專利名稱：檢測bcr/abl融合基因abl激酶區(qū)耐藥突變位點的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic Myelognous Leukemia,CML)是一種發(fā)生于造血干細(xì) 胞的血液系統(tǒng)惡性克隆增生性疾病，在我國的發(fā)病率為36/10萬人，其中90%以上病例均具有BCR/ABL融合基因。BCR/ABL融合基因是由人體細(xì)胞第9號染色體上的ABL原癌基因與第22號染色體上的BCR基因相互易位形成的融合基因，可引起蛋白激酶持續(xù)性激活，使白細(xì)胞過分増殖而出現(xiàn)慢性粒細(xì)胞白血病。人ABL基因位于9號染色體長臂，有l(wèi)b、la和2 11共12個外顯子。轉(zhuǎn)錄始自Ib或la，形成的兩種mRNA長度分別為7kb和6kb，形成兩種轉(zhuǎn)錄本，每種轉(zhuǎn)錄本由11個外顯子組成，合成的兩種蛋白質(zhì)分子量均約為145kD，前者定位于細(xì)胞膜，而后者主要在細(xì)胞核內(nèi)。ABL蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。人BCR基因位于22號染色體長臂，有23個外顯子。BCR蛋白的I 63個氨基酸參與BCR蛋白多聚體的形成。BCR/ABL融合基因見于95%以上CML患者，也見于20% 25%成人ALL和2% 4%兒童ALL患者。約6%成人急性髓細(xì)胞性白血病(acute myeloblastic leukemia, AML)、I %兒童AML和10%急性混合細(xì)胞型白血病(acute mixed lineage leukemia, AMLL)患者中也可檢測到BCR/ABL融合基因。不同的BCR/ABL融合基因類型與疾病表型相關(guān)。BCR/ABL融合基因中，主要由ABL段攜帶細(xì)胞惡變的主要信息，而BCR段的斷裂位點主要影響疾病表型。BCR基因常見的斷裂點有三個，如圖I所示(I)M-BCR區(qū)，位于外顯子bl b5之間5. 8kb的區(qū)域，轉(zhuǎn)錄成b2a2或b3a2型mRNA，編碼210kD的BCR/ABL融合蛋白(p210)，見于90 %以上的CML和33 %的Ph+成人ALL患者。(2)m-BCR區(qū)，位于外顯子e2'和e2之間的54. 4kb的區(qū)域，轉(zhuǎn)錄成ela2型mRNA，編碼190kD的融合蛋白(pl90)，見于2/3的Ph+成人B_ALL、3%的非典型CML和慢性粒細(xì)胞-單核細(xì)胞白血病(chronic myelomonocytic leukemia, CMML)患者。(3) μ -BCR區(qū)，位于外顯子19下游，轉(zhuǎn)錄成el9a2型mRNA，編碼p230kD的融合蛋白，主要見于Ph+的慢性中性粒細(xì)胞白血病(chromic neutrophilic leukemia, CNL)。慢性粒細(xì)胞白血病的BCR基因斷裂點常位于M-BCR，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量為210kb。因斷裂點不一，BCR/ABL融合基因及其mRNA和蛋白產(chǎn)物呈多樣性。目前世界上已報道的常見27個位點33種常見BCR/ABL融合基因耐藥突變?nèi)鏜244V、L248V、G250E、Q252H/R、Y253F/H、E255K/V、D276G、T277A、E279K、F311L、T315I、F317L、L324Q、M343T、A344V、A350V、M351T、E355G、F359C/V,V379I、F382L、L387M/F、M388L、H396R、A397P、E450G/K、E459K，具有這些突變的慢性粒細(xì)胞白血病患者預(yù)后差，生存率低，其中，激酶區(qū)P-Loop片段中L248V，G250E, Q252H/R，Y253F/H，E255K/V突變預(yù)后較其它突變預(yù)后差，T315I預(yù)后最差。ABL基因N端具有酪氨酸激酶活性。ABL激酶區(qū)位于AA第235 509(M14752 :1067bp 1891bp)區(qū)，由P環(huán)結(jié)構(gòu)(P-Ioop),激酶催化區(qū)(kinase domain)及A環(huán)結(jié)構(gòu)(A-Ioop)三部分組成。因此，當(dāng)染色體發(fā)生t (9，22)易位，即BCR與ABL形成融合基因時，能夠?qū)е禄颊吖撬杓?xì)胞內(nèi)多種蛋白酪氨酸激酶水平紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。靶向治療藥物格列衛(wèi)(imatinib)為BCR/ABL融合基因陽性CML患者帶來了福音，但是臨床治療后發(fā)現(xiàn)，約50%的CML患者由于其BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)存在多種類 型突變而造成對格列衛(wèi)耐藥，甚至部分CML患者還存在對格列衛(wèi)的原發(fā)耐藥。2010年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指出，BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)突變對CML患者治療效果及病情進(jìn)展具有重要的提示作用。檢測BCR/ABL融合基因的分子生物學(xué)方法前期主要進(jìn)行定性檢測，目前熒光定量PCR(RQ-PCR)方法被更多地應(yīng)用，RQ-PCR進(jìn)ー步提供了定量監(jiān)測腫瘤細(xì)胞水平的準(zhǔn)確方法，BCR/ABL融合基因的水平與臨床療效有很好的相關(guān)性，并能預(yù)先對臨床病情變化提出警示，對于腫瘤微小殘留病的監(jiān)測和及時調(diào)整治療方案都有重要意義。