此酶為APX，存在于葉綠體的基質(zhì)中。目前，不少研究者已在多種植物上進行了 APX各種同工酶基因的分子克隆，但多集中在草本植物中，如菠菜、豌豆、浮萍、棉花、黃瓜、蓖麻子、向日葵、茶葉、小麥、玉米、煙草、西葫蘆等。由于木本植物遺傳背景較復(fù)雜，至今僅蘋果的APX基因和葡萄抗白粉病的APX基因被克隆。然而，對于中國古老的、重要的經(jīng)濟樹種-棗樹的APX基因的研究還沒有相關(guān)報道，到目前為止，還未見有從棗樹中分離出APX基因并應(yīng)用于提高植物抗逆性的報道。棗樹原產(chǎn)于我國黃河流域，是我國特有的經(jīng)濟林樹種之一，棗樹耐寒，抗旱，抵御各種外界不良因子的能力強，尤其是對于土壤瘠薄、氣候干旱有很強的忍耐力，在晉西北、 太行山、陜北等黃土高原地區(qū)，棗樹一般生長在土壤相當貧瘠、少雨干旱的丘陵山坡、高崖邊等不良環(huán)境下，且都能正常生長結(jié)果。這種極其耐旱、耐瘠薄的特點顯著優(yōu)于其它農(nóng)作物，因此棗樹的抗逆性基因是非常寶貴的遺傳資源，了解具有優(yōu)良抗性的棗樹的抗逆機制以及逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達、功能及調(diào)控，可為充分利用這些優(yōu)良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定的實驗數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因及其在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示。由所述的一種棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 2 所示。一種棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。本發(fā)明從壺瓶棗樹(Zizyphus jujuba Mill. HUPING)的結(jié)果枝(即棗吊)，利用 CTAB法提取總RNA，根據(jù)mRNA純化試劑盒的方法從提取到的總RNA中分離純化mRNA，構(gòu)建cDNA文庫，測序后通過NCBI Blast分析與比對，從中篩選到一個cDNA序列為棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因的全序列，將其命名為^7 /沈(Zizyphus jujube Mill, ascorbate peroxidase)。生物信息學(xué)分析表明基因的cDNA序列全長為75!3bp，編碼251個氨基酸，其中包含32個酸性氨基酸，20個堿性氨基酸，蛋白質(zhì)的相對分子量為62. 5^(D，理論等電點為5. 10。根據(jù)棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因的核苷酸序列，設(shè)計合成引物，其上游引物 APXl的序列為5' -TGAATTCAGATGGGGAAGTGCTAC-3',包含^boTP I限制性酶切位點(即下劃線部分)，三個保護堿基T和AG，以及棗樹抗壞血酸過氧化物酶Z力/沈基因的起始密碼子 ATG (即方框所示部分)；下游引物APX2的序列為5' -ATCCCGGGTAGCATCAGCAAATC-3'，包含 Sma I限制性酶切位點(即下劃線部分)，三個保護堿基AT和T。通過PCR技術(shù)成功亞克隆出心4/沈基因的目的片段，將得到的心4/沈目的基因片段經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶feoT I和 Sma I修飾后連接到植物表達載體pES (K)-LNY上，經(jīng)含卡那霉素的LB平板抗性篩選、PCR 鑒定、酶切鑒定、測序證明攜帶目的基因的植物表達載體PESi(K)-LNY- ZjAPX構(gòu)建成功。通過凍融法將攜帶目的基因的植物表達載體pES (K)-LNY- ZjAPX轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404 的感受態(tài)細胞中，經(jīng)含卡那霉素的YEB平板抗性篩選、PCR鑒定證明工程菌pES (K)-LNY-ZjAPX- L構(gòu)建成功。農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)含卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)基篩選獲得含有目的基因ZjAPX的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株Ttl代，經(jīng)PCR鑒定目的基因證實ZjAPX 成功轉(zhuǎn)入擬南芥。用含有0. 1 M NaCl的1/2MS培養(yǎng)基處理轉(zhuǎn)基因擬南芥，對轉(zhuǎn)基因植株及其T1代進行耐鹽性評價，觀察其生長狀況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫處理下長勢和根系明顯好于野生擬南芥。此外，為了深入研究棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因Z力/沈及其編碼蛋白ZjAPX，本發(fā)明構(gòu)建了重組原核表達載體pGEX-4T-2-ZjAPX，實現(xiàn)其在大腸桿菌BL21 (DE3)中的原核表達，為該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控等方面研究提供一定的實驗數(shù)據(jù)。本發(fā)明的有益效果在于首次分離出棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因^力/沈，該基因可作為目的基因轉(zhuǎn)入植物，以提高植物的抗逆性，特別是耐鹽性，對于改良植物品種具有重要的現(xiàn)實意義。對于具有優(yōu)良抗性的棗樹的抗逆機制的深入研究，有助于明確逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達、功能及調(diào)控，為進一步充分利用這些優(yōu)良抗性基因來提高植物的抗逆性提供一定的實驗數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。


