專利名稱：一種定向改造動(dòng)物基因組特定基因的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種定向改造動(dòng)物基因組特定基因的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
通過對(duì)基因組進(jìn)行誘變改造研究基因在動(dòng)物的發(fā)生和遺傳中的作用機(jī)制、制造疾病動(dòng)物模型、或創(chuàng)制具優(yōu)良生產(chǎn)性狀的新動(dòng)物品系是當(dāng)代生命科學(xué)研究中采用的基本研究策略。動(dòng)物基因組誘變技術(shù)分為非定向的突變技術(shù)和針對(duì)特定基因的定向誘變技術(shù)。由于研究者可以選擇突變的位點(diǎn)、充分利用已有的動(dòng)物基因組序列信息，定向誘變技術(shù)成為研究者進(jìn)行相關(guān)研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”。定向誘變技術(shù)中的基因打祀(gene targeting)是一項(xiàng)利用同源重組(homologous recombination)原理改造內(nèi)源基因的遺傳學(xué)技術(shù)。但因?yàn)樾枰柚谠谂咛ジ杉?xì)胞(ES)系上的篩選，基因打祀最初只能在小鼠基因組上實(shí)現(xiàn)(Evans and Kaufman, 1981, Nature292 154-156 ；Rossant and McMahon, 1999,Genes & Development 13 :142-145)。最近，大鼠的ES細(xì)胞系也已建立(Buehr et al. ,2008,Cell 135 :1287-1298 ;Li et al. ,2008,Cell135 :1299-1310)，并成功地實(shí)現(xiàn)了基因打靶(Tong et al.，2010，Nature 467:211-213)。由于除小鼠和大鼠外，在其他動(dòng)物上均沒有建成ES細(xì)胞系，對(duì)這些動(dòng)物的基因組上基因進(jìn)行定向改造一直到新近發(fā)明的鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)技術(shù)的出現(xiàn)才有可能得以實(shí)現(xiàn)。ZFN是一種人工融合蛋白，它由位于氨基端的由多個(gè)鋅指基序(motif)而成的識(shí)別特定DNA序列的功能域和位于羧基端的非特異性的Fok I核酸內(nèi)切酶功能域兩部分組成(Kim et al. ,1996，PNAS(USA)93 :1156-1160。每一個(gè)鋅指基序可識(shí)別三個(gè)連續(xù)的核苷酸對(duì)。在切割DNA時(shí)，ZFN通過形成二聚體發(fā)揮功能。其中ZFN的兩個(gè)單體中的多個(gè)鋅指基序分別識(shí)別并特異性結(jié)合特定序列的DNA片段，從而使它們的FokI功能域位于合適的空間位置和取向上，相互結(jié)合并切割DNA，形成DNA雙鏈斷裂(DSB)。受損細(xì)胞然后通過非同源末端接合(NHEJ)對(duì)DSB進(jìn)行易錯(cuò)修復(fù)，結(jié)果導(dǎo)致可能會(huì)在斷裂位點(diǎn)附近引入插入/缺失突變(indel)。通過向胚胎注射特定ZFN，人們已經(jīng)獲得了 NHEJ介導(dǎo)的外源EGFP基因敲除大鼠、白介素2受體ga_a(I12rg)基因敲除大鼠(Geurts etal. , 2009, Science 325 :433 ；Mashimo et al. ,2010, PloS ONE5 e8870)、Mdrla、Jagl和 Notch3 基因敲除小鼠(Carbery et al. ,2010, Genetics 186:451-459)和 ntl、kdr、tfr2> dopamine transporter、telomerase、hiflaa 和 gridlock 等 7 個(gè)基因敲除斑馬魚(Doyon et al. ,2008, Nat. Biotech. 26 :702-708 ；Meng et al. ,2008, Nat. Biotech. 26 695-701 ；Foley et al.，2009，PLoS ONE 4 :e4348)，其敲除基因可穩(wěn)定地進(jìn)行種質(zhì)系遺傳(germline transmission)。利用ZFN進(jìn)行基因組改造的研究在植物(Osakabe et al.,2010，PNAS(USA) 107 :12034-12039)和蠶蛾(Takasu et al. ,2010, Insect Biochemistryand Molecular Biology 40:759-765)中同樣取得了進(jìn)展。細(xì)胞對(duì)由ZFN造成的DSB除可進(jìn)行NHEJ介導(dǎo)的易錯(cuò)修復(fù)外，也可以采用同源重組的高保真性方式修復(fù)?；谶@一原理，新近的報(bào)道證明利用這種對(duì)ZFN的同源重組修復(fù)方式可在小鼠和大鼠基因組上的特定基因位點(diǎn)處引入一小段外源DNA序列甚至于一個(gè)報(bào)告基因(Meyer et al.，2010，PNAS (USA) 107 :15022-15026. Cui et al. ,2011, Nat.Biotech. 29 :64-67)。盡管理論上ZFN技術(shù)可以在任何生物上對(duì)給定的任何一個(gè)基因進(jìn)行定向改造，但是該技術(shù)的主要瓶頸是篩選到一個(gè)能有效切割給定基因的ZFN十分困難，甚至常常做不到。目前已知的鋅指核酸酶構(gòu)建與篩選方法包括模塊組裝(Modular Assembly)(Wright et al. , 2006, Nat. Protoc. I : 1637-1652)、寡聚物化集中工程(OligomerizedPool Engineering, OPEN) (Maeder et al. , 2009, Nat. Protoc. 4 :1471-1501)和背景參照組裝(Context-Dependent Assembly, CoDA)(Sander et al. , 2011, Nat. Meth. 8 :67-69)。模塊組裝方法將位于不同載體上的鋅指編碼序列通過限制性酶切和連接的方法連接為完整的鋅指結(jié)構(gòu)域編碼序列，并連入篩選用表達(dá)載體，與篩選用靶載體共同轉(zhuǎn)入細(xì)菌中，以細(xì)菌 或酵母雙雜交的方式鑒定鋅指結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合能力。在鑒定結(jié)果為有一定的結(jié)合能力后，將鋅指結(jié)構(gòu)域編碼序列與Fok I內(nèi)切功能域編碼序列相重組，形成完整的鋅指核酸酶單體基因。寡聚物化集中工程將位于不同載體上的鋅指編碼序列以重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法連接為完整的鋅指結(jié)構(gòu)域編碼序列，篩選方法與模塊組裝相同。這些篩選方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以針對(duì)一對(duì)具切割功能的鋅指核酸酶二聚體中的一個(gè)鋅指核酸酶的鋅指結(jié)構(gòu)域的識(shí)別能力進(jìn)行篩選，并且OPEN方法適宜進(jìn)行大批量篩選。但其缺點(diǎn)在于按這些方法篩選鋅指結(jié)構(gòu)域費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)一個(gè)給定基因并不總是能夠篩選到有效的鋅指核酸酶，且篩選出來的鋅指結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力與在體內(nèi)該對(duì)鋅指核酸酶能否有效切割靶基因并不完全匹配。同時(shí)，已有的鋅指核酸酶構(gòu)建與篩選系統(tǒng)并不考慮所設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶在體內(nèi)所能獲得的突變模式、以及如何高效地實(shí)現(xiàn)子代的篩選。因此，以基于現(xiàn)有方法設(shè)計(jì)篩選得到的鋅指核酸酶對(duì)基因組進(jìn)行定向誘變，存在有諸如切割誘變效率低下、操作周期長(zhǎng)的缺陷。發(fā)明概述本發(fā)明涉及利用一種定向誘變動(dòng)物基因組的方法。具體來說，本發(fā)明提供一種新的利用鋅指核酸酶定向改造動(dòng)物基因組的特定基因的方法。一方面，本發(fā)明提供一種定向改造動(dòng)物基因組中特定基因的方法，包括根據(jù)目標(biāo)動(dòng)物靶基因區(qū)的序列設(shè)計(jì)特異識(shí)別并切割靶基因的鋅指核酸酶，使用獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證所述鋅指核酸酶對(duì)靶基因的定向切割能力和效率，利用選定的鋅指核酸酶對(duì)目標(biāo)動(dòng)物的胚胎的靶基因進(jìn)行定向遺傳改造并獲得穩(wěn)定的遺傳性狀。