專利名稱：一種α-半乳糖苷酶及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種α -半乳糖苷酶及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
α -半乳糖苷酶(alpha-galactosidase, EC 3. 2. 1. 22)，也叫蜜二糖酶，是一種夕卜切糖苷酶，它可作用于α-半乳糖苷鍵，催化α-半乳糖苷類的寡糖以及含α-半乳糖苷鍵的多聚糖。α-半乳糖苷廣泛分布于植物、動物和微生物體內(nèi)。α -半乳糖苷酶作為一種新型的酶制劑，在飼料工業(yè)，食品工業(yè)，制糖工業(yè)，造紙工業(yè)以及醫(yī)學(xué)界都發(fā)揮著重要的作用。不同的領(lǐng)域PH作用環(huán)境不同，對α-半乳糖苷酶的特點要求也就不同。例如，酸性α-半乳糖苷酶目前不適于應(yīng)用于豆奶加工中，因為豆奶的PH 約為6. 2-6. 4，而酸性α -半乳糖苷酶的ρΗ在4. 0-4. 5，易造成豆奶中蛋白沉降，奶制品口感偏酸；甜菜糖生產(chǎn)中甜菜糖蜜的PH需用硫磺酸調(diào)至5. 2，才能使酸性α -半乳糖苷酶發(fā)揮作用；在醫(yī)學(xué)研究中，由B型血到0型血的血液轉(zhuǎn)換，需在中性及堿性條件下作用，酸性條件下會使血細(xì)胞不穩(wěn)定，這是因為血液的PH值在7. 3，中性偏堿性的環(huán)境下，堿性的α -半乳糖苷酶會發(fā)揮明顯的優(yōu)勢。目前酶制劑工業(yè)中主要采用微生物作為主要酶源。微生物特別是絲狀真菌，因其產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶產(chǎn)量相對較高，可胞外分泌、酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良等特點而受到研究者的青睞。目前，α-半乳糖苷酶主要是利用原菌株的發(fā)酵生產(chǎn)，產(chǎn)量較低，成本較高。α-半乳糖苷酶的基因工程菌株目前報道也較少，主要還是在實驗室研究階段。因此，不斷提高菌種產(chǎn)酶水平，研究α-半乳糖苷酶合成的調(diào)控機制、酶基因的克隆和異源高效表達(dá)，進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用是今后發(fā)展的主要方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種α-半乳糖苷酶及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，來自菌株WD(Alternaria sp. )No. 4529，命名為LGAL蛋白， 是如下(a)或(b)或(c)(a)由序列表中序列1自N末端第20至739位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的LGAL蛋白便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)或(c)(a)由序列表中序列1自N末端第20至739位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)至5)中任一所述的DNA 分子1)序列表中序列2自5’端第58至2217位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列3所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼具有α_半乳糖苷酶活性蛋白的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有α_半乳糖苷酶活性蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在原核表達(dá)載體pET-30a(+)的多克隆位點插入序列表的序列2所示的DNA得到的重組質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求1所述蛋白，或權(quán)利要求2或3所述基因，或權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體，或權(quán)利要求4所述表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在降解對硝基酚-α -D-吡喃半乳糖中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述蛋白，或權(quán)利要求2或3所述基因，或權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體，或權(quán)利要求4所述表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在生產(chǎn)對硝基酚中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述蛋白，或權(quán)利要求2或3所述基因，或權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體，或權(quán)利要求4所述表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在以對硝基酚-α -D-吡喃半乳糖為底物生產(chǎn)對硝基酚中的應(yīng)用。
9.鏈格孢霉菌(Alternariasp.)菌株WD，其保藏編號為CGMCC No. 4529。
10.鏈格孢霉菌(Alternariasp.)菌株WD CGMCC No. 45 在制備權(quán)利要求1所述蛋白和/或權(quán)利要求2或3所述基因中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種α-半乳糖苷酶及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的α-半乳糖苷酶是如下(a)或(b)或(c)(a)由序列表中序列1自N末端第20至739位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明為今后的高效表達(dá)生物反應(yīng)器的建立提供技術(shù)參數(shù)，使其應(yīng)用于不同的工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，本發(fā)明豐富了蛋白來源，該蛋白與已報道的蛋白氨基酸序列一致性低，為α-半乳糖苷酶的分類學(xué)提供了新的素材。
文檔編號C12R1/645GK102181413SQ20111004991
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者李卓夫, 楊祿良, 段文娟, 王海燕, 謝寧 申請人:北京挑戰(zhàn)農(nóng)業(yè)科技有限公司