圖1為ZjAPX與已知類基因的氨基酸系統(tǒng)進化樹聚類分析； 圖2為目的基因ZjAPX的PCR擴增結(jié)果圖3為重組質(zhì)粒pES (K)-LNY-ZjAPX的PCR鑒定圖譜； 圖4為工程菌pEZR(K) -LNY-ZjAPX-L的PCR鑒定圖譜； 圖5為轉(zhuǎn)Z力/沈基因擬南芥的卡那抗性篩選平板；圖6為轉(zhuǎn)心4/沈基因擬南芥植株；
圖7為轉(zhuǎn)Z力/沈基因擬南芥植株的PCR檢測結(jié)果圖8為經(jīng)0. 1 M NaCl處理30天的轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥；
圖9為經(jīng)0. 1 M NaCl處理40天的轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥；
圖10為原核表達載體pGEX-4T-2-ZjAPX的PCR鑒定圖譜；
圖11為原核表達載體pGEX-4T-2-ZjAPX飽BernH I和Sma I雙酶切鑒定圖譜；
圖12為pGEX-4T-2-ZjAPX-B經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。其中，圖2、3、4、7、10、11 中的 M 為 DL 2000 Marker，條帶依次為 2000bp、lOOObp、 750bp、500bp、250bp、IOObp。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步的闡述。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1 棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因ZjAPX的獲得
春天采集壺瓶棗樹(Ziziphus jujuba Mill. HUPING)長度約2mm的結(jié)果枝(即棗吊)， 利用CTAB法提取總RNA，根據(jù)mRNA純化試劑盒(購自美國!Iomega，貨號Z5200)方法從提取到的總RNA中分離純化mRNA，利用cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(購自美國Invitrogen，貨號1擬48-039)構(gòu)建cDNA文庫。將文庫cDNA與克隆載體pSPORTl連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 E. coli DH5a感受態(tài)細胞，涂布于含有氨芐青霉素抗性的LB平板于37°C培養(yǎng)過夜，藍白斑篩選重組質(zhì)粒，隨機挑選部分陽性質(zhì)粒，將經(jīng)過酶切鑒定證明有插入片段的質(zhì)粒，委托上海生工測序。將測序結(jié)果利用NCBI (www. ncbi. nlm. nih. gov/)在線分析軟件進行Blast比對分析，結(jié)果表明其中的一個cDNA序列為棗樹的抗壞血酸過氧化物酶同源基因全序列，將其命名為 ZjAPX (lizyphus J_ujube Millascorbate peroxidase)0 生物信息學(xué)分析結(jié)果表明么力/沈基因的cDNA序列全長為75!3bp，編碼251個氨基酸，其中包含有32個酸性氨基酸，20個堿性氨基酸；用ProtParam計算蛋白質(zhì)的相對分子量為62. 55 KD，理論等電點為 5. 10，不穩(wěn)定指數(shù)為57. 06，屬于不穩(wěn)定蛋白；用TMHM-M-2. 0進行蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)分析表明此蛋白不是跨膜蛋白，屬于膜外蛋白，連接至http //www. expasy. org/prosite進行編碼序列的保守分析，表明該序列編碼的蛋白質(zhì)屬于典型的植物亞鐵血紅素過氧化物酶家族蛋白，序列中包含一個過氧化物酶的活性部位“APimLRLaWHSA”和一個過氧化物酶亞鐵血紅素配體信號“DIVALSGGHTL” ；通過在NCBI數(shù)據(jù)庫Blast X搜索進行序列同源性分析表明，該編碼蛋白與目前已知的其它植物的抗壞血酸過氧化物酶APX具有極高的同源性， 與可可樹APX、陸地棉APX的同源性為93%，與玉米APX的同源性為92%，與擬南芥APX的同源性為86% ；用DNAMar對其氨基酸序列與其它屬種的抗壞血酸過氧化物酶APX構(gòu)建進化樹，如圖1所示，11個來源相同物種的APX被聚為7個類群，棗(Ziziphus jujube)、擬南芥 (Arabidopsis thaliana)單獨聚為一類，柑橘(Citrus maxima)、番薯(Ipomoea batatas) 聚為一jfl^L(Nicotiana tabacum)>5nM (Solanum lycopersicum) M^J一HPfI^ (Hevea brasiliensis)、云杉(Picea sitchensis)聚為一類，菠菜(Spinacia oleracea)、 玉米(Zea mays)聚為一類，同時又與陸地棉(Gossypium hirsutum)聚為一大類，該聚類分析結(jié)果還表明棗抗壞血酸過氧化物酶APX和其他物種的親緣關(guān)系都較遠，但其蛋白相似性極高。