由于ABL激酶區(qū)突變存在跨越片段長，突變種類多達(dá)二十幾種且還存在未知突變類型，目前對于檢測BCR/ABL基因耐藥突變，只有針對某一個已知突變位點用傳統(tǒng)的RQ-PCR方法進(jìn)行檢測，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足臨床醫(yī)生對患者的全面認(rèn)識而做出正確的診斷并實施個體化的治療方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能檢測多種BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了ー組用于檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的擴(kuò)增引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. I或如SEQ ID No. 2所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No. 3所示。其中BCR/ABL融合基因P190形的擴(kuò)增引物為P190F、ABLRP190F (BCR1 號外顯子):如 SEQ ID No. I 所示5' -TCCCTCGCAGAACTCGCAAC-3' (NM_004327 :1703 1722)ABLR(AB Lll 號外顯子):如 SEQ ID No. 3 所示5' -CGAGGGAGCAATGGAGACACG-3' (M14752 :2065 2085)BCR/ABL擴(kuò)增引物P210型的擴(kuò)增引物P210F、ABLRP210F (BCR11 號外顯子):如 SEQ ID No. 2 所示5' -GCTGTCGGAGCAGGAGTCAC-3' (NM_004327 :3047 3066)ABLR (ABL11 號外顯子):如 SEQ ID No. 3 所示5' -CGAGGGAGCAATGGAGACACG-3' (M14752 :2065 2085)作為優(yōu)選，本發(fā)明所述用于檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的兩組擴(kuò)增引物同時使用，上游引物核苷酸序列如SEQID No. I和如SEQ ID No. 2所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No. 3所示。
本發(fā)明主要針對常見的M-bcr和m_bcr融合基因耐藥突變檢測,其中Μ-bcr斷裂位點主要集中在BCR第12 16號外顯子，分別命名為bl b5，表達(dá)P210融合蛋白；m_bcr斷裂位點主要集中在BCR第I號內(nèi)含子內(nèi)。目前，國際上大多數(shù)M-bcr引物都是設(shè)計在第13號外顯子或14號外顯子上，雖然能擴(kuò)增大多數(shù)的b2，b3型，但是并不能將所有的P210都擴(kuò)增出來。本發(fā)明將上游引物設(shè)計在BCR第11號外顯子，位于12號外顯子前端，在保證擴(kuò)增效率及特異性上，能夠覆蓋所有的M-bcr，即第12到第16號外顯子(bl b5)發(fā)生融合都能擴(kuò)增出來，増加檢測范圍。本發(fā)明還提供用于檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的一組測序引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No. 5所示。上游測序引物ABL1E4F(4號外顯子)5' -CCGAGTTGGTTCATCATCATTCA-3' (M14752 :951 973)下游測序引物ABL1E8R(8號外顯子)5' -GCAATACTCCAAATGCCCAGACG-3' (M14752 :1627 1649)本發(fā)明還提供用于檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的另ー組測序引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No. 7所示。上游測序引物ABL1E8F(8號外顯子)5' -CTGGGCATTTGGAGTATTGCTTTG-3' (M14752 :1630 1653)下游測序引物ABLlElORdO號外顯子)5' -TGGAGTGAGGCATCTCAGGCAC-3' (M14752 :2003 2024)作為優(yōu)選，本發(fā)明用于檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的測序引物兩組同時使用，且BCR/ABL融合基因P190和P210應(yīng)用相同的測序引物。本發(fā)明的另ー個目的是提供一種檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的方法步驟I :取DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物核苷酸序列如SEQID No. I或/和如SEQ ID No. 2所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No. 3所示；步驟2 :取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用兩組測序引物進(jìn)行測序分析，第一測序引物組，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No. 5所示；第二測序引物組，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No. 7所
