專利名稱：一種利用ldr技術檢測山羊多胎分子標記的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用LDR技術檢測山羊多胎分子標記的方法，屬于分子遺傳學領域。
背景技術：
多胎性能是畜牧生產(chǎn)的一個重要經(jīng)濟性狀，大部分綿羊和山羊是單胎，但有些品種是雙胎，甚至是一胎3羔或4羔，通過育種的方法可以提高一些品種的產(chǎn)仔數(shù)。繁殖率的遺傳力較低，通過傳統(tǒng)的育種方法，遺傳進展較慢。隨著分子遺傳學的發(fā)展，利用分子標記輔助選擇(molecular marker-as-sisted selection,MAS)育種技術可以快速提高一些單胎品種的雙胎率，或者提高其胎產(chǎn)仔數(shù)，從而大幅度提高其繁殖力。MAS是通過分子生物學技術直接分析DNA分子的一些突變位點，可以準確判斷基因型，而且不受時間的限制，可以做到早期選擇。BMP 15是一種在卵巢表達的卵母細胞生長因子，在正常情況下主要和卵巢自身產(chǎn)生的GDF9協(xié)調作用于卵泡，以自分泌或旁分泌方式影響優(yōu)勢卵泡的發(fā)育和卵母細胞的生長。在某些物種的垂體和睪丸中也發(fā)現(xiàn)BMP15少量mRNA的表達，表明其在調節(jié)哺乳動物生殖方面可能起著多重的調節(jié)作用。將BMP15基因做為多胎性狀主效候選基因研究其與山羊產(chǎn)仔數(shù)的關系對山羊的育種有重大的意義。目前檢測DNA突變位點的方法一般常用限制性片段長度多態(tài)性(Restriction FragmentLength Polymorphism,RFLP)技術禾口單鏈構象多態(tài)性(Single-StrandCon-format ionalPolymorphism,SSCP)技術，這兩種方法依靠肉眼進行結果的觀察，有時會出現(xiàn)判斷錯誤，從而影響檢測結果的可靠性。

發(fā)明內容
針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明提供了一種利用LDR技術檢測山羊多胎分子標記的方法，是利用LDR技術檢測山羊BMP15基因GenBank :EU743938中的自5 ‘端第6353處(編碼序列第901處)脫氧核糖核酸是A還是G，確定魯北白山羊的基因型，根據(jù)基因型可以判斷其產(chǎn)仔性能。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種利用LDR技術檢測山羊多胎分子標記的方法，步驟如下(1)擴增用于LDR反應包含A901G位點的片段以山羊基因組DNA為模板，在 TaqDNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNIPs存在的情況下，用引物在PCR條件下進行擴增，PCR產(chǎn)物大小為449bp，用于LDR反應；所述引物的序列如下(根據(jù)GenBank :EU743938序列設計的，包含A901G位點)上游引物CTCAGAGTGTTCAGAAGACCAAA；下游引物CTGGGCAATCATACCCTCAT；(2)進行LDR反應設計三條探針，然后進行LDR反應；所述三條探針的序列分別如下A901G_M0DIFY P-GACTTGAAAAGGGTGGAGGGAACACTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM ；A901G_A :TTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCT ；A901G_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCC ；其中，A901G_M0DIFY的末端帶有FAM修飾(藍色熒光)，5’端磷酸化，以便與其它兩條特異性探針連接；探針A901G_A的3’末端堿基與A對應，探針A901G_G的3’末端堿基與G對應；(3)分析LDR反應產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測序儀檢測，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長度與各基因型進行關聯(lián)分析，結果如下基因型AA的LDR產(chǎn)物片段長度為82bp，基因型GG的 LDR產(chǎn)物片段長度為84bp，基因型AG的LDR產(chǎn)物片段長度為82bp和84bp的混合。所述步驟(1)中PCR擴增的條件和參數(shù)為PCR 反應采用 20 μ IQiagen 系包括 2. 0 μ 1 PCR-buffer (10 X), 0. 6 μ 1 Mg2+(IOOmM)，2· 0 μ IdNTP (20mM/each), 0. 2 μ 1 Taq 酶(5U/μ 1)，4· 0μ 1 Q-solution (4Χ), 0. 4 μ 1 primer (5ρΜ)，1· 0 μ 1 基因組 DNA (50ng/L)，最后加入 9. 8 μ 1 去離子水。PCR 程序為95°C變性 15min，94°C 30s，59°C lm，72°C lm，;35 個循環(huán)，最后 72°C延伸 7min。反應結束后，取2μ 1反應產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE中電泳，得到一條清晰的449bp的DNA條帶。所述步驟O)中LDR反應的具體步驟為在200μ 1 的 PCR 反應管中，分別加入 1 μ 1 buffer(IOX), 1 μ 1 Probe Mix(各 Probe等比混合),0. 05μ 1連接酶(40U/ μ 1),6. 95 μ 1去離子水，最后加入1 μ 1 PCR反應產(chǎn)物。連接反應程序為95°C變性2m，94°C 30s,60°C 2min，;35個循環(huán)。LDR反應產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測序儀檢測，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長度判斷各基因型。上述分析后，可根據(jù)基因判斷產(chǎn)仔性能BMP15基因A901G突變位點的基因型對對魯北白山羊產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響(P <0.05)，各基因型效應值依次為GGQ. 5621) > AG(2. 5350) > AA(2. 2257), GG型的產(chǎn)羔數(shù)比AA型多0. 33只，AG型比AA型多0. 31只， BMP15基因A901G突變位點可以做為魯北白山羊的多胎分子標記。本發(fā)明的利用LDR技術檢測山羊多胎分子標記的方法，以堿基錯配為基礎，使用特異性探針對特定片段DNA進行識別，具有很高的準確性。同時，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。結果分析直接由軟件分析，客觀性強，避免用肉眼判斷電泳圖的主觀誤差及酶切不完全造成的判斷錯誤。與其他SNP檢測技術相比，LDR檢測技術擁有準確度高、通用性強、通量大、操作簡單、成本低等優(yōu)點。