上述生物信息學(xué)分析包括核苷酸序列分析、氨基酸序列分析、序列相似性分析、進化樹聚類分析均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)手段，通過多重比對分析證實本發(fā)明克隆得到的核苷酸序列即為棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因的序列，其編碼的氨基酸序列即為其編碼蛋白棗樹抗壞血酸過氧化物酶的序列，而且該蛋白質(zhì)功能被唯一確定。根據(jù)上述獲得的棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因的精確核苷酸序列設(shè)計引物并委托上海生工合成，用于APX基因的亞克隆。上游引物APXl的序列為 5' -TGAATTCAGATGGGGAAGTGCTAC-3'，包含feoT I限制性酶切位點(即下劃線部分)，三個保護堿基T和AG，以及棗樹抗壞血酸過氧化物酶Z力/沈基因的起始密碼子ATG (即方框所示部分);下游引物APX2的序列為5' -ATCCCGGGTAGCATCAGCAAATC-3'，包含I限制性酶切位點(即下劃線部分)，三個保護堿基AT和T。以克隆載體pSPORTl-ZjAPX攜帶的為模板，以APXl和APX2為引物，擴增獲得含完整開放閱讀框的棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因。PCR反應(yīng)體系為10XPCR buffer (含 Mg2+) 5μ1，dNTP 0. 5μ1，上下游引物(20pmol/L)各 2. 5μ1，rTaq 聚合酶 0. 8μ1，模板 DNA (5. 2μδ/μ1) 2μ1，滅菌超純水36. 7μ1，總體積50μ1。Ρα 擴增條件為:95°C預(yù)變性5min，94°C 變性lmin、M°C退火lmin、72°C延伸2min共40個循環(huán)，最后72°C延伸5min。取5ml PCR 產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳分析確認目的片段大小。按照DNA純化試劑盒操作，純化PCR產(chǎn)物。實施例2么力/沈基因植物表達載體的構(gòu)建 1.實驗材料
1. 1載體和菌株
植物表達載體pES (K)-LNY、大腸桿菌cWi)DH5a、攜帶基因的重組質(zhì)粒 pSPORTl- ZjAPX均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心植物細胞與胚胎學(xué)研究室保存。1.2試劑和培養(yǎng)基
限制性內(nèi)切酶I , Sma I , Hind 111、BamH I、DNA Ligation Kit、DL2000 DNA Marker、瓊脂糖凝膠DNA Fragment Purification試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司?？敲顾?100mg/ml)
酚氯仿異戊醇(V V V= 25 24 1)
葡萄糖溶液(IM)
EDTA (0. 5M, ρΗ8· 0)
10%SDS(pH7. 2)
NaOH(2M)
Tris-HCl(1M, ρΗ8· 0) 醋酸鈉(3Μ, ρΗ5· 2)
TE 溶液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, ρΗ8· 0) 10ΧΤΒΕ電泳緩沖液 硼酸55. 2g/L
Tris108g/LEDTA (0. 5 M, LB培養(yǎng)基( 蛋白胨
，ρΗ8· 0) 40ml/L (固體培養(yǎng)基加瓊脂15g/L)
10g/L 5g/L 10g/L
酵母提取物 NaCl
實驗方法
2.1大腸桿菌(五cWi) DH5 α感受態(tài)細胞的制作
用CaCl2法制備大腸桿菌(五C07i)DH5a感受態(tài)細胞，具體方法見精編分子生物學(xué)實驗指南。2. 2植物表達載體pE^ (K) -LNY和重組質(zhì)粒pSP0RTl_Z jAPX的小量制備 PSPORTl-ZjAPX質(zhì)粒的五coli DH5 α菌液用2ml的LB液體培養(yǎng)基加1 μ 1氨芐青霉素
(100mg/ml)接菌后37°C過夜培養(yǎng)所得。pES (K)-LNY質(zhì)粒的五cWi DH5 α菌液用2ml的 LB液體培養(yǎng)基加1 μ 1卡那霉素(100mg/ml)接菌后37°C過夜培養(yǎng)所得。堿裂解法快速提取質(zhì)粒pE^(K) -LNY和pSPORTl-ZjAPX，具體步驟見精編分子生物學(xué)實驗指南。將干燥的質(zhì)粒溶于20 μ 1 TE中，_20°C保存?zhèn)溆谩?. 3目的基因ZjAPX序列的擴增