進(jìn)一步，本發(fā)明還涉及使用所述的獨(dú)立表達(dá)系統(tǒng)，篩選利用所設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶所獲得的主要的基因突變模式，并利用選定的突變模式高效篩選定向遺傳改造所獲得的子代。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方法，所述的獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)為模式動(dòng)物的卵母細(xì)胞或胚胎。所述的模式動(dòng)物可以為小鼠、大鼠、非洲爪蛙、斑馬魚、青鏘魚、黑腹果蠅和/或秀麗隱桿線蟲等常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施例中，所述的獨(dú)立表達(dá)系統(tǒng)為斑馬魚的胚胎。根據(jù)本發(fā)明的另一方法，所述突變模式的篩選將根據(jù)在所述獨(dú)立表達(dá)系統(tǒng)中獲得的突變模式的出現(xiàn)頻率來決定。例如，選定的主要的突變模式為在所有獲得的突變模式中的出現(xiàn)頻率最高的突變模式。在一個(gè)實(shí)施例中，利用選定的主要的突變模式篩選定向遺傳改造所獲得的子代的方法包括基于所選定的突變模式設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物，然后利用所設(shè)計(jì)的引物，用PCR的方法檢測(cè)所獲得的子代的基因型并篩選出陽性反應(yīng)的子代。在本發(fā)明的另一方法中，本發(fā)明還涉及利用所述方法對(duì)黃顙魚的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因進(jìn)行定向誘變。其中，利用所述方法分析選定的黃顙魚的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的主要基因突變模式包含如SEQ IDNOs. 18-55所示的核苷酸序列的任意一種。另一方面，本發(fā)明還涉及一種人工獲得的特異性識(shí)別并切割黃顙魚肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的鋅指核酸酶或其具有相同或相似功能的衍生物，其所包含的多肽序列從氨基端到羧基端的方向上包 含三個(gè)鋅指基序，分別為SEQ ID NOs. 11、12和13或SEQ ID NOs. 14、15和16。在本發(fā)明中，這些鋅指核酸酶或其衍生物的多肽序列可以包含如SEQID NOs. 2、3、5、或6所示的氨基酸序列。進(jìn)一步，本發(fā)明也提供包含編碼前述鋅指核酸酶或其衍生物的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一應(yīng)用，本發(fā)明還提供包含如SEQ ID NO. 2、3、5、或6所示的氨基酸序列的分離多肽及其功能衍生物，而編碼這些多肽及其衍生物的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列也包含在本發(fā)明中。本發(fā)明還提供重組表達(dá)載體，所述載體由本發(fā)明提供的多核苷酸序列和質(zhì)粒，病毒，或運(yùn)載體構(gòu)建而成。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，利用本發(fā)明可以更有效地進(jìn)行對(duì)動(dòng)物基因組的定向誘變，尤其是對(duì)于所得到的鋅指核酸酶的切割誘變效率低下、操作周期長(zhǎng)、或者需操作的細(xì)胞數(shù)目巨大的情況下，本發(fā)明具有特別的優(yōu)勢(shì)。利用這一方法，本發(fā)明確定了能對(duì)黃顙魚的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因進(jìn)行定向突變的鋅指核酸酶并成功獲得了含有突變的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因
的黃顙魚。


圖Ia和圖Ib分別表示鋅指核酸酶的核苷酸和氨基酸序列，其中下劃線部分為鋅指結(jié)構(gòu)骨架，小寫部分為鋅指基序，斜體部分為接頭，加粗部分為Fok I內(nèi)切功能域。發(fā)明詳述為了本發(fā)明的目的，下列術(shù)語應(yīng)具有下述的含義“核酸”、“核酸序列”或“堿基序列”是指核苷酸，寡核苷酸或多核苷酸及其片段或部分。本發(fā)明的核酸能夠以RNA (例如，mRNA)的形態(tài)、或DNA的形態(tài)(例如，cDNA或基因組DNA)存在。DNA可以是雙鏈，也可以是單鏈。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈(有義鏈)、或非編碼鏈(反義鏈)中任一種。另外，本發(fā)明的多核苷酸也可以在其5’側(cè)或3’側(cè)融合編碼標(biāo)簽標(biāo)記(標(biāo)簽序列或標(biāo)記物序列)的多核苷酸。它們可以是合成的或是從天然來源獲得的(例如，分離和/或純化)，其可以包含天然的、非天然的或者修飾過的核苷酸。類似地，“氨基酸序列”、“多肽序列”或“多肽”是指肽，寡肽，多肽或蛋白質(zhì)及其片段或部分，其為通過肽鍵相連接的氨基酸。當(dāng)本發(fā)明中的“氨基酸序列”涉及一種天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列時(shí)，這種“多肽”或“蛋白質(zhì)”并不意味著將氨基酸序列限制為與所述蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整的天然氨基酸序列。本發(fā)明的氨基酸序列可以含有附加的肽。作為附加的肽，可以是，例如，多組氨酸標(biāo)簽(His-tag)、或Myc、FLAG等表位標(biāo)記肽。“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的缺失?！安迦搿被颉疤砑印笔侵冈诎被嵝蛄谢蚝塑账嵝蛄兄械母淖儗?dǎo)致與天然存在或改變前的分子相比，一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的增加?！爸脫Q”是指由不同的氨基酸或核苷酸替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸?！叭笔А⒅脫Q或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸”則是指，利用定位誘變法等公知的突變核酸或多肽的制作法缺失、置換或添加能夠缺失、置換或添加的程度的數(shù)目的氨基酸或核苷酸。上述突變不限于利用公知的突變制作法而人為導(dǎo)入的突變，也可以是對(duì)天然存在的核酸或蛋白質(zhì)的突變進(jìn)行分離純化而得到的。多肽的“衍生物”是指基本上保持 如所述多肽或氨基酸序列相同或相似的生物學(xué)功能或活性的氨基酸序列，它們可以包括，例如，D原氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基有缺失和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被添加；或者2)原氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基取代；或者3)原氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基上的某個(gè)基團(tuán)被其它基團(tuán)取代；或者4)原氨基酸序列和另外的分子或化合物(比如糖、脂類、聚乙二醇等)的融合；或者5)原有的氨基酸序列與添加的氨基酸序列融合進(jìn)而形成的多肽序列(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列等)；或者6)以上各種情況的混
八
