專利名稱：用于檢測甲基化dna的試劑盒和方法
用于檢測甲基化DNA的試劑盒和方法 本申請是申請日為2005年11月觀日、發(fā)明名稱為“用于檢測甲基化DNA的試劑盒和方法”的中國專利申請200580047184. 6 (國際申請?zhí)朠CT/EP2005/012705)的分案申請。本發(fā)明涉及檢測甲基化DNA的體外方法，其包括(a)用能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽包被容器；(b)將所述多肽與含有甲基化和/或未甲基化的DNA的樣品接觸；和(c)檢測所述多肽與甲基化DNA的結(jié)合。在優(yōu)選實施方案中，所述方法還包括步驟(d)通過測序分析所檢測的甲基化DNA。本發(fā)明的另一方面是用于根據(jù)本發(fā)明的方法檢測甲基化DNA的試劑盒，其包含(a)能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽；(b)可以用所述多肽包被的容器；(c)包被所述容器的手段；和(d)檢測甲基化DNA的手段。產(chǎn)生所有活的生物的細胞的信息包含在它們的DNA中。DNA由簡寫為G、A、T和C 的四種堿基組成并且像非常長的梯子一樣構(gòu)造，這些字母對組成梯子的每個“橫檔”。字母 G與C配對，A與T配對。這些對的字符串將信息像編碼的信息一樣儲存，組成分組為區(qū)域的特定分子的信息稱作基因。二倍體動物的每個細胞含有每個基因的兩個拷貝，每個基因的一個拷貝來自母親并且一個拷貝來自父親。(該規(guī)則的唯一例外是染色體上決定生物發(fā)育成“雄性”還是“雌性”的基因)。DNA甲基化和基因調(diào)節(jié)除了“拼出”我們的基因組的四種堿基-腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶之外， 還存在第五種堿基，其通過復(fù)制后DNA的修飾產(chǎn)生。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)可以催化甲基從甲基供體S-腺苷甲硫氨酸向胞嘧啶環(huán)的轉(zhuǎn)移，并從而產(chǎn)生堿基5-甲基胞嘧啶。特定胞嘧啶殘基在哺乳動物中被修飾，所述胞嘧啶殘基在DNA序列中鳥嘌呤殘基之前(CpG 二核苷酸)(Singal，Blood 93 (1999)，4059-4070) ；Robertson, Nat. Rev. Genet. 1 (2000)， 11-19 ；Ng, Curr· Opin. Genet. Dev. (2000)，158-163 ；Razin, EMBOJ. 17(1998)，4905-4908)。 CpG 二核苷酸的甲基化通常與穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)并且可能導(dǎo)致大部分非編碼基因組和潛在可能的序列如轉(zhuǎn)座子、重復(fù)或者病毒插入片段不轉(zhuǎn)錄這一事實。有趣的是CpG 二核苷酸在基因組中分布非常不均(Singal (1999)，在上述引文中，Robertson(2000)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，RaZin(1998)，在上述引文中)?；蚪M的大部分含有比統(tǒng)計預(yù)期的少得多的CpG。這可能是由于5-甲基胞嘧啶比較容易地脫氨成胸苷，其在進化過程中導(dǎo)致CpG 二核苷酸的數(shù)目相對減少。然而，再次，有更多數(shù)目的CpG分布在基因組中，即所稱作的CpG島。這些區(qū)域通常含有轉(zhuǎn)錄起始點和基因啟動子并且通常不甲基化，相比之下，CpG不與CpG島有關(guān)。在正常細胞中，CpG島的甲基化僅在罕見的病例中觀察到，如雌性細胞的χ染色體的第二個拷貝和親本印記基因組的失活(Singal (1999)，在上述引文中， Robertson (2000)，在上述弓丨文中，Ng (2000)，在上述引文中，Razin (1998)，在上述弓丨文中)。DNA甲基化的調(diào)節(jié)僅僅部分理解DNA甲基化模式怎樣在胚胎發(fā)生過程中建立起來和CpG甲基化怎樣在基因組中保持和受到調(diào)節(jié)(Singal (1999)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中， Razin (1998)，在上述引文中)。在哺乳動物物種中，已知有三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTl、3a和3b)，其催化DNA甲基化過程。然而，必須澄清每種DNMT對于CpG甲基化的維持和調(diào)節(jié)所做貢獻的對應(yīng)份額。然而，所有三種酶顯然對于胚胎發(fā)生都是必需的，對應(yīng)的敲除小鼠在子宮內(nèi)(in utero)死亡或者出生后不久死亡(Bestor,Hum. Mol. Genet. 