專利名稱：一種冬蟲夏草菌分生孢子蓋片制備及產(chǎn)孢動態(tài)計數(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種冬蟲夏草菌分生孢子蓋片制備及產(chǎn)孢動態(tài)計數(shù)方法。
背景技術(shù)：
在微生物學(xué)研究實驗中，細胞懸浮培養(yǎng)、分生孢子觀察、繪制生長曲線等眾多研究領(lǐng)域均需要顯微計數(shù)。分生孢子顯微計數(shù)是真菌生物學(xué)研究實驗的一項基本技術(shù)，是了解培養(yǎng)菌株產(chǎn)孢狀態(tài)，繪制產(chǎn)孢動態(tài)曲線，測定不同培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)方式、生長脅迫等對菌株產(chǎn)孢影響的重要手段。常用的計數(shù)方法有稀釋平板法、比濁 計數(shù)法、MTT比色法、血球平板計數(shù)法等。稀釋平板法和比濁計數(shù)法多針對于細菌計數(shù)，MTT比色法用于細胞計數(shù)，而血球平板計數(shù)法是真菌孢子計數(shù)中最常用的方法，但這種經(jīng)典計數(shù)方法也有局限性，要求孢子濃度大于I. 25X IO6個/mL，所以血球計數(shù)法不適合于產(chǎn)孢較少的孢子計數(shù)。冬蟲夏草[Ophiocordycepssinensis (Berk. ) G. H. Sung, J. M. Sung, Hywel-Jones&Spatafora ( = Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)]作為中國特有的傳統(tǒng)名貴藥用菌，其分生孢子的研究與活性菌劑的制備密切相關(guān)。目前，冬蟲夏草菌分生孢子的研究由于產(chǎn)孢量少、產(chǎn)孢周期長，往往達不到血球計數(shù)法的計數(shù)標準，故在培養(yǎng)觀察計數(shù)上一直沒有很好的解決辦法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種計數(shù)冬蟲夏草菌所產(chǎn)分生孢子的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)在含有至少一個孔的固體培養(yǎng)基上的每個孔處接種冬蟲夏草菌，得到接種孔；2)在步驟I)得到的每個接種孔上方均放置蓋玻片，得到蓋片平板；3)培養(yǎng)步驟2)得到的蓋片平板培養(yǎng)至長出菌落，每隔一段時間取至少3個蓋玻片計數(shù)取平均值，得到冬蟲夏草菌在不同時間產(chǎn)生的分生孢子數(shù)。出芽的分生孢子不進行計數(shù)。步驟I)中，所述至少一個孔為7個、14個或20個孔；步驟2)中，所述蓋玻片為無菌蓋玻片；步驟3)中，所述每隔一段時間取至少3個蓋玻片計數(shù)為每隔I天-5天取3-5個蓋玻片計數(shù)；步驟3)中，所述每隔一段時間取至少3個蓋玻片計數(shù)為每隔I天、3天或5天取3個蓋玻片計數(shù)。步驟I)中，每IL所述固體培養(yǎng)基按照如下方法制備(20.0-50.0)克麥麩、(10. 0-20. O)克葡萄糖、(2. 0-5. O)克蛋白胨、(1.0-3. O)克酵母提取物、200克土豆、(15. 0-20. O)克瓊脂和水混合，用水補至IL ；每IL所述固體培養(yǎng)基具體按照如下方法制備50. O克麥麩、20. O克葡萄糖、5. O克蛋白胨、3. O克酵母提取物、200克土豆、18. O克瓊脂和水混合，用水補至IL(按照中國專利ZL200510137457. 8 [姚一建、董彩虹、王波、謝雪欽(2005) —種冬蟲夏草復(fù)合培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。]配制])。步驟3)中，所述培養(yǎng)溫度為15°C _20°C，所述培養(yǎng)為靜置暗培養(yǎng)，所述培養(yǎng)時間為8天-15天；步驟3)中，所述培養(yǎng)溫度為15°C、18°C或20°C，所述培養(yǎng)時間為8天、10天或15天，所述計數(shù)采用顯微鏡觀察計數(shù)。在步驟I)前，還包括在固體培養(yǎng)基上打孔的步驟；所述孔的直徑為3_-5_，所述孔的直徑具體為5mm。所述的方法在繪制冬蟲夏草菌產(chǎn)分生孢子的動態(tài)曲線中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。 