口 o本發(fā)明中，核苷酸序列的“簡(jiǎn)并變異體”是這樣的多核苷酸序列，其與親本核苷酸序列有區(qū)別，但編碼的蛋白質(zhì)和多肽和親本核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)或多肽一樣。核苷酸的“互補(bǔ)序列”是這樣的多核苷酸序列，其是以親本核苷酸序列為模板根據(jù)堿基互補(bǔ)規(guī)則形成的多核苷酸序列，或是親本核苷酸序列的互補(bǔ)鏈通過轉(zhuǎn)錄或反轉(zhuǎn)錄形成多核苷酸序列。氨基酸序列或核苷酸序列的“相同性”或“同一性”百分率是指在兩種或多種氨基酸或核苷酸序列比較中，序列相同或相似的百分率。有很多本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法測(cè)定相同性百分率，如通過 MEGALIGN 程序(Lasergene software package, DNASTA, Inc.,Madison, WI)。MEGALIGN程序可根據(jù)不同的方法如Cluster法比較兩種或多種序列(參見Higgins & Sharp，1988，Gene 73 :237-244)，Gluster法通過檢查所有配對(duì)之間的距離將各組序列排列成簇，然后將簇以成對(duì)或成組分配。兩個(gè)氨基酸序列如序列A和序列B之間的相同性百分率可以通過下式計(jì)算[(序列A與序列B之間匹配的殘基個(gè)數(shù))/(序列A的殘基數(shù)-序列A中間隔殘基數(shù)-序列B中間隔殘基數(shù))]XlOO %同理，也可以通過Cluster法或用本領(lǐng)域周知的方法如Jotun Hein的方法(參見Hein, 1990, Methods in Emzumology 183 :625-645)來測(cè)定核酸序列的相同性百分率?！爸亟M表達(dá)載體”是指遺傳修飾的寡核苷酸或多核苷酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括編碼mRNA、肽、多肽、或蛋白的核苷酸序列，以及病毒、質(zhì)粒以及其他運(yùn)載體；該構(gòu)建體在足以使所述mRNA、肽、多肽或蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的條件下與所述細(xì)胞接觸，可允許宿主細(xì)胞表達(dá)所述mRNA、蛋白、多肽、或肽。本發(fā)明中，重組表達(dá)載體可以包含任意類型的核苷酸序列，包括但不限于，DNA和RNA，其可以是單鏈的或雙鏈的，合成的或部分獲自天然來源，并且其可以包括天然的、非天然的或改變的核苷酸?！岸ㄏ蚋脑臁币布炊ㄏ蛘T變，是指通過遺傳學(xué)方法例如重組對(duì)存在于宿主細(xì)胞或生物體中的特定DNA的靶基因座進(jìn)行遺傳改造的方法?！爸亟M”或“遺傳重組”用來指通過與其他遺傳物質(zhì)相互作用而使遺傳物質(zhì)在給定的基因座被修改的方法?！巴粗亟M”用來表明重組以同源或同一的遺傳物質(zhì)片段之間相互作用的結(jié)果的形式發(fā)生。相對(duì)應(yīng)的，“非同源重組”用來表明重組以非同源或非相同的遺傳物質(zhì)片段之間相互作用的結(jié)果的形式發(fā)生。非同源末端連接(NHEJ)是非同源重組的實(shí)例?！岸ㄏ蜻z傳重組”指其中重組發(fā)生在存在于宿主細(xì)胞或生物體中的特定DNA靶基因座內(nèi)部的方法?！八拗骷?xì)胞”或“宿主生物體”或“目標(biāo)宿主”指的均是已被選擇用于基因轉(zhuǎn)化并攜帶可表達(dá)本發(fā)明方法中某項(xiàng)功能的一種或多種基因的細(xì)胞或生物體。宿主可進(jìn)一步是已通過本發(fā)明的定向遺傳重組或突變方法轉(zhuǎn)化的生物體或細(xì)胞?！鞍小?、“靶基因”、“靶基因座”或“靶區(qū)域”在此指被選擇用于通過本發(fā)明的定向遺傳重組方法而修飾的基因或DNA片段。通常，這種靶是宿主生物體的內(nèi)源基因、編碼片段、調(diào)控區(qū)域、內(nèi)含子、夕卜顯子或其部分。然而，靶也可以是宿主DNA的一部分或任何部分?！皹?biāo)記”指其存在或缺少使得宿主細(xì)胞或生物體表現(xiàn)出可檢測(cè)表型的基因或序列?？梢杂卸喾N類型的標(biāo)記，例如，選擇性標(biāo)記、篩選標(biāo)記和分子標(biāo)記。選擇性標(biāo)記通常是其被表達(dá)后使生物體表現(xiàn)對(duì)特定的一組環(huán)境條件具有抗性或敏感的表型的基因。篩選標(biāo)記也可以表現(xiàn)為易觀察和可分辨特性的表型，例如綠色熒光蛋白(GFP)、GUS或β -半乳糖苷酶。分子標(biāo)記是例如可以被寡核苷酸探針唯一鑒定的序列特性，如RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)，或SSR標(biāo)記(簡(jiǎn)單序列重復(fù))?！肮w”或“供體構(gòu)建體”指作為功能組被導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物體的全套的DNA片段，而“供體DNA”指的是與靶基因座區(qū)域足夠同源的DNA片段，其可以參與靶雙鏈斷裂(DSB)位點(diǎn)處的重組。“基因”指包括編碼蛋白質(zhì)的翻譯序列(“外顯子”)、不翻譯的間隔序列(“內(nèi)含子”)、以及5’和3’端不翻譯的區(qū)域和任何與前述序列結(jié)合的調(diào)控元件?！澳繕?biāo)動(dòng)物”是指靶基因所在的動(dòng)物，包括人、哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物，例如，豬、馬、牛、羊、狗、貓、兔子、魚類、禽類、鳥類、大鼠、小鼠、昆蟲等，魚類例如
黃顙魚、斑馬魚等。 “模式動(dòng)物”是指在研究人類疾病中或基因在動(dòng)物發(fā)育和遺傳中的作用中，為了在增進(jìn)對(duì)疾病的了解的同時(shí)避免對(duì)人類產(chǎn)生更多風(fēng)險(xiǎn)或揭示基因在動(dòng)物發(fā)育和遺傳中的作用機(jī)制而常規(guī)使用的活的、非人的動(dòng)物?！芭咛ァ笔侵柑幱趶氖芫研纬傻接左w從卵殼膜中孵化前或從母體中分娩前的發(fā)育過程中的幼體。“鋅指基序” (zinc finger motif)是指由肽鏈的保守序列中的一對(duì)組氨酸加一對(duì)半胱氨酸(His2/Cys2)或2對(duì)半胱氨酸(Cys2/Cys2)與一個(gè)鋅離子形成配位鍵,這些氨基酸對(duì)之間的多肽鏈成環(huán)狀突出、折疊成的指形結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中所使用的許多遺傳構(gòu)建體是根據(jù)多種遺傳因子彼此間的相對(duì)位置描述的。其中，“鄰近的”用來表明兩個(gè)元件彼此相鄰而不是指兩個(gè)元件的實(shí)際融合；此外，“側(cè)面的”序列僅用來表明存在于給定序列兩側(cè)的相同、相似或相關(guān)的序列，其不是必須直接與給定序列融合，其與給定的序列之間可插入非特異的DNA。這些描述相對(duì)位置的術(shù)語和其他類似的術(shù)語，均符合遺傳學(xué)領(lǐng)域中的通常用法。本發(fā)明中，“包含”、“包括”和“具有”可互換使用。此外，化合物“選自”指隨后所、列出的一種或多種化合物，其中包括兩種或多種化合物的混合物(即組合物)。本發(fā)明中，分離的化合物是已經(jīng)從其自然環(huán)境中移出的化合物。因而，“分離的”未必反映該化合物已被純化的程度。本發(fā)明的分離化合物可以是從天然來源獲得的，也可以是利用分子生物學(xué)技術(shù)或通過化學(xué)合成生產(chǎn)的。鋅指核酸酶本發(fā)明的鋅指核酸酶(zinc finger nuclease或“ZFN”)是一種核酸內(nèi)切酶,其能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)特異識(shí)別特定基因序列并在該基因序列處促進(jìn)形成雙鏈斷裂(DSB)，從而弓I導(dǎo)產(chǎn)生定向遺傳重組或突變的嵌合蛋白質(zhì)分子。本發(fā)明的鋅指核酸酶包括DNA結(jié)合域和DNA切割域,其中該DNA結(jié)合域由至少一個(gè)鋅指(zinc finger)組成并且可操作地連接到DNA切割域上(見圖I)。該鋅指DNA結(jié)合域在嵌合蛋白質(zhì)分子的N-末端而該DNA切割域位于所述分子的C-末端。本發(fā)明的鋅指核酸酶具有至少一個(gè)鋅指。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的鋅指核酸酶具有至少三個(gè)鋅指，以在用于宿主細(xì)胞或生物體的定向遺傳重組中具有充分的特異性。包含多于三個(gè)鋅指的鋅指核酸酶也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。具有多個(gè)鋅指的鋅指核酸酶，盡管需要更多耗時(shí)地構(gòu)建，但隨著每個(gè)增加的鋅指其具有逐漸增大的特異性。本發(fā)明的鋅指結(jié)構(gòu)可衍生自任何種類或類型的鋅指。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述鋅指結(jié)構(gòu)包含Cys2His2類型的鋅指，該類鋅指在轉(zhuǎn)錄因子TFIIIA或Spl均存在。改變DNA結(jié)合域的鋅指，可以改變鋅指核酸酶的DNA識(shí)別和/或結(jié)合的特異性，從而可以實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞DNA的任何選擇位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)定向遺傳重組。這種改變可利用已知的分子生物學(xué)和/或化學(xué)合成技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的鋅指核酸酶可以包含對(duì)多種DNA具有識(shí)別和/或結(jié)合特異性的鋅指。