9 (2000), 2395-2402 ； El Osta, Bioessays 25 (2003), 1071-1084) 同時已經(jīng)幾次顯示了 DNA甲基化、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾和某些組蛋白修飾之間的聯(lián)系。DNA的甲基化多數(shù)與組蛋白脫乙酰作用和組蛋白 H3 的賴氨酸 9 殘基的甲基化相關(guān)(Sims，Trends Genet. 19 (2003), 629-639, Fahrner, Cancer Res. 62 (2002)，7213-7218)。因此，DNMT與組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HDACs)或者攜阻抑物復(fù)合體有關(guān)。還幾乎不知道甲基是怎樣從CpG殘基除去的。在增殖細胞中，DNA甲基化還可能在復(fù)制期間被動地發(fā)生。然而，也有在有絲分裂后細胞中DNA甲基化的實例，其可以通過存在活性的迄今還未知的脫甲基酶來解釋(Wolffe，Proc. Natl. Acad. Sci. 96(1999)， 5894-5896)。CpG甲基化和基因沉默啟動子(但不是非調(diào)節(jié)序列)的甲基化與穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄阻抑相關(guān)(Singal (1999)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，RaZin(1998)，在上述引文中)。5-甲基胞嘧啶的阻抑性質(zhì)可以通過兩種機制介導(dǎo)。首先，DNA甲基化可以直接損害轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。第二種可能性(其可能造成最大部分的阻抑)是甲基-CpG-結(jié)合蛋白(MBPs)的募集(Ballestar， Eur. J. Biochem. 268 (2001)，1-6)。MBP 如 MECP2 或 MBD2 (MeCPl 復(fù)合體的組分)伴隨著協(xié)阻抑物復(fù)合體和HDAC，其具有阻抑效果并且負責(zé)轉(zhuǎn)錄因子不能接近的稠密染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(異染色質(zhì))的形成(BallestaH2001)，在上述引文中)。腫瘤發(fā)生中的外遺傳改變正越來越清楚的是腫瘤的形成不僅受到遺傳損傷(例如，突變或者易位)而且受到外遺傳改變的支持。異常的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或者DNA甲基化可以影響癌基因或者腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)并且可以促進腫瘤生長。DNA甲基化的改變包括正常甲基化序列中甲基化的損失(低甲基化)或者正常的未甲基化序列的甲基化(超甲基化)(ROberStOn(2000)，在上述弓丨文中，Herman, N. Engl. J. Med. 349 (2003)，2042-2054 ；Momparler, Oncogene 22 (2003)， 6479-6483 ；Esteller, Science 297(2002)，1807-1808 ；Plass, Hum. Mol. Genetl1(2002), 2479-2488)。低甲基化已經(jīng)對幾乎所有類型的腫瘤描述了總體DNA低甲基化。在腫瘤組織中，5-甲基胞嘧啶的含量與正常組織相比降低，甲基化事件的主要份額在染色體的重復(fù)衛(wèi)星序列或者著絲粒區(qū)域中發(fā)現(xiàn)。然而，在單個情況中，還已經(jīng)描述了原癌基因如bcl-2或c-myc的去甲基化和活化(Costello, J. Med. Genet. 38 (2001)，285-303)。超甲基化或者CpG島CpG島通常發(fā)揮基因調(diào)節(jié)功能。這是為什么甲基化狀態(tài)的改變最直接地與有關(guān)基因座的轉(zhuǎn)錄活性的改變相關(guān)的原因(Robertson(1999) ；Herman(2003) ；Esteller(2002)； Momparler (2003) ；Plass (2002)，所有都在上述引文中)。多數(shù)CpG島以未甲基化形式存在于正常細胞中。然而，在一些情況下，CpG島也可以在基因調(diào)節(jié)事件中被甲基化。雌性細胞的失活的X染色體的CpG島的多數(shù)是例如甲基化的(Goto，Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (1998)，362-378)。CpG島還可以在正常的衰老過程中被甲基化(Issa，Clin.Immunol. 109(2003)，103-108)。尤其在腫瘤中，通常不甲基化的CpG島可以以超甲基化形式存在。在許多情況中， 受到超甲基化影響的基因編碼抵消腫瘤的生長的蛋白質(zhì)，如腫瘤抑制基因。下表列出了基因的實例，可以表明這些基因在腫瘤中通過超甲基化的外遺傳的機制被失活。表腫瘤中超甲基化基因(實例)