以克隆載體pSPORTl-ZjAPX為模板，用設(shè)計的特異性引物APXl與APX2進行PCR擴增以獲得含完整開放閱讀框的棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因。首先利用梯度PCR技術(shù)設(shè)置不同的退火溫度，找出最佳退火溫度為M°C，然后按照下述條件作PCR擴增。PCR 擴增 ZjM/沈基因，反應(yīng)體系為=IOXPCR buffer 5μ1 (含 Mg2+)，dNTP 0. 5μ1，上下游引物(20pmol/L)各2. 5μ1，rTaq聚合酶0. 8μ1，模板DNA (5. 2μβ/μ1) 2μ1，滅菌超純水 36. 7μ1，總體積50μ1 ；擴增條件為95°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin、54°C退火Imin,72°C 延伸2min共40個循環(huán)，最后72°C延伸5min。2. 4目的基因ZjAPX片段和載體pEZR⑷-LNY片段的制備
PCR擴增獲得的目的基因片段兩端及載體pES (K)-LNY的多克隆位點都具有 EcoR I和I限制性酶切位點，利用I和I分別雙酶切目的基因的PCR 產(chǎn)物及載體PES (K) -LNY,使其具有相同的粘性末端，為連接做好準備。目的基因ZjAPX的PCR產(chǎn)物的酶切反應(yīng)體系 10XT buffer5μ1
0. 1% BSA5μ1
EcoR I μ
Sma I μ
PCR 產(chǎn)物10μ1
S. D. W28μ1
總體積50μ1
PCR產(chǎn)物的體積依據(jù)其濃度而定，最少酶切1 2 Pg的目的基因片段，加超純水至總體積為50 μ 。載體pE^ (K) -LNY的酶切反應(yīng)體系IOXT buffer5μ1
0. 1% BSA5μ1
EcoR I μ
Sma I μ
載體5μ1
S. D. W33μ1
總體積50μ1
酶切后分別取5ml雙酶切產(chǎn)物，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，確認片段大小與預(yù)期相吻合。按照瓊脂糖凝膠DNA Fragment Purification試劑盒說明進行操作，純化經(jīng)雙酶切后的目的基因片段和載體片段。2. 5酶切產(chǎn)物的連接
用T4 DNA連接酶將純化后的pES (K)-LNY載體與基因片段進行連接。將載體 pEZR(K) -LNY的DNA片段與目的基因ZjAPX的DNA片段混合制備成體積為5 μ 1左右的DNA 溶液(載體DNA和目的基因DNA的摩爾數(shù)比一般為1 :5)，向上述DNA溶液中加入等體積的 DNA Ligation Kit中的Solution I，充分混勻。連接反應(yīng)體系總體積為10 μ 1左右，16°C 反應(yīng)過夜。2. 6連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
將連接產(chǎn)物加入到ΙΟΟμΙ的大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰上放置30min。 放入預(yù)加溫到42°C的循環(huán)水浴中熱休克90s，快速將EP管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻3 5min。加400 μ 1的LB培養(yǎng)基，將EP管轉(zhuǎn)移到37°C的搖床上，溫浴40min使細菌復(fù)蘇，復(fù)蘇期應(yīng)溫和地搖動細胞(轉(zhuǎn)速低于225r/min)。取適當體積的轉(zhuǎn)化菌液轉(zhuǎn)移到含卡那霉素的 LB平板，涂勻。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37°C靜置培養(yǎng)過夜。2. 7轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定 (I)PCR鑒定
待轉(zhuǎn)化菌在含有卡那霉素抗性的LB平板上長出菌落后，用無菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化單菌落至50μ1超純水中，沸水浴5min使菌裂解。取 μ 裂解產(chǎn)物作為模板進行PCR陽性鑒定， 其反應(yīng)體系為10XPCR buffer 1. 5μ1 (含 Mg2+)，dNTP 0. 2μ1，上下游引物(20pmol/L)各 0. 5Pl，rTaq聚合酶0. μ ，模板DNA(2. 6μβ/μ1) μ1，加滅菌超純水11. 2μ1至總體積為 μ ； 擴增條件同前。將PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化菌劃線培養(yǎng)。(2)酶切鑒定
將PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化菌用堿裂減法提取質(zhì)粒DNA后，用歷·/^ III稱BamH I對重組質(zhì)粒pE^ (K) -LNY-ZjAPX進行雙酶切鑒定。重組質(zhì)粒pEZR(K) -LNY-ZjAPX的Hind III和BamH I雙酶切反應(yīng)體系 10XK buffer μ
Hind III0. 5μ1
BamH I0. 5μ1
重組質(zhì)粒 μ
S. D. W7μ1總體積ιομ
瓊脂糖凝膠電泳酶切反應(yīng)液，驗證酶切片段的大小，保存攜帶目的片段的陽性菌落，并將陽性菌株送往上海生工測序鑒定。3. 1 ZjAPX cDNA 的擴增
利用設(shè)計的特異性上下游引物APXl和APX2進行PCR擴增，產(chǎn)物在1. 0%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色后在紫外燈下觀測到一條約750bp的條帶，如圖2所示，與所設(shè)計的擴增目的片段大小吻合。圖中M :DL2000 DNA Marker ；1 :PCR產(chǎn)物。目的基因片段和載體片段的制備