當(dāng)鋅指核酸酶的鋅指的數(shù)目、類型及其空間相對(duì)位置確定后，它對(duì)DNA識(shí)別和/或結(jié)合的特異性也就隨之確定。不同的鋅指基序(zinc finger motif)決定了不同的鋅指。相對(duì)應(yīng)地，在鋅指核酸酶的多肽序列中，代表鋅指結(jié)構(gòu)的鋅指基序的數(shù)目，其氨基酸序列，以及在DNA結(jié)合域骨架多肽序列中的排列，幫助決定了鋅指核酸酶的對(duì)DNA識(shí)別和/或結(jié)合的特異性。本發(fā)明的鋅指核酸酶的DNA切割域衍生自非特異性的DNA內(nèi)切酶，例如II型限制性內(nèi)切酶的非特異性DNA切割域。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，該DNA切割域可以得自IIS型限制性內(nèi)切酶Fok I。在本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用中，鋅指核酸酶可以包含三個(gè)Cys2His2類型的鋅指，而其DNA-切割域來源于限制性內(nèi)切酶Fok I。每個(gè)鋅指直接接觸3個(gè)連續(xù)的DNA堿基對(duì)，從而形成9bp的鋅指核酸酶DNA的識(shí)別序列。在該優(yōu)選實(shí)施方案中，需要兩個(gè)鋅指核酸酶DNA-切割域形成的二聚體以有效切割雙鏈DNA。因此，需要兩個(gè)緊密相鄰的轉(zhuǎn)化識(shí)別(靶DNA)位點(diǎn)以實(shí)現(xiàn)有效的靶基因定向切割。如果該靶位點(diǎn)的所有位置都是與鋅指核酸酶特異接觸的，那么需要總共18個(gè)堿基對(duì)進(jìn)行識(shí)別。在兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)之間可以有間隔。本發(fā)明鋅指核酸酶識(shí)別位點(diǎn)之間的間隔可以是相當(dāng)于6-35bp的DNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)之間的間隔為6bp。如果在鋅指核酸酶的切割和識(shí)別結(jié)構(gòu)區(qū)之間存在接頭，則該接頭可以包含選定的 氨基酸殘基序列以使得所得的接頭是可變的。或者為了最大的靶點(diǎn)特異性，可以構(gòu)建無接頭的構(gòu)建體。無接頭的構(gòu)建體具有結(jié)合6bp間隔的識(shí)別位點(diǎn)并能隨后對(duì)其進(jìn)行切割的能力。然而，具有接頭長(zhǎng)度為0-18個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度的鋅指核酸酶介導(dǎo)的DNA切割發(fā)生在5-35bp間隔的識(shí)別位點(diǎn)之間。對(duì)于給定的接頭長(zhǎng)度，識(shí)別位點(diǎn)之間的間隔距離是有限制的。在一個(gè)優(yōu)選方案中，接頭長(zhǎng)度為6個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，切割域和識(shí)別區(qū)之間沒有接頭，并且靶基因座包含通過一個(gè)6bp間隔分開的相互之間方向相反的兩個(gè)9bp的識(shí)別序列。為了根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案定向遺傳重組或突變，兩個(gè)9bp鋅指DNA識(shí)別序列必須在宿主DNA中被鑒定出來。這些識(shí)別位點(diǎn)彼此之間是相反方向的并且被大約6bp的間隔DNA分隔。然后設(shè)計(jì)產(chǎn)生在靶基因座特異地結(jié)合所述DNA識(shí)別序列的鋅指組合物，然后將該鋅指組合物連接到限制性內(nèi)切酶的切割域上。動(dòng)物基因的定向改造鋅指核酸酶可識(shí)別并切割特定的基因或染色體基因座，并在此位點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)DNA雙鏈切口(DSB)，而后通過DNA修復(fù)機(jī)制，利用同源重組或非同源末端連接將切口修復(fù)，從而達(dá)到靶基因定向改造的目的。本發(fā)明的方法利用了鋅指核酸酶的上述特性，其可用于任何細(xì)胞或者生物體的定向遺傳改造。這些方法的最低要求包括根據(jù)靶基因區(qū)域的序列信息設(shè)計(jì)識(shí)別并切割靶基因座的鋅指核酸酶；采用獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)檢驗(yàn)所設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶對(duì)靶基因區(qū)域的定向切割能力和效率，并分析所獲得的基因的突變模式；利用選定的鋅指核酸酶在細(xì)胞或生物體內(nèi)對(duì)靶基因進(jìn)行定向遺傳改造，利用選定的基因突變模式篩選獲得的突變細(xì)胞或突變體，從而高效地獲得具有穩(wěn)定的遺傳性狀的突變細(xì)胞或突變體。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法可用于動(dòng)物基因組的定向遺傳重組或突變，以定向改造動(dòng)物基因組的特定基因，建立疾病的遺傳模式或研究特定基因功能或使被改造的動(dòng)物具備特定的經(jīng)濟(jì)性狀。本發(fā)明的鋅指核酸酶可以包括不同的DNA鋅指結(jié)合域和/或DNA切割域。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用，基于所選擇的內(nèi)源性靶基因區(qū)域的序列信息、不同種類鋅指蛋白對(duì)DNA的特異性識(shí)別以及二聚體鋅指核酸酶導(dǎo)致雙鏈斷裂的規(guī)律，設(shè)計(jì)出鋅指核酸酶的DNA鋅指結(jié)合域，其與靶基因區(qū)域指定序列有特異結(jié)合作用的。鋅指核酸酶的DNA切割域可以得自不同來源的非特異性DNA切割域。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)NCBI公布的IIS型限制性內(nèi)切酶Fok I的氨基酸序列，找到限制性內(nèi)切酶Fok I的切割結(jié)構(gòu)域，作為本發(fā)明的鋅指核酸酶的DNA切割域的氨基酸序列。將所述DNA鋅指結(jié)合域的氨基酸序列與限制性內(nèi)切酶Fok I的切割結(jié)構(gòu)區(qū)的氨基酸序列通過特定接頭序列連接而得到本發(fā)明所用的鋅指核酸酶的全序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，上述鋅指核酸酶的設(shè)計(jì)可以通過計(jì)算機(jī)軟件，例如 ZiFiT(http://zifit. partners, org/)來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還包含一獨(dú)立高效的篩選系統(tǒng)或步驟。在利用設(shè)計(jì)得到的鋅指核酸酶對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的靶基因，如動(dòng)物的生殖細(xì)胞的靶基因，進(jìn)行定向改造之前，可以用它來檢驗(yàn)設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶對(duì)靶基因區(qū)域的定向切割能力和效率；進(jìn)一步，該系統(tǒng)可以用來預(yù)先分析設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶通過切割靶基因所能得到的突變模式，并幫助確定預(yù)期的目標(biāo)突變模式。盡管不同的鋅指核酸酶對(duì)靶基因造成的突變類型不可預(yù)計(jì)，但是發(fā)明人在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)， 用對(duì)目標(biāo)動(dòng)物的特定基因具特異識(shí)別的鋅指核酸酶在斑馬魚胚胎內(nèi)對(duì)目標(biāo)動(dòng)物的特定基因進(jìn)行切割后所獲得的主要的基因突變類型在不同批次的實(shí)驗(yàn)中是保守的，也即可重復(fù)出現(xiàn)。更進(jìn)一步，將這樣的鋅指核酸酶注射到目標(biāo)動(dòng)物的胚胎后，它在目標(biāo)動(dòng)物的基因組中也可形成相同的主要突變類型。發(fā)明人認(rèn)為這種特定基因鋅指核酸酶在不同動(dòng)物的胚胎細(xì)胞中切割特定基因所導(dǎo)致主要突變類型的重復(fù)出現(xiàn)是基于1)特定基因鋅指核酸酶的切割點(diǎn)是出現(xiàn)在左右鋅指基序組合識(shí)別的特定序列之間的特定位置上，與其它側(cè)翼序列無關(guān)；2)針對(duì)這種切割造成的DSB所進(jìn)行的NHEJ修復(fù)是一個(gè)高度保守的修復(fù)系統(tǒng)，其所包含的修復(fù)機(jī)器在不同動(dòng)物的胚胎細(xì)胞中是高度保守的。