冬蟲夏草菌(Ophio cordyceps sinensis)菌株762于2008年12月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo. 2793，其分類命名為冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草菌分生孢子蓋片制備及動態(tài)計數(shù)方法，該計數(shù)方法有效的克服了冬蟲夏草菌分生孢子產(chǎn)孢量少，無法洗脫計數(shù)的缺點，客觀地展現(xiàn)了分生孢子的顯微形態(tài)和產(chǎn)孢數(shù)量，可用來繪制菌株動態(tài)產(chǎn)孢曲線，篩選大量冬蟲夏草菌株的分生孢子產(chǎn)孢能力，獲得高產(chǎn)孢菌株。此外，本發(fā)明工作效率高，每個蓋玻片都長有菌絲，可以保證都有觀察計數(shù)點；實驗程序簡化，可定點原位觀察計數(shù)，客觀地反應(yīng)冬蟲夏草菌株產(chǎn)孢周期，有助于篩選高產(chǎn)孢菌株。同時，該方法還可獲得同一微環(huán)境內(nèi)，不同菌株的產(chǎn)孢特征及動態(tài)產(chǎn)孢計數(shù)曲線，為分生孢子懸液和活性菌劑的制備奠定基礎(chǔ)?；谏鲜鰞?yōu)點，本發(fā)明有較好的研究應(yīng)用價值。


圖I為動態(tài)產(chǎn)孢曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、冬蟲夏草菌分生孢子計數(shù)—、冬蟲夏草菌的培養(yǎng)每IL冬蟲夏草菌固體專用培養(yǎng)基按照中國專利ZL200510137457. 8配制50. O克麥麩，20. O克葡萄糖，5. O克蛋白胨，3. O克酵母提取物，200克土豆，18. Og瓊脂，用水定容至1000暈升。從天然冬蟲夏草上分離純化(方法見Dong, C.-H. and Yao, Y. -J. (2008). Invitroevaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural andcultured mycelia ofCordyceps sinensis. LWT-Food Science and Technology 41(4)669-677.)得到冬蟲夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)菌株762號，該菌株已保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC No. 2793)，專利菌株。冬蟲夏草菌(Ophio cordyceps sinensis)菌株762于2008年12月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo. 2793，其分類命名為冬蟲夏草(Co rdyceps sinensis)。將上述分離純化得到的冬蟲夏草菌菌株762號CGMCC No. 2793，經(jīng)DNA提取，擴增并測序，采用冬蟲夏草專用分子數(shù)據(jù)庫進行分析，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為真正冬蟲夏草菌菌株。將冬蟲夏草菌菌株762號CGMCC No. 2793接種在裝有冬蟲夏草菌固體專用培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中心，置于18°C，黑暗條件下培養(yǎng)80天，獲得冬蟲夏草菌菌種。在含有固態(tài)培養(yǎng)基的平板上，用5mm孔徑打孔器打孔，共打7個孔。在上述每個孔的內(nèi)緣上方接種冬蟲夏草菌菌種，然后每個孔正上方蓋上無菌的18X18mm蓋玻片，18°C下置于黑暗條件下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)大約10天后開始每隔5天，在無菌條件下取出3片蓋玻片觀察其菌絲形態(tài)及動態(tài)產(chǎn)孢情況。二、冬蟲夏草菌分生孢子的觀察計數(shù)在無菌條件下取出蓋玻片，置于顯微鏡下觀察，在400倍放大倍數(shù)下，隨機選取菌絲孢子密集的區(qū)域，采用數(shù)碼攝像系統(tǒng)Axiocam MRC, Axiovision Rel. 4. 6軟件拍照成像，每次隨機選取3片，每片至少獲得20個視野(每個視野面積O. 22X0. 16mm)，計數(shù)統(tǒng)計分生孢子數(shù)量，取平均值代表該冬蟲夏草菌菌株在該時期的產(chǎn)孢能力。采用所有時間段產(chǎn)孢數(shù)據(jù)，結(jié)果如下所示10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天產(chǎn)的孢子數(shù)平均為O個、I. O個、