/Jn ο本發(fā)明的另ー個目的是提供檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的試劑盒，包含擴(kuò)增引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. I或如SEQ IDNo. 2所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No. 3所示；第一測序引物組，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No. 5 所示；第二測序引物組，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No. 7 所示。作為優(yōu)選,本發(fā)明所述試劑盒還包含HotStarTaq DNA多聚酶。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述試劑盒還包含BigdyeV3. I。 更優(yōu)選地，本發(fā)明所述試劑盒還包含擴(kuò)增緩沖液和dNTPs。
BCR/ABL融合基因有P210 (b2a2，b3a2)，P190 (ela2)亞型，本發(fā)明將下游引物設(shè)計在ABLl第11號外顯子，保證對BCR/ABL融合基因P210型和P190型的擴(kuò)增效率，再針對其中ABL激酶區(qū)設(shè)計測序引物，從而達(dá)到特異性檢測BCR/ABL融合基因中ABL激酶區(qū)核苷酸序列的目的。本發(fā)明采用一歩法PCR反應(yīng)擴(kuò)增CML患者的BCR/ABL融合基因，用特異性的測序引物檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中ABL激酶區(qū)所有常見突變位點，在一個反應(yīng)體系中可以檢測二十多種常見的BCR/ABL耐藥突變，降低了實驗的成本，極大的提高了基因測序結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度，有著大規(guī)模推廣應(yīng)用的前景。



圖I為BCR/ABL融合基因BCR斷裂位點結(jié)構(gòu)說明圖；圖2為本發(fā)明所述BCR/ABL擴(kuò)增引物與BCR/ABL融合基因P190型的示意圖；圖3為本發(fā)明所述BCR/ABL擴(kuò)增引物與BCR/ABL融合基因210型的示意圖；圖4為本發(fā)明所述BCR/ABL測序引物與BCR/ABL融合基因(P190型、210型)的示意圖；圖5為本發(fā)明所述引物擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖；圖6為ABL1E4F(4號外顯子)第1061 1560bp正向測序圖圖7為ABL1E8F(8號外顯子)第1701 1900bp正向測序圖圖8為本發(fā)明所述方法檢測到ABL激酶區(qū)第1061 1560bpG1499A (V379I)突變的正向測序圖；圖9為本發(fā)明所述方法檢測到ABL激酶區(qū)第1061 1560bpC1308T (T315I)突變的正向測序圖；圖10為已報道引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
具體實施例方式本發(fā)明公開了ー種檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的方法及試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)エ藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品、方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技木。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步的詳細(xì)說明。實施例I :本發(fā)明所述試劑盒組成PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、高保真熱啟動酶HotStarTaq DNA多聚酶、消化酶、測序反應(yīng)體系，分別詳述如下基因序列參照美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI專業(yè)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫，BCR基因登陸號為NM_004327, ABL基因登陸號為M14752。以下引物方向均從5，到3，；BCR/ABL 擴(kuò)增引物(P190、P210 型)
P190F 擴(kuò)增引物P190F、ABLRP2IO 擴(kuò)增引物P210F、ABLRP190F (BCR1 號外顯子):如 SEQ ID No. I 所示5' -TCCCTCGCAGAACTCGCAAC-3' (NM_004327 :1703 1722)P210F (BCR11 號外顯子):如 SEQ ID No. 2 所示5' -GCTGTCGGAGCAGGAGTCAC-3' (NM_004327 :3047 3066)ABLR (ABL11 號外顯子):如 SEQ ID No. 3 所示5' -CGAGGGAGCAATGGAGACACG-3' (M14752 :2065 2085)本發(fā)明所述BCR/ABL擴(kuò)增引物與BCR/ABL融合基因P190型的示意圖見圖2，與BCR/ABL融合基因P210型的示意圖如圖3所示，數(shù)字代表外顯子序列號。優(yōu)化的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(PCR Amplification Mixture)
IOx擴(kuò)增緩沖液5μ1
25mM Mg2+2μ1
IOmM dNTPs2μ1
ΙΟμΜ正義引物1·5μ1
ΙΟμΜ反義引物1·5μ1
Taq DNA 聚合酶0·3μ1
cDNA 模板8μ1