因此，利用一獨(dú)立高效的篩選系統(tǒng)，預(yù)先分析所設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶可能造成的各種突變模式，對(duì)確認(rèn)所設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶是否可以識(shí)別特定的靶基因，是否可以誘發(fā)出預(yù)期的突變模式，以及選用哪一種突變模式用來篩選子代以獲得穩(wěn)定可遺傳突變的性狀，均具有十分重要的意義。目前已知的鋅指核酸酶構(gòu)建與篩選方法包括模塊組裝(Modular Assembly) >寡聚物化集中工程(Oligomerized Pool Engineering, OPEN)和背景參照組裝(Context-Dependent Assembly, CoDA)。模塊組裝方法將位于不同載體上的鋅指編碼序列通過限制性酶切和連接的方法連接為完整的鋅指結(jié)構(gòu)域編碼序列，并連入篩選用表達(dá)載 體，與篩選用靶載體共同轉(zhuǎn)入細(xì)菌中，以細(xì)菌或酵母雙雜交的方式鑒定鋅指結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合能力。在鑒定結(jié)果為有一定的結(jié)合能力后，將鋅指結(jié)構(gòu)域編碼序列與FokI內(nèi)切功能域編碼序列相連，形成完整的鋅指內(nèi)切酶單體基因。寡聚物化集中工程將位于不同載體上的鋅指編碼序列以重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法連接為完整的鋅指結(jié)構(gòu)域編碼序列，篩選方法與模塊組裝相同。這些篩選方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以針對(duì)一對(duì)具切割功能的鋅指核酸酶二聚體中的一個(gè)鋅指核酸酶的鋅指結(jié)構(gòu)域的識(shí)別能力進(jìn)行篩選，并且OPEN方法適宜進(jìn)行大批量篩選。但其缺點(diǎn)在于按這些方法篩選鋅指結(jié)構(gòu)域費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)一個(gè)給定基因并不總是能夠篩選到有效的鋅指核酸酶，且篩選出來的鋅指結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力與在體內(nèi)該對(duì)鋅指核酸酶能否有效切割靶基因并不完全匹配。本發(fā)明中，結(jié)合針對(duì)靶基因位點(diǎn)的鋅指核酸酶的設(shè)計(jì)，采用了一高效的篩選系統(tǒng)直接確定設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶對(duì)靶基因區(qū)域的定向切割能力和效率，從而可以直接有針對(duì)性地篩選出能進(jìn)行有效切割的鋅指核酸酶，以更好地進(jìn)行下游定向修飾動(dòng)物基因組中特定基因的操作。同時(shí)，已有的鋅指核酸酶構(gòu)建與篩選系統(tǒng)并不考慮所設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶在體內(nèi)所能獲得的突變模式、以及如何高效地實(shí)現(xiàn)子代的篩選。因此，尤其是對(duì)于所得到的鋅指核酸酶的切割誘變效率低下、操作周期長(zhǎng)、或者操作的細(xì)胞數(shù)目巨大的情況下，本發(fā)明具有特別的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用，所述的獨(dú)立篩選系統(tǒng)可以是獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)。在該表達(dá)系統(tǒng)中，上述設(shè)計(jì)的能識(shí)別并切割靶基因的鋅指核酸酶對(duì)靶基因的定向切割能力和效率可以直接得到驗(yàn)證。更進(jìn)一步，還可以比較和分析所設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶誘發(fā)得到的一系列突變模式。基于對(duì)突變目的是否得到實(shí)現(xiàn)的判斷，以及對(duì)突變模式出現(xiàn)頻率的比較，可以選定將來用來篩選得到突變的子代的突變模式。上述的獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)可以為任何模式動(dòng)物的卵母細(xì)胞、受精卵、I-細(xì)胞期胚胎或其他發(fā)育時(shí)期的胚胎。這些模式動(dòng)物可以為小鼠，大鼠，非洲爪蟾，斑馬魚，青鏘魚，黑腹果蠅，秀麗隱桿線蟲等。優(yōu)選地，所述獨(dú)立表達(dá)系統(tǒng)可以為爪蟾卵母細(xì)胞，或斑馬魚胚胎。更優(yōu)選的，所用的獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)為斑馬魚胚胎，特別是受精卵或I-細(xì)胞期胚胎。在本發(fā)明中，可以通過多種本領(lǐng)域公知的方法將靶基因與鋅指核酸酶遞送進(jìn)入該獨(dú)立表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化表達(dá)。優(yōu)選地，可以將包含靶基因座的基因的表達(dá)載體如質(zhì)粒，以及鋅指核酸酶的mRNA，注射進(jìn)所述獨(dú)立表達(dá)系統(tǒng)，以驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶對(duì)靶基因座的定向切割能力和效率，并檢測(cè)所能得到的突變模式。選定的鋅指核酸酶以及突變模式可用于細(xì)胞或生物體的定向遺傳重組或突變，尤其是對(duì)動(dòng)物基因組的定向突變。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用，設(shè)計(jì)并選定的鋅指核酸酶可以注射進(jìn)動(dòng)物分離的受精卵中，再讓其在離體或植入雌性體內(nèi)發(fā)育，以期得到鋅指核酸酶介導(dǎo)的DNA切割并產(chǎn)生定向的突變。為得到穩(wěn)定的可遺傳的突變性狀，上述方法得到的子代需要進(jìn)行篩選?？梢詰?yīng)用上述步驟中選定的突變形式對(duì)子代進(jìn)行篩選。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，基于選定的突變模式設(shè)計(jì)針對(duì)突變后的靶基因的PCR引物，利用該引物對(duì)子代進(jìn)行PCR，篩取具有陽性反應(yīng)的子代進(jìn)一步進(jìn)行遺傳育種培養(yǎng)以最終獲得具有穩(wěn)定的預(yù)期遺傳性狀的后代。作為本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用，本發(fā)明的方法還可用于在動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)生殖系基因治療。鋅指核酸酶介導(dǎo)的DNA切割可在有或沒有供體DNA時(shí)發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明的一些應(yīng)用，例如在造成遺傳重組時(shí)，供體DNA也可能是需要的。供體DNA可以是和靶基因同源或同一的DNA，也可以是非同源或同一的DNA。這些同源或異源DNA可以包含突變，核酸插入或 者多缺失。編碼可識(shí)別標(biāo)記的DNA可包括在DNA供體內(nèi)，這種標(biāo)記可包括其存在或缺少使宿主細(xì)胞或生物體表現(xiàn)可檢測(cè)表型的基因或序列，以確定基因重組或突變的產(chǎn)生。多種類型的標(biāo)記包括但不限于選擇性標(biāo)記、篩選標(biāo)記和分子標(biāo)記。選擇性標(biāo)記通常是其被表達(dá)后使生物體表現(xiàn)對(duì)特定的一組環(huán)境條件具有抗性或敏感的表型的基因。篩選標(biāo)記可以表現(xiàn)出易觀察和可分辨特性的表型，例如綠色熒光蛋白(GFP)、β-葡糖醛酸酶(GUS)或β-半乳糖苷酶。分子標(biāo)記可以是，例如，只被寡核苷酸探針鑒定出的序列特性，例如RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)，或SSR標(biāo)記(簡(jiǎn)單序列重復(fù))。本發(fā)明中，由鋅指核酸酶切割雙鏈DNA所誘發(fā)的重組可用于在細(xì)胞或染色體基因組中誘發(fā)各類突變，包括但不限于i) “敲除”(刪除)特定的基因；ii) “敲入”(插入)用于表達(dá)的特定基因；iii)提供用于鑒定該事件的選擇標(biāo)記等。本發(fā)明中，依賴于每個(gè)細(xì)胞或生物體的特定條件，核酸以及核酸載體通過細(xì)胞膜/核膜的遞送以及轉(zhuǎn)化可通過多種已知技術(shù)進(jìn)行，這些技術(shù)已被用于許多生物體和細(xì)胞，例如包括形成DNA或RNA與陽離子類脂、脂質(zhì)體或其他載體材料的復(fù)合物，微量注射、粒子槍轟擊、電穿孔和將轉(zhuǎn)化DNA或RNA并入病毒載體等。這些技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。