4.O 個、8. 2 個、16. 6 個、26. 7 個、12. 3 個、2. 6 個。以時間為橫坐標，以不同時間點的孢子數(shù)為縱坐標，繪制出該菌株的動態(tài)產(chǎn)孢曲線(如圖I所示)。實施例2、冬蟲夏草菌分生孢子計數(shù)一、冬蟲夏草菌的培養(yǎng)每IL冬蟲夏草菌固體專用培養(yǎng)基按照中國專利ZL200510137457. 8配制50. O克麥麩，20. O克葡萄糖，5. O克蛋白胨，3. O克酵母提取物，200克土豆，18. O克瓊脂，用水定容至1000毫升。從天然冬蟲夏草上分離純化得到的冬蟲夏草菌菌株762號CGMCC No. 2793。將上述分離純化得到的冬蟲夏草菌菌株762號，經(jīng)DNA提取，擴增并測序，采用冬蟲夏草專用分子數(shù)據(jù)庫進行分析，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為真正冬蟲夏草菌菌株。將冬蟲夏草菌菌株762號CGMCC No. 2793接種在裝有冬蟲夏草菌固體專用培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中心，置于18°C，黑暗條件下培養(yǎng)60天，獲得冬蟲夏草菌菌種。在含有固態(tài)培養(yǎng)基的平板上，用5mm孔徑打孔器打孔，共打14個孔。在上述每個孔的內(nèi)緣上方接種冬蟲夏草菌菌種，然后每個孔正上方蓋上無菌的12 X 12mm蓋玻片，15°C下置于黑暗條件下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)大約15天后開始每隔3天，在無菌條件下取出3片蓋玻片觀察其菌絲形態(tài)及動態(tài)產(chǎn)孢情況。二、冬蟲夏草菌分生孢子的觀察計數(shù)
在無菌條件下取出蓋玻片，置于顯微鏡下觀察，在400倍放大倍數(shù)下，隨機選取菌絲孢子密集的區(qū)域，采用數(shù)碼攝像系統(tǒng)Axiocam MRC, Axiovision Rel. 4. 6軟件拍照成像，每次隨機選取3片，每片至少獲得20個視野(每個視野面積O. 22X0. 16mm)，計數(shù)統(tǒng)計分生孢子數(shù)量，取平均值代表該冬蟲夏草菌菌株在該時期的產(chǎn)孢能力。采用所有時間段產(chǎn)孢數(shù)據(jù)，以時間為橫坐標，以不同時間點的孢子數(shù)為縱坐標，繪制出該菌株的動態(tài)產(chǎn)孢曲線。其動態(tài)產(chǎn)孢結(jié)果與實施例I趨勢一致，差異不顯著。實施例3、冬蟲夏草菌分生孢子計數(shù)一、冬蟲夏草菌的培養(yǎng)每IL冬蟲夏草菌固體專用培養(yǎng)基按照中國專利ZL200510137457. 8配制50. O克 麥麩，20. O克葡萄糖，5. O克蛋白胨，3. O克酵母提取物，200克土豆，18. O克瓊脂，用水定容至1000毫升。從天然冬蟲夏草上分離純化得到冬蟲夏草菌菌株762號CGMCC No. 2793。將上述分離純化得到的冬蟲夏草菌菌株762號，經(jīng)DNA提取，擴增并測序，采用冬蟲夏草專用分子數(shù)據(jù)庫進行分析，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為真正冬蟲夏草菌菌株。將冬蟲夏草菌菌株762號CGMCC No. 2793接種在裝有冬蟲夏草菌固體專用培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中心，置于18°C，黑暗條件下培養(yǎng)90天，獲得固體冬蟲夏草菌菌種。在含有固態(tài)培養(yǎng)基的平板上，用5mm孔徑打孔器打孔，共打20個孔。在上述每個孔的內(nèi)緣上方接種固體冬蟲夏草菌菌種，然后每個孔正上方蓋上無菌的IOX IOmm蓋玻片，20°C下置于黑暗條件下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)8天后開始每隔I天，在無菌條件下取出3片蓋玻片觀察其菌絲形態(tài)及動態(tài)產(chǎn)孢情況。二、冬蟲夏草菌分生孢子的觀察計數(shù)在無菌條件下取出蓋玻片，置于顯微鏡下觀察，在400倍放大倍數(shù)下，隨機選取菌絲孢子密集的區(qū)域，采用數(shù)碼攝像系統(tǒng)Axiocam MRC, Axiovision Rel. 4. 6軟件拍照成像，每次隨機選取3片，每片至少獲得20個視野(每個視野面積O. 22X0. 16mm)，計數(shù)統(tǒng)計分生孢子數(shù)量，取平均值代表該冬蟲夏草菌菌株在該時期的產(chǎn)孢能力。采用所有時間段產(chǎn)孢數(shù)據(jù)，以時間為橫坐標，以不同時間點的孢子數(shù)為縱坐標，繪 制出該菌株的動態(tài)產(chǎn)孢曲線。