將目的基因棗樹PCR產(chǎn)物和pES (K)-LNY質(zhì)粒分別用I和5 I進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，純化目的基因片段與載體片段，用于連接。重組質(zhì)粒的鑒定
從含有卡那霉素的LB平板上挑取陽性單菌落進行PCR鑒定，如圖3所示，圖中M DL2000 DNA Marker ；1、2、3、4 陽性克隆PCR產(chǎn)物，大小為750bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符，初步推斷重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，瓊脂糖凝膠電泳檢測重組質(zhì)粒的大小約為12.41Λ。測序結(jié)果表明陽性轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒確實含有目的片段，且讀碼框正確，重組質(zhì)粒PESi(K)-LNY-ZjAPX構(gòu)建成功。實施例3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)Z力/沈基因轉(zhuǎn)化擬南芥
1.實驗材料 1.1植物材料
野生型擬南芥種子由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心植物細胞與胚胎學(xué)研究室提供，培養(yǎng)基質(zhì)購自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所。1.2載體和菌株
植物表達載體pES (K)-LNY-ZjAPX、根癌農(nóng)桿菌LBA4404均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心植物細胞與胚胎學(xué)研究室保存。1. 3試劑和培養(yǎng)基
卡那霉素購自上海生工，YEB、1/2MS培養(yǎng)基中所用試劑均購自天津天大化工。YEB 培養(yǎng)基
蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏l(xiāng)g/L，蔗糖5g/L，硫酸鎂0. 5g/L。注固體培養(yǎng)基需加終濃度為1. 0%的瓊脂粉。1/2 MS 培養(yǎng)基
按照配制MS培養(yǎng)基的方法來配制1/2 MS培養(yǎng)基，大量元素、微量元素、有機元素、鐵鹽的量各減半，蔗糖30g/L，瓊脂粉6g/L。2.實驗方法
2.1擬南芥的培養(yǎng)
將擬南芥種子先在95%乙醇浸泡30 60s ；再轉(zhuǎn)入2. 65%次氯酸鈉滅菌5min，其間上下顛倒洗，5000rpm離心^iin ；滅菌水洗三次；然后將種子懸浮于0. 1%的瓊脂粉溶膠中；用槍頭吸取懸浮液將種子點播于1/2 MS固體培養(yǎng)基上，封口 ；4°C黑暗春化2d后，將擬南芥種子在22°C，1 / 光周期條件下進行培養(yǎng)；當擬南芥長出2片真葉時，移栽到營養(yǎng)基質(zhì)中繼
續(xù)培養(yǎng)。
2. 2根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞的制作
制備根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞的具體步驟見精編分子生物學(xué)實驗指南。2. 3 工程菌 pEZR (K) -LNY-ZjAPX-L 的構(gòu)建及篩選
通過凍融法將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒載體pESUK) -LNY-ZjAPX轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，然后提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA，并通過PCR鑒定重組質(zhì)粒載體是否轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。從培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pESUK)-LNY-ZjAPX的篩選平板上隨機挑選生長良好的若干單菌落，各取二分之一菌落至50μ1超純水中，沸水浴5min使菌裂解，取 μ 作為模板進行PCR鑒定。將鑒定正確的陽性工程菌重新劃線培養(yǎng)保存以備用。工程菌pEZR (K) -LNY-ZjAPX-L 的培養(yǎng)
挑選鑒定正確的陽性克隆于IOml YEB液體培養(yǎng)基(含終濃度為50 μ g/ml的卡那霉素)過夜培養(yǎng)，6000rpm離心5min收集菌體，用培養(yǎng)基懸浮菌體至OD6tltl值為0. 8左右，用于轉(zhuǎn)化擬南芥植株。2. 5農(nóng)桿菌侵染擬南芥
當擬南芥植株形成花蕾時，即可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。將含有農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化介質(zhì)倒入離心管，將擬南芥植株的花蕾部分浸入轉(zhuǎn)化介質(zhì)3 5 s后，把浸染過的植株放到塑料盤中，暗處放置過夜。在正常條件下，繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株。當擬南芥的角果枯黃、欲開裂時，收獲種子，此為Ttl代種子。