實(shí)施例應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件(如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》(Sambrook等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社2002年))中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例一、定向敲除黃顙魚基因組中肌抑素基因在漁業(yè)生產(chǎn)上，獲得大規(guī)格成品魚及提高成品魚中的肌肉含量是魚類基因工程育種的主要目標(biāo)之一。肌肉生長(zhǎng)抑制素(簡(jiǎn)稱“肌抑素”)是一種肌肉生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，肌抑素基因突變會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)出更多的肌肉從而使動(dòng)物變得更大。如肌抑素基因天然突變的牛肌肉增多，成為雙肌牛(double muscle cattle);小鼠肌抑素基因敲除后肌肉增多、體型變大，成為超級(jí)鼠(supermice);斑馬魚肌抑素基因敲落后魚個(gè)體體重增加約40%以上。相應(yīng)地，敲除其它魚類如黃顙魚的肌抑素基因，去除該基因?qū)∪獍l(fā)生的抑制功能，使魚的生長(zhǎng)速度加快、肌細(xì)胞增生與肌纖維增大，是本實(shí)施例的目的。I、識(shí)別黃顙魚肌抑素基因的特異性鋅指基序組合的設(shè)計(jì)及黃顙魚肌抑素基因鋅指核酸內(nèi)切酶左鏈和右鏈全基因序列的克隆。(I)利用可自由使用的公開軟件(ZiFiT http://zifit. partners, org/)設(shè)計(jì)一對(duì)可特異識(shí)別黃顙魚基因組第一外顯子(含起始密碼子ATG)肌抑素基因(GENEBANK登錄號(hào)DQ767967，l-3114bp)的鋅指基序組合。所得的鋅指基序組合分別為SEQ ID NOs. 11,12和13或SEQ ID NOs. 14、15和16。上述每對(duì)組合中的三個(gè)鋅指基序被設(shè)計(jì)成在序列分別為SEQ ID NO. 2與SEQ ID NO. 5的骨架多肽上依從多肽氨基端到羧基端的方向依次排列；相應(yīng)cDNA序列分別為SEQ ID NO. I與SEQ IDN0. 4。上述每對(duì)組合中的三個(gè)特定的鋅指基序還可以依照相同的排列次序，分別排列在不同的骨架多肽序列上，而仍保持其對(duì)特定DNA的識(shí)別/結(jié)合特異性。例如，上述鋅指基序組合SEQ ID NOs. 11、12和13或鋅指基序組合SEQ ID NOs. 14、15和16還可以被設(shè)計(jì)成以從多肽氨基端到羧基端的方向，分別排列在如SEQ ID NO. 3與SEQ ID NO. 6所示的多肽序 列上。(2)使用 Vector NTI 軟件(Invitrogen, Carlsbad, CA,美國)將含上述特定鋅指基序組合的cDNA(SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5)和FokI核酸內(nèi)切酶基因重組形成一對(duì)特定的鋅指核酸內(nèi)切酶，分別稱為黃顙魚肌抑素基因鋅指核酸內(nèi)切酶左鏈(ycMYZFN-L) (DNA序列見SEQID NO. 7，氨基酸序列見SEQ ID NO. 8)和黃顙魚肌抑素基因鋅指核酸內(nèi)切酶右鏈(ycMYZFN-R) (DNA 序列見 SEQ ID NO. 9，氨基酸序列見 SEQ ID NO. 10)。(3)依據(jù)上述黃顙魚肌抑素基因鋅指核酸內(nèi)切酶左鏈和右鏈基因序列，采用人工合成的方法合成編碼黃顙魚肌抑素基因鋅指核酸內(nèi)切酶左鏈和右鏈的全基因DNA。(4)將上述黃顙魚肌抑素基因鋅指核酸內(nèi)切酶左鏈和右鏈全基因DNA分別克隆到pST1374 載體(購自 Addgene, Cambridge, MA,美國)與 pcDNA (-) 3. I 載體(購自 Addgene,Cambridge, MA，美國)中(兩個(gè)基因位于載體上17啟動(dòng)子的控制下，新獲得的克隆載體分別稱為 pST1374-ycMYZFN-L、pcDNA3. I (-)-ycMYZFN-R。2、在斑馬魚胚胎內(nèi)驗(yàn)證如上設(shè)計(jì)的黃顙魚肌抑素基因鋅指核酸內(nèi)切酶(含左鏈和右鏈)具有可特異切割黃顙魚肌抑素基因造成該基因移碼突變的能力。(I)利用美國英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen, Carlsbad, CA,美國)mMessage mMachine T7 Ultra試劑盒(AM1345)，以上述兩個(gè)克隆載體pST1374-ycMYZFN_L、pcDNA3. I (-) -ycMYZFN-R為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的mRNA。(2)將合成所得的兩種mRNA等量混合、加無核酸酶水稀釋至濃度分別為200ng/U L，成為鋅指核酸內(nèi)切酶注射液，預(yù)備于步驟3 (2)中使用。(3)將黃顙魚肌抑素基因基因組DNA的全長(zhǎng)(Genbank登錄號(hào)DQ767967，l-3114bp)通過TA克隆方法克隆到pGEM-T載體(購自PROMEGA，Madison，WI，美國)上，新得到的克隆稱為pGEM-T_yc_mstn。(4)將含pGEM-T-yC_mstn克隆載體的溶液用蛋白酶K去除核酸酶然后再去除蛋白酶K后與兩種鋅指內(nèi)切酶mRNA溶液加水混合至終濃度分別為50ng/ U I和200ng/ U I。(5)將上述核酸混合液注射入斑馬魚I-細(xì)胞期胚胎，24小時(shí)后用苯酚氯仿抽提方法提取全胚胎DNA作為PCR模板(將胚胎浸泡在500 u I含有IOmM Tris (pH = 8)、
0.IM EDTA,0. 5% SDS和10 y g/ml蛋白酶K的裂解液中，在50攝氏度溫浴I小時(shí)，其間經(jīng)常震蕩。加入500iil I I的苯酚氯仿，震蕩后離心10分鐘(12，OOOg)，吸取400 ill上清液，加入40 ill 3M NaCl,以及800 無水乙醇，混勻后離心10分鐘(2，OOOg)，用75%的乙醇洗滌沉淀，將沉淀晾干后加入IOOiU去離子水溶解)。以被打靶的黃顙魚肌抑素基因的鋅指內(nèi)切酶靶位點(diǎn)附近序列作為PCR引物(正、反向引物序列分別為5，-gatcccaaggtgttcctgtt-3，(SEQ ID NO. 56)和 5，-cttgaagacggagctgcttg-3，(SEQ IDNO. 57))進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94攝氏度2分鐘，30個(gè)循環(huán)(94攝氏度30秒，60攝氏度30秒，72攝氏度30秒)，72攝氏度5分鐘。(6)將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化后TA克隆連接到pGEM_T載體上，將5 U I所得的連接產(chǎn)物加入50 u I DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，在冰上靜置30分鐘，在42攝氏度熱激90秒，在冰上靜置2分鐘后涂布到含有100ng/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)基平板上，在37攝氏度培養(yǎng)14 小時(shí)后隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行PCR鑒定(條件同上)，最后隨機(jī)選取100個(gè)含目標(biāo)片段的克隆進(jìn) 行測(cè)序鑒定，確定黃顙魚肌抑素基因基因組DNA被黃顙魚肌抑素基因鋅指核酸內(nèi)切酶切割后形成的獨(dú)特的基因重組方式。3、在經(jīng)人工授精獲得的黃顙魚體外受精卵中，驗(yàn)證該對(duì)特異鋅指核酸內(nèi)切酶可特異切割黃顙魚基因組中肌抑素基因造成該基因移碼突變。(I)通過人工授精技術(shù)，獲得黃顙魚體外受精卵(參考MWesterfield(2000)，斑馬魚書斑馬魚實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第4版Univ. of Oregon出版社)。