其動態(tài)產(chǎn)孢結(jié)果與實施例I趨勢一致，差異不顯著。
權(quán)利要求
1.一種計數(shù)冬蟲夏草菌所產(chǎn)分生孢子的方法，包括如下步驟 1)在含有至少ー個孔的固體培養(yǎng)基上的每個孔處接種冬蟲夏草菌，得到接種孔； 2)在步驟I)得到的每個接種孔上方均放置蓋玻片，得到蓋片平板； 3)培養(yǎng)步驟2)得到的蓋片平板培養(yǎng)至長出菌落，每隔一段時間取至少3個蓋玻片計數(shù)取平均值，得到冬蟲夏草菌在不同時間產(chǎn)生的分生孢子數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述至少一個孔為7個、14個或20個孔； 步驟2)中，所述蓋玻片為無菌蓋玻片； 步驟3)中，所述每隔一段時間取至少3個蓋玻片計數(shù)為每隔I天-5天取3-5個蓋玻片計數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于 步驟3)中，所述每隔一段時間取至少3個蓋玻片計數(shù)為每隔I天、3天或5天取3個蓋玻片計數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 步驟I)中，每IL所述固體培養(yǎng)基按照如下方法制備(20. 0-50. O)克麥麩、(10. 0-20. O)克葡萄糖、(2. 0-5. O)克蛋白胨、(1.0-3. O)克酵母提取物、200克土豆、(15. 0-20. O)克瓊脂和水混合，用水補至IL ； 每IL所述固體培養(yǎng)基具體按照如下方法制備50. O克麥麩、20. O克葡萄糖、5. O克蛋白胨、3. O克酵母提取物、200克土豆、18. O克瓊脂和水混合，用水補至IL ； 步驟3)中，所述培養(yǎng)溫度為15°C -20°C，所述培養(yǎng)為靜置暗培養(yǎng)，所述培養(yǎng)時間為8天-15天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 步驟3)中，所述培養(yǎng)溫度為15°C、18°C或20°C，所述培養(yǎng)時間為8天、10天或15天，所述計數(shù)采用顯微鏡觀察計數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于 在步驟I)前，還包括在固體培養(yǎng)基上打孔的步驟；所述孔的直徑為3_-5_，所述孔的直徑具體為5mm。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述的方法在繪制冬蟲夏草產(chǎn)分生孢子的動態(tài)曲線中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種冬蟲夏草菌分生孢子蓋片制備及產(chǎn)孢動態(tài)計數(shù)方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)在含有至少一個孔的固體培養(yǎng)基上的每個孔處接種冬蟲夏草菌，得到接種孔；2)在步驟1)得到的每個接種孔上方均放置蓋玻片，得到蓋片平板；3)培養(yǎng)步驟2)得到的蓋片平板至長出菌落，每隔一段時間取3個蓋玻片計數(shù)，得到冬蟲夏草菌在不同時間產(chǎn)生的分生孢子數(shù)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明實驗操作簡化，通過倒置顯微鏡，可定點原位觀察計數(shù)，客觀地反應(yīng)冬蟲夏草菌菌株產(chǎn)孢周期。
文檔編號C12Q1/06GK102676631SQ20111005445
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者任蜀豫, 姚一建, 王文婧 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所