2. 6轉(zhuǎn)Z力基因擬南芥的篩選
將消毒的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的Ttl代種子播種于1/2 MS篩選培養(yǎng)基(含終濃度為 50 μ g/ml的卡那霉素)，4°C黑暗春化2d后置于22°C，l^i/ai光周期條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化成功的擬南芥種子長出來的幼苗生長正常，未轉(zhuǎn)化成功的幼苗葉子發(fā)黃，生長緩慢。當生長正常的擬南芥長出2片真葉時，移栽到培養(yǎng)基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)至角果枯黃、欲開裂，收取T1代種子。2.7轉(zhuǎn)Z力/沈基因擬南芥的脅迫處理
將T1代種子的擬南芥播種，移栽到基質(zhì)中，在16h/ !光周期下培養(yǎng)，并適時澆水，培養(yǎng)至角果枯黃、欲開裂，收取T2代種子；并采取T1葉片提取DNA，用PCR方法進行檢測。將野生型和T2代種子同時播種在含有0. 1 M NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，觀察其生長情況。3.實驗結(jié)果
3. 1農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化結(jié)果
將構(gòu)建好的植物表達載體PE^ (K) -LNY-ZjAPX轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，在YEB固體培養(yǎng)基 (含終濃度為50 μ g/ml的卡那霉素)上篩選轉(zhuǎn)化子，從篩選平板上隨機挑選生長良好的若干單菌落，進行PCR檢測，如圖4所示，與預(yù)期結(jié)果相同，表明重組植物表達載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。轉(zhuǎn)Z力/沈基因擬南芥植株的獲得及抗性鑒定
按上述方法侵染擬南芥后，將消毒的轉(zhuǎn)基因擬南芥的Ttl代種子播種于1/2 MS篩選培養(yǎng)基(含終濃度為50 μ g/ml的卡那霉素)，4°C黑暗春化2d后在22°C，l^i/ai光周期下培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化成功的擬南芥幼苗具有抗卡那霉素的特性，生長正常，且有真葉形成；而未轉(zhuǎn)化成功的擬南芥幼苗不具有抗卡那霉素，植株矮小，葉子發(fā)黃，也沒有真葉形成，如圖5 所示。
將具有抗性的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株移入培養(yǎng)基質(zhì)，在16h / 8h光周期下培養(yǎng)，其生長狀況良好，如圖6所示，培養(yǎng)至植株角果枯黃、欲開裂時，收獲其種子。PCR檢測結(jié)果如圖7所示，證明2、3、4、6、8號均為轉(zhuǎn)ZjM/沈株系。3.3轉(zhuǎn)Z力/沈基因擬南芥植株的耐鹽性實驗
選取轉(zhuǎn)基因擬南芥種子與野生型擬南芥種子作為對照進行NaCl脅迫處理，處理條件為=NaCl處理為1/2MS培養(yǎng)基中加入0. IM NaCl，對照處理為1/2MS培養(yǎng)基，觀察其生長狀況。實驗結(jié)果表明，鹽脅迫處理30天的轉(zhuǎn)基因擬南芥均比野生型擬南芥長勢好，表現(xiàn)出明顯的耐鹽性，如圖8所示；處理40天后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的植株明顯比野生型植株生長健壯， 根系發(fā)達，如圖9所示。實施例4 ,ZjAPX的原核表達 1.實驗材料
1. 1載體和菌株
棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因cDNA序列從本課題組構(gòu)建的壺瓶棗(Z/ziMM jujuba Mill. HUPING)結(jié)果枝cDNA文庫中篩選獲得，克隆在pSPORTl載體上；克隆載體pSPORTl、 原核表達載體PGEX-4T-2、大腸桿菌BL21 (DE3)均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心植物細胞與胚胎學(xué)研究室保存。1. 2試劑和儀器
瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒QIAquick 購自QIAGEN公司；限制性內(nèi)切酶·// I、 Sma I、T4 DNA連接酶、DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司；卡那霉素購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；IPTG、丙烯酰胺等化學(xué)試劑購自上海生物技術(shù)工程有限公司；電泳儀、恒溫金屬浴、恒溫培養(yǎng)箱、照相機等試驗設(shè)備均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心植物細胞與胚胎學(xué)研究室提供。2.實驗方法
2.1 PCR引物的設(shè)計與合成
_根據(jù)棗樹抗壞血酸過氧化物酶cDNA序列，選擇其中編碼216個氨基酸的681bp核苷酸序列，設(shè)計特異性引物，上游引物^添加/^ ^ I酶切位點，下游引物K2添加5 I酶切位點，引物序列如下