其具體方法為，在預(yù)定進(jìn)行顯微注射的前一天晚上9點(diǎn)進(jìn)行激素催產(chǎn)，即將黃顙魚任一側(cè)胸鰭展開，用注射器從暴露出的胸鰭基部刺入，向體內(nèi)注射溶于0. 68% NaCl溶液中的3 ii g黃體生成素釋放激素(LHRH-A2)和150IU人絨毛膜促性腺激素(hCG)，向雌魚注射6 y g黃體生成素釋放激素(LHRH-A2)和300IU人絨毛膜促性腺激素(hCG)。在進(jìn)行顯微注射當(dāng)天，監(jiān)視雌魚排卵情況，用手指輕輕擠壓雌魚腹部，如果卵即從泄殖腔孔排出，則雌魚已進(jìn)入排卵理想狀態(tài)，此時(shí)從魚體前部向后部滑動(dòng)擠壓雌魚腹部將卵盡量擠出并盛接在裝有0. 68% NaCl溶液的玻璃培養(yǎng)皿中。剖開雄魚腹部,取出精巢,研磨至看不到明顯的組織小塊,加3ml 0.68% NaCl溶液在研磨物中，攪動(dòng)以懸浮研磨物，用滴管吸取此人工精液，滴入盛有卵的培養(yǎng)皿中迅速混勻。然后將這些受精卵用滴管吸取分散到裝有已曝氣的自來水或去離子水的培養(yǎng)皿中在解剖鏡下立即用于顯微注射。(2)利用顯微注射技術(shù)將黃顙魚肌抑素基因鋅指核酸內(nèi)切酶注射液(濃度200ng/UL)注入黃顙魚I-細(xì)胞期的體外受精卵中。(3)將注射后的黃顙魚受精卵在室溫25攝氏度下培養(yǎng)3天，隨機(jī)選取40個(gè)胚胎按苯酚氯仿抽提法提取基因組DNA作為PCR模板。以被打靶的黃顙魚肌抑素基因的鋅指內(nèi)切酶靶位點(diǎn)附近序列作為PCR引物(正反向引物序列分別為5，-gatcccaaggtgttcctgtt-3J (SEQ ID NO. 56)和 5，-cttgaagacggagctgcttg-3，(SEQ IDNO. 57))進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94攝氏度2分鐘，30個(gè)循環(huán)(94攝氏度30秒，60攝氏度30秒，72攝氏度30秒)，72攝氏度5分鐘。將產(chǎn)物在含0. 02%溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖中的水平電泳槽中進(jìn)行電泳。電泳15分種后，在254nm波長(zhǎng)的紫外燈下觀察電泳膠分子量289bp左右的條帶。
(4)將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后TA克隆連接到pGEM_T載體上，將5 μ I所得的連接產(chǎn)物加入到50 μ I DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在冰上靜置30分鐘，在42攝氏度熱激90秒，在冰上靜置2分鐘后涂布到含有50 μ g/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)基平板上，在37攝氏度培養(yǎng)14小時(shí)后隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行PCR鑒定(條件同上)，最后隨機(jī)選取100個(gè)含目標(biāo)片段的克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，確定黃顙魚基因組肌抑素基因被黃顙魚肌抑素基因鋅指核酸內(nèi)切酶切割后形成的獨(dú)特的基因重組方式。4、分析移碼突變肌抑素基因的突變類型，確定含移碼突變肌抑素基因的魚創(chuàng)建者的基因型。
(I)同時(shí)分析在斑馬魚胚胎中和黃顙魚體外受精卵中，黃顙魚基因組肌抑素基因被黃顙魚肌抑素基因鋅指核酸內(nèi)切酶切割后形成的獨(dú)特的基因重組方式。在預(yù)期的切割位點(diǎn)，相比較野生型的基因序列(如SEQ ID NO. 17所示)，鋅指核酸酶切割后引發(fā)的NHEJ修復(fù)造成多種不同的突變形式如SEQ ID NOs. 18-55所示。其中，無論是在斑馬魚胚胎中還是在黃顙魚體外受精卵中，鋅指酶造成的主要的突變類型均一致(總結(jié)于表I)。特別是，如SEQ ID NO. 35所示的移碼突變的出現(xiàn)頻率在兩者中均占了所有獲得的突變類型的50%以上。并且，該突變可形成無功能的截短肌抑素蛋白，符合本實(shí)驗(yàn)敲除肌抑素基因的目的。因此，該移碼突變類型被確定為所設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶誘發(fā)的主要突變類型，并被作為以下將要篩選的創(chuàng)建者的基因型。(2)針對(duì)上述選定的主要突變類型,設(shè)計(jì)PCR引物,序列分別為5’ -ccaacagtccaacagctcctct-3，(SEQ ID NO. 58)和 5，-cgcttcacgctcctccgtcactcac-3，(SEQ ID NO. 59)。然后在特定的PCR條件下(94攝氏度2分鐘，30個(gè)循環(huán)(94攝氏度30秒，70攝氏度30秒，72攝氏度30秒)，72攝氏度5分鐘)分別以含黃顙魚肌抑素基因主要突變類型的克隆載體和含黃顙魚肌抑素基因基因組DNA (Genebank登錄號(hào)DQ767967)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將產(chǎn)物在含O. 02%溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖中的水平電泳槽中進(jìn)行電泳。電泳15分種后，在254nm波長(zhǎng)的紫外燈下觀察電泳膠，以含黃顙魚肌抑素基因主要突變類型的克隆載體為模板的泳道出現(xiàn)290bp左右分子量的條帶，而含黃顙魚肌抑素基因基因組DNA為模板的泳道無擴(kuò)增條帶。從而確定上述引物可特異擴(kuò)增黃顙魚肌抑素基因主要突變類型。(3)將注射了黃顙魚肌抑素基因鋅指核酸內(nèi)切酶后的黃顙魚受精卵在室溫25攝氏度下培養(yǎng)兩個(gè)月，剪取所孵化幼魚的部分尾鰭或胸鰭或背鰭，提取基因組DNA用作PCR模板。用上述設(shè)計(jì)的PCR引物在上述特定的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，并將一半產(chǎn)物進(jìn)行電泳。在254nm波長(zhǎng)的紫外燈下觀察電泳膠，出現(xiàn)290bp左右分子量的條帶。將該條帶對(duì)應(yīng)的另一半PCR產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化后TA克隆重組到pGEM-T載體中，在對(duì)陽性克隆測(cè)序后確定該P(yáng)CR擴(kuò)增片段來自移碼突變肌抑素基因。從而確定提供該模板的幼魚為黃顙魚肌抑素基因被改造的創(chuàng)建者(founder)。5、篩選含移碼突變肌抑素基因的黃顙魚創(chuàng)建者的子一代，并以子一代為親本自交，獲得含去除肌抑素功能的突變肌抑素基因的純合體的新品系黃顙魚。(I)將所得的攜帶移碼突變肌抑素基因的黃顙魚創(chuàng)建者飼養(yǎng)至性成熟，每個(gè)個(gè)體分別與野生黃顙魚通過人工授精方式進(jìn)行人工繁殖獲得體外受精卵。將體外受精卵在室溫下培養(yǎng)至受精后4小時(shí)，隨機(jī)選取50個(gè)胚胎一組(其余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)育)，按常規(guī)方法提取胚胎基因組DNA作為PCR模板，然后用在3 (3)中所描述的方法進(jìn)行鑒定，如果PCR產(chǎn)物含有陽性條帶，則將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆測(cè)序確定其是否來自含突變的肌抑素基因的模板。共檢測(cè)最多1000個(gè)胚胎，一旦確定在選取的胚胎中含突變的肌抑素基因，就將其余胚胎培養(yǎng)至兩個(gè)月大的幼魚，然后按4(3)所描述的方法通過剪取部分魚鰭確定每個(gè)幼魚的基因型。含突變的肌抑素基因的子一代即為攜帶突變肌抑素基因的雜合子黃顙魚。