加 ddH20 至50μ1最佳的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件第一歩95°C15min第二步94°CO. 5min56 °C O. 5min72 °C 2. 5min40cycles第三步72で 7min第四步4°C保存測序反應(yīng)體系A(chǔ)BL激酶區(qū)測序引物(P190和P210應(yīng)用相同的測序引物)上游測序引物ABL1E4F(4號外顯子):如SEQ ID No. 4所示5' -CCGAGTTGGTTCATCATCATTCA-3' (M14752 :951 973)下游測序引物ABL1E8R(8號外顯子):如SEQ ID No. 5所示5' -GCAATACTCCAAATGCCCAGACG-3' (M14752 :1627 1649)上游測序引物ABL1E8F(8號外顯子):如SEQ ID No. 6所示5' -CTGGGCATTTGGAGTATTGCTTTG-3' (M14752 :1630 1653)、
下游測序引物ABLlElORdO號外顯子):如SEQ ID No. 7所示5' -TGGAGTGAGGCATCTCAGGCAC-3' (M14752 :2003 2024)優(yōu)化的測序反應(yīng)體系(Sequencing Mixture)
BigdyeV3.14μ1 ddH203μ1
ΙΟμΜ Sequencing 引物(F, R )Ιμ
PCR產(chǎn)物2μ1測序反應(yīng)條件
94 °C 0.5min 5 O °C 0.5min 60 °C 2.Omin 25 cycles實施例2 :用本發(fā)明所述方法進(jìn)行BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點檢測取純化的CML患者患者細(xì)胞抽取RNA后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)至cDNA，用本發(fā)明所述擴(kuò)增引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增；如已知為BCR/ABL融合基因P190型，則用P190F擴(kuò)增引物P190F、ABLR進(jìn)行擴(kuò)增；已知為BCR/ABL融合基因P210型，則用P210擴(kuò)增引物P210F、ABLR進(jìn)行擴(kuò)增；如患者融合基因類型未知，則用兩套引物P190F擴(kuò)增引物、P210擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)+
>曰ο優(yōu)化的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(PCR Amplification Mixture)
IOx擴(kuò)增緩沖液5μ1
25mM Mg2+2μ1
IOmM dNTPs2μ1
ΙΟμΜ正義引物1·5μ1
ΙΟμΜ反義引物1·5μ1
Taq DNA 聚合酶0·3μ1
cDNA 模板8μ1
加 HiH2O 至50μ1最佳的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件第一步95DC15min第二步94DCO. 5min56 °C O. 5min72 °C 2. 5min
40cycles第三步72で 7min第四步4°C 保存P210、P190PCR產(chǎn)物電泳圖見圖5所示，因每例患者BCR/ABL融合基因融合位點不同，PCR產(chǎn)物片段大小為1815bp(P190型)和1899bp (P210中b3a2型)，PCR產(chǎn)物會根據(jù)基因斷裂融合位點不同而略有上下浮動。BCR/ABL融合基因ABL基因激酶區(qū)(參考基因登陸號M14752)，正常 位點，數(shù)字I 27代表可以檢測的27種常見耐藥突變1_M244V 2-L248V 3-G250E 4-Q252H/R5-Y253F/H 6-E255K/V 7-D276G 8-T277A 9-E279K10-F31IL 11-T315I 12-F317L13-L324Q 14-M343T15-A344V 16-A350V 17-M351T 18-E355G 19-F359C/V20-V379I21-F382L 22-L387M/F 23-M388L 24-H396R25-A397P 26-E450G/K 27-E459K取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，檢測到ABL激酶區(qū)第1061 1560bpG1499A (V379I)突變，其正向測序圖見圖8所不，反向測序圖略。實施例3 :用本發(fā)明所述方法進(jìn)行BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點檢測參照實施例2所述方法，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，檢測到ABL激酶區(qū)第1061 1560bpC1308T(T315I)突變，其正向測序圖見圖9所示，反向測序圖略。實施例4 :本發(fā)明所述擴(kuò)增引物與已報道引物比較實驗P190F :5’ -FCGCAAGACCGGGCAGAT-3’ (NM_004327 :1818 1834)P210F :5’ -GCATTCCGCTGACCATCAA-3’ (NM_004327 :3277 3295)ABLR :5’ -GCCATAGGTAGCAATTTCCC-3’ (M14752 :1653 1672)參照實施例2所述方法，用已報道的上述引物進(jìn)行擴(kuò)增實施例2相同的DNA樣品，其擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖如圖10所示。因每例患者BCR/ABL融合基因融合位點不同，PCR產(chǎn)物片段大小約1287bp (P190型)和1256bp (P210中b3a2型)，PCR產(chǎn)物會根據(jù)基因斷裂融合位點不同而略有上下浮動。取上述PCR產(chǎn)物用本發(fā)明所述測序引物進(jìn)行測序，未檢測到ABL激酶區(qū)突變。