Kl 5' -ATGGATCCATGCTACGCCTTGCATG-3'； K2 5'-ATCCCGGGTTAAGCATCAGCAAATC-3'； 以上引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。2.2目的基因序列的擴增
以克隆載體PSPORTl (攜帶目的片段)為模板，用設(shè)計的特異性引物Kl與K2進行PCR 擴增。首先利用梯度PCR技術(shù)設(shè)置不同的溫度，找出最佳退火溫度為58°C。PCR反應(yīng)體系 % =IOXPCR buffer 5μ1 (含 Mg2+)，dNTP μ ，上下游引物 Kl 與 Κ2 (20 pmol/L)各 μ ， rTaq聚合酶0. 3μ1，模板DNA (5. 2 μδ/μ1) μ1，滅菌超純水40. 7μ1，總體積50μ1 ；擴增條件為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、58°C退火30s、72°C延伸Imin共30個循環(huán)，最后72°C 延伸lOmin。2. 3重組原核表達載體的構(gòu)建
獲得PCR產(chǎn)物后，經(jīng)瓊脂糖電泳驗證片段大小，然后用I和5 I雙酶切目的基因片段及PGEX-4T-2載體，再用QIAquick 凝膠回收盒對雙酶切產(chǎn)物進行純化。在T4 DNA連接酶的作用下，將目的基因定向克隆到pGEX-4T-2載體的及 /7 I和5 I酶切位點， 然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中。2. 4重組原核表達載體的鑒定
根據(jù)pGEX-4T-2載體攜帶有氨芐青霉素抗性基因的特征，將轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞涂在含有氨芐青霉素的平板上，挑取抗性單菌落進行PCR擴增鑒定，反應(yīng)條件和反應(yīng)程序同前。瓊脂糖凝膠電泳選擇陽性菌落，提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶 BeimH LSmei I對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。將陽性菌株送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，驗證重組質(zhì)粒中目的基因的插入方向及讀碼框的正確性。2. 5原核表達
2. 5. 1大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)的制備
用CaCl2法制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，具體方法見精編分子生物學(xué)實驗指南。分裝成100μ 1或200μ 1小份，液氮中冰凍，-70°C貯存?zhèn)溆谩?. 5. 2質(zhì)粒提取
堿裂減法提取連接成功的原核表達質(zhì)粒。2. 5. 3 轉(zhuǎn)化
將上述原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入其表達載體的大腸桿菌BL21(DE!3)感受態(tài)中，具體步驟為 (1)取-70°C凍存或者新鮮制備的100μ 1的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中， 每管加原核表達質(zhì)粒DNA (體積< 10 μ 1，DNA ( 50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置 30 min。(2)將離心管放到預(yù)加溫到42°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90 s，不要搖動試管。(3)快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻1 anin。(4)每離心管加400 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37°C，然后將離心管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45min使細菌復(fù)蘇。(5)取部分已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布在含終濃度為50μ g/ml的氨芐青霉素的LB 平板培養(yǎng)基上。(6)倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12 16h后可出現(xiàn)菌落。2. 5. 4誘導(dǎo)表達
(1)取一定容量的錐形瓶，分別加入5ml LB液體培養(yǎng)基和2. 5 μ 1氨芐青霉素(終濃度為50μ g /ml)，分別從前一天搖好的菌液中取50μ 1接入錐形瓶中，并以空質(zhì)粒作為對照， 37°C搖床振搖至0D_值為0. 5。(2)取與上述錐形瓶等量的試管，分別加入菌液anl，每個試管中加20 μ 1 IPTG (IPTG終濃度為ImM)誘導(dǎo)，37°C搖床振搖4h。(3)將菌液倒入2. 0的管中，12000 rpm離心3min。(4)去上清液，加上樣buffer 200 μ 1，加β -巰基乙醇20 μ 1，重懸沉淀后煮沸 IOmin0(5 )放入冰盒冷卻，40C保存，SDS-PAGE凝膠電泳備用。
2.6 SDS-PAGE 凝膠電泳