(2)將攜帶突變等位基因雜合子的黃顙魚飼養(yǎng)至性成熟，然后相互交配。對(duì)得到的后代飼養(yǎng)至兩個(gè)月后用4 (3)進(jìn)行基因型鑒定，并通過定量PCR對(duì)幼魚基因組中含突變肌抑素基因的拷貝數(shù)進(jìn)行定量，在基因組中含兩份拷貝的幼魚即為突變肌抑素基因純合子的黃顙魚。將此基因型的黃顙魚飼養(yǎng)至性成熟，純合子自交后可達(dá)到形狀可穩(wěn)定遺傳的含突變肌抑素基因的新品系黃顙魚。該品系黃顙魚個(gè)體的肌肉含量、體格或生長(zhǎng)速度比野生型黃顙魚顯著增大。表I野生型黃顙魚肌抑素基因(Genbank登錄號(hào)DQ767967)外顯子I部分序列(自起始密碼子計(jì)，5-199號(hào)核苷酸)(長(zhǎng)度為195bp) ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCGGCGCACCGGAGCACCAGCAGCAGCACCAACAACAACCCACTGCCGTGACGGAGGAGCGTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 17)經(jīng)黃顙魚肌抑素基因鋅指核酸酶切割后形成的突變的黃顙魚肌抑素基因外顯子序列的主要類型(選定的突變類型用下劃線標(biāo)出)ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCGGCGCACCGGAGCACCAGCAGCAGCACCAACAACAACCCACTGCCGTGA-GAGGAGCGTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 18)ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCGGCGCACCGGAGCACCAGC AGCAGCACCAACAACAACCCACTGCCGTGA—AGGAGCGTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 19)ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCGGCGCACCGGAGCACCAGCAGCAGCACCAACAACAACCCACTGCCGT——GAGGAGCGTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 20)ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCG
GCGCACCGGAGCACCAGCAGCAGCACCAACAACAACC-ACTGCCG-----GAGGAGCGTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 21)ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCG
GCGCACCGGAGCACCAGCAGCAGCACCAACAACAACCCACTGCC-------------GTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 22)ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCG
GCGCACCGGAGCACCAGCAGCAGCACCAACAACAACCCACTG----------------------------------
----------------TTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ IDNO. 23)ATTTAG---------------------------------------------------------------
——GGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGTTAGGGTTAGGGTT-GTGACGGAGGAGCGTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 24)
權(quán)利要求
1.一種定向改造動(dòng)物基因組中特定基因的方法，包括根據(jù)目標(biāo)動(dòng)物靶基因區(qū)的序列設(shè)計(jì)特異識(shí)別并切割靶基因的鋅指核酸酶，使用獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證所述鋅指核酸酶對(duì)靶基因的定向切割能力和效率，利用選定的鋅指核酸酶對(duì)目標(biāo)動(dòng)物的胚胎的靶基因進(jìn)行定向遺傳改造并獲得穩(wěn)定的遺傳性狀。
2.權(quán)利要求I的方法，還包括使用獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)篩選所獲得的基因突變模式，并利用選定的突變模式篩選定向遺傳改造所獲得的子代。
3.權(quán)利要求I的方法，所述獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)為模式動(dòng)物的卵母細(xì)胞或胚胎。
4.權(quán)利要求3的方法，所述模式動(dòng)物為小鼠、大鼠、非洲爪蛙、斑馬魚、青鏘魚、黑腹果蠅和/或秀麗隱桿線蟲等常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
5.權(quán)利要求3的方法，所述獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)為斑馬魚的胚胎。
6.權(quán)利要求2的方法，所述突變模式的篩選根據(jù)在所述獨(dú)立表達(dá)系統(tǒng)中獲得的突變模式的出現(xiàn)頻率來決定。
7.權(quán)利要求6的方法，所述選定的突變模式在所有獲得的突變模式中的出現(xiàn)頻率最聞。
8.權(quán)利要求2的方法，所述利用選定的突變模式篩選定向遺傳改造所獲得的子代的方法包括基于所選定的突變模式設(shè)計(jì)PCR引物；利用所設(shè)計(jì)的PCR引物，采用PCR的方法檢測(cè)所獲得的子代的基因型。
9.權(quán)利要求I的方法，其中目標(biāo)動(dòng)物為黃顙魚，靶基因?yàn)榧∪馍L(zhǎng)抑制素基因。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所選定的基因突變模式包括如SEQIDNOs. 18-55所示的核苷酸序列的任意一種。
11.一種特異性識(shí)別并切割黃顙魚肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的鋅指核酸酶或其衍生物，其多肽序列從氨基端到羧基端的方向包含三個(gè)鋅指基序，分別為SEQ ID NOs. 11、12和13或SEQ ID NOs. 14、15 和 16。
12.權(quán)利要求11的鋅指核酸酶或其衍生物，其多肽序列包含如SEQID NOs. 2、3、5、和6所示的氨基酸序列中的任意一種。
13.分離的多肽及其衍生物，其包含如SEQID NOs. 2、3、5、和6所示的氨基酸序列中的任意一種。
14.分離的多核苷酸，其包含編碼如權(quán)利要求11所述的鋅指核酸酶多肽或其衍生物的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
15.分離的多核苷酸，其包含編碼如權(quán)利要求12所述的鋅指核酸酶多肽或其衍生物的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
16.分離的多核苷酸，其包含編碼如權(quán)利要求13所述多肽及其衍生物的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
17.—種含有外源多核苷酸的重組表達(dá)載體,其由權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的多核苷酸與質(zhì)粒，病毒，或運(yùn)載體構(gòu)建而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用一種定向誘變動(dòng)物基因組的方法。具體來說，本發(fā)明提供一種新的利用鋅指核酸酶定向改造動(dòng)物基因組的特定基因的方法，包括根據(jù)目標(biāo)動(dòng)物靶基因區(qū)的序列設(shè)計(jì)特異識(shí)別并切割靶基因的鋅指核酸酶，使用獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證所述鋅指核酸酶對(duì)靶基因的定向切割能力和效率，利用選定的鋅指核酸酶對(duì)目標(biāo)動(dòng)物的胚胎的靶基因進(jìn)行定向遺傳改造并獲得穩(wěn)定的遺傳性狀。進(jìn)一步，本發(fā)明還涉及使用所述的獨(dú)立表達(dá)系統(tǒng)，篩選利用所設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶所獲得的主要的基因突變模式，并利用選定的突變模式高效篩選定向遺傳改造所獲得的子代。另一方面，本發(fā)明還涉及利用所述方法，獲得能特異識(shí)別黃顙魚肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的鋅指核酸酶，并定向地敲除了黃顙魚的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102653756SQ20111005237
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2011年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月4日
發(fā)明者董張及, 趙慶順 申請(qǐng)人:南京大學(xué)