權(quán)利要求
1.一種檢測甲基化DNA的體外方法，其包括(a)將能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽附著到固相支持體；(b)將所述多肽與包含甲基化和/或未甲基化的DNA的樣品接觸；和(c)檢測所述多肽與甲基化DNA的結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)包括限制酶消化、亞硫酸氫鹽測序、焦磷酸測序、 DNA印跡或者PCR。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟(c)包括PCR。
4.權(quán)利要求1到3任一項的方法，其還包括步驟(d)分析甲基化的DNA。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述分析所述甲基化的DNA包括測序。
6.權(quán)利要求1到5任一項的方法，其中所述多肽選自(a)屬于甲基-DNA結(jié)合蛋白(MBD)家族的多肽；(b)(a)的多肽的片段，其中所述片段能夠結(jié)合甲基化DNA ；(c)(a)的多肽或者(b)的片段的變體，其中與(a)的多肽或者(b)的片段相比，在所述變體中，一個或多個殘基被替代，并且其中所述變體能夠結(jié)合甲基化DNA ；(d)多肽，其是抗甲基化DNA抗體或者其片段；和(e)多肽，其與(a)到(c)任一項的多肽至少70%同一并且能夠結(jié)合甲基化DNA。
7.權(quán)利要求1到6任一項的方法，其中所述多肽融合到異源多肽。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述異源多肽選自HA-標簽、myc6-標簽、FLAG-標簽、 STREP-標簽、STREP II-標簽、TAP-標簽、HAT-標簽、殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)、麥芽糖-結(jié)合蛋白、His6-標簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標簽、Intein-標簽、鏈霉抗生物素蛋白-結(jié)合蛋白(SBP)標簽和抗體的Fc部分。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述抗甲基化DNA抗體是抗-5-甲基胞嘧啶抗體或者其 Fab、F(ab，)2、Fv 或 scFv 片段。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述固相支持體用所述多肽直接或者間接附著。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品來自受試者。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述受試者被懷疑具有低和/或超甲基化基因座。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述低和/或超甲基化基因座表明癌、腫瘤或者腫瘤轉(zhuǎn)移。
14.用于根據(jù)權(quán)利要求1到13任一項的方法檢測甲基化DNA的試劑盒，其包含(a)能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽；(b)可以用所述多肽附著的固相支持體；和(c)附著所述固相支持體的手段；和(d)檢測甲基化DNA的手段。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測甲基化DNA的體外方法，其包括(a)用能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽包被容器；(b)將所述多肽與含有甲基化和/或未甲基化DNA的樣品接觸；和(c)檢測所述多肽與甲基化DNA的結(jié)合。在優(yōu)選實施方案中，所述方法還包括步驟(d)通過測序分析所檢測的甲基化DNA。本發(fā)明的另一方面是用于根據(jù)本發(fā)明的方法檢測甲基化DNA的試劑盒，其包含(a)能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽；(b)可以用所述多肽包被的容器；(c)包被所述容器的手段；和(d)檢測甲基化DNA的手段。
文檔編號C12Q1/68GK102220412SQ201110052338
公開日2011年10月19日 申請日期2005年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月29日
發(fā)明者M·雷里 申請人:塞昆納姆股份有限公司