(1)配置30%丙烯酰胺分離膠，向裝配好的兩塊玻璃板之間灌制分離膠，至距離玻璃板上端3cm左右處，用ddH20封膠以使膠面水平。(2) 20min左右待分離膠凝固后倒去上層ddH20，用濾紙將殘留水分吸干。(3)配制5%的濃縮膠，灌注至距離玻璃板上端2mm左右處。(4)插入梳子，待濃縮膠凝固后拔出梳子。(5)各取20 μ 1樣品點樣，蛋白Marker上樣5-8 μ L·(6)低壓70V電泳至樣品到達分離膠內(nèi)。(7)高壓150V電泳至距離底端Icm處。(8)固定液固定1. ^！。(9)染色液染色池。( 10)置于搖床脫色過夜。3.實驗結(jié)果
3. 1 ZjAPX cDNA 的擴增
利用設(shè)計的特異性上下游引物Kl與K2進行PCR擴增后，產(chǎn)物在1. 0%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色后在紫外燈下觀測到一條在750bp和500bp之間，靠近750bp的條帶，與所設(shè)計的擴增目的片段大小吻合。3. 2重組原核表達載體的構(gòu)建
利用特異性引物Kl和K2進行PCR擴增，將產(chǎn)物和PGEX-4T-2質(zhì)粒用及^/7 I和5 I 雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物約為750bp，pGEX-4T-2片段約為4. 9kb,與預(yù)期結(jié)果相符。分別純化目的基因片段與載體片段，進行連接。3. 3重組原核表達質(zhì)粒鑒定
將連接產(chǎn)物涂于含有氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上，37 °C過夜培養(yǎng)后挑取陽性單菌落進行PCR鑒定，結(jié)果如圖10所示；對證明有目的片段陽性菌落提取質(zhì)粒，進行限制性內(nèi)切酶 BamH I和I雙酶切鑒定，結(jié)果如圖11所示，雙酶切片段約750bp，與預(yù)期結(jié)果相符，初步推斷重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，且重組質(zhì)粒的大小約為5. 6kb左右。測序結(jié)果表明該轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒中確實含有目的片段，且讀碼框正確，重組原核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。3. 4誘導(dǎo)原核表達
工程菌pGEX-4T-2-ZjAPX-B，在37°C條件下，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4h后取樣，SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖12所示，觀察到含有質(zhì)粒pGEX-4T-2-ZjAPX的大腸桿菌BL21 (DE3)在IPTG誘導(dǎo)的條件下，與對照空菌體PGEX-4T-2-B相比在大約50KD處產(chǎn)生一條特異性蛋白條帶，GST大小約為^KD,目的蛋白ZjAPX大小為23. 76KD，故融合蛋白大小約為49. 76KD，表明誘導(dǎo)棗樹抗壞血酸過氧化物酶表達成功。
權(quán)利要求
1.一種棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因，其特征在于具有如序列表SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
2.由權(quán)利要求1所述的一種棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因編碼的蛋白，其特征在于 具有如序列表SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一種棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因及其在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因，其核苷酸序列及編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。本發(fā)明獲得棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因，構(gòu)建植物表達載體，成功轉(zhuǎn)入擬南芥植株，對其進行耐鹽性評價，證實其可用于提高植物的耐鹽性。此外，本發(fā)明構(gòu)建的原核表達載體，實現(xiàn)其在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達。本發(fā)明首次分離出棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因ZjAPX，該基因可作為目的基因轉(zhuǎn)入植物，以提高植物的抗逆性，特別是耐鹽性，對于改良植物品種具有指導(dǎo)意義，為充分利用棗樹的優(yōu)良抗性基因以提高植物的抗逆性提供實驗數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/53GK102161996SQ201110047249
公開日2011年8月24日 申請日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月1日
發(fā)明者孟玉平, 曹秋芬, 王振華, 郝子琪 申請人:山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心, 洪洞縣維民生生物科技有限公司