實施例5 :用本發(fā)明所述方法進(jìn)行BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點檢測參照實施例2所述方法，用本發(fā)明所述引物擴(kuò)增DNA樣品，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，檢測到ABL激酶區(qū)Y253H、Q252H、F317I突變，其測序圖略。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.用于檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的擴(kuò)增引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. I或如SEQ ID No. 2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
2.用于檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的擴(kuò)增引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. I和如SEQ ID No. 2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
3.用于檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的測序引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
4.用于檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的測序引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示。
5.用于檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的測序引物組，第一測序引物組，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示； 第二測序引物組，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 7 所示。
6.一種檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的方法 步驟I :取人cDNA待測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. I或/和如SEQ ID No. 2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示； 步驟2 :取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用兩組測序引物進(jìn)行測序分析，第一測序引物組，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示；第二測序引物組，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示。
7.檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的試劑盒，其特征在于，包含 擴(kuò)增引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. I或如SEQ IDNo. 2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示； 第一測序引物組，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 5 所示； 第二測序引物組，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 7 所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒,其特征在于,還包含HotStarTaqDNA多聚酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒,其特征在于,還包含BigdyeV3.I。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還包含擴(kuò)增緩沖液和dNTPs。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了用于檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的擴(kuò)增引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1或如SEQ ID No.2所示，下游引物核苷酸如SEQID No.3所示。本發(fā)明還公開一種檢測BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變位點的方法及試劑盒。本發(fā)明經(jīng)一步法PCR擴(kuò)增CML患者的BCR/ABL融合基因，再用特異性測序引物進(jìn)行測序，在一個反應(yīng)體系中可以檢測二十多種常見的BCR/ABL融合基因ABL激酶區(qū)耐藥突變，降低了實驗的成本，極大的提高了基因測序結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度，有著大規(guī)模推廣應(yīng)用的前景。
文檔編號C12Q1/68GK102676638SQ20111005442
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者何軍, 岑建農(nóng), 沈宏杰, 邱橋成 申請人:蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院