圖1 :BMP15基因用于LDR分析的PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖。圖 2 :BMP15 基因 A901G 位點 LDR 圖譜。圖3 山羊BMP 15突變位點。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1利用LDR技術檢測山羊多胎分子標記對魯北白山羊進行檢測，步驟如下(1)擴增用于LDR反應包含A901G位點的片段以山羊基因組DNA為模板，在 TaqDNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNIPs存在的情況下，用引物在PCR條件下進行擴增，PCR產(chǎn)物大小為449bp，與目的片段完全一致，如圖1所示，用于LDR反應；所述引物的序列如下(根據(jù)GenBank :EU743938序列設計的，包含A901G位點)上游引物CTCAGAGTGTTCAGAAGACCAAA；下游引物CTGGGCAATCATACCCTCAT；PCR擴增的條件和參數(shù)為PCR 反應采用 20 μ IQiagen 系包括 2. 0 μ 1 PCR-buffer (10 X), 0. 6 μ 1 Mg2+(IOOmM)，2· 0 μ IdNTP (20mM/each), 0. 2 μ 1 Taq 酶(5U/μ 1)，4· 0μ 1 Q-solution (4Χ), 0. 4 μ 1 primer (5ρΜ)，1· 0 μ 1 基因組 DNA (50ng/L)，最后加入 9. 8 μ 1 去離子水。PCR 程序為95°C變性 15min，94°C 30s，59°C lm，72°C lm，;35 個循環(huán)，最后 72°C延伸 7min。反應結束后，取2μ 1反應產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE中電泳，得到一條清晰的449bp的DNA條帶，凝膠電泳結果如圖1。(2)進行LDR反應設計三條探針，然后進行LDR反應；所述三條探針的序列分別如下A901G_M0DIFY P-GACTTGAAAAGGGTGGAGGGAACACTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM ；A901G_A :TTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCT ；A901G_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCC ；其中，A901G_M0DIFY的末端帶有FAM修飾(藍色熒光)，5’端磷酸化，以便與其它兩條特異性探針連接；探針A901G_A的3’末端堿基與A對應，探針A901G_G的3’末端堿基與G對應；LDR反應的具體步驟為在200μ 1 的 PCR 反應管中，分別加入 1 μ 1 buffer(IOX), 1 μ 1 Probe Mix(各 Probe等比混合),0. 05μ 1連接酶(40U/ μ 1),6. 95 μ 1去離子水，最后加入1 μ 1 PCR反應產(chǎn)物。連接反應程序為95°C變性2m，94°C 30s,60°C 2min，;35個循環(huán)。(3)分析LDR反應產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測序儀檢測，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長度與各基因型進行關聯(lián)分析，關聯(lián)如下基因型AA的LDR產(chǎn)物片段長度為82bp，基因型GG的 LDR產(chǎn)物片段長度為84bp，基因型AG的LDR產(chǎn)物片段長度為82bp和84bp的混合，如圖2 所示。(4)測序結果測序結果顯示BMP15基因GenBank :EU743938序列第6353bp (編碼序列第901bp)發(fā)生了 A-G突變，如圖3所示。
權利要求
1.一種利用LDR技術檢測山羊多胎分子標記的方法，其特征在于，步驟如下(1)擴增用于LDR反應包含A901G位點的片段以山羊基因組DNA為模板，在TaqDNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNIPs存在的情況下，用引物在PCR條件下進行擴增，PCR產(chǎn)物大小為 449bp，用于LDR反應；所述引物的序列如下 上游引物CTCAGAGTGTTCAGAAGACCAAA ； 下游引物CTGGGCAATCATACCCTCAT ；(2)進行LDR反應設計三條探針，然后進行LDR反應；所述三條探針的序列分別如下 A901G_M0DIFY P-GACTTGAAAAGGGTGGAGGGAACACTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM ； A901G_A :TTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCT ； A901G_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCC ； 其中，A901G_M0DIFY的末端帶有FAM修飾，5，端磷酸化；(3)分析LDR反應產(chǎn)物由ABIPRISM-377DNA測序儀檢測，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長度與各基因型進行關聯(lián)分析，關聯(lián)如下基因型AA的LDR產(chǎn)物片段長度為82bp，基因型GG的LDR產(chǎn)物片段長度為84bp，基因型AG的LDR產(chǎn)物片段長度為82bp和84bp的混合。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種利用LDR技術檢測山羊多胎分子標記的方法，其特征在于所述步驟(1)中PCR擴增的條件和參數(shù)為PCR反應采用20 μ IQiagen體系，包括 2. 0 μ lPCR-buffer (10 X), 0. 6 μ 1 Mg2+(IOOmM), 2. 0 μ 1 dNTP (20mM/each), 0. 2 μ 1 Taq 酶 (5U/y 1)，4·0μ lQ-solution (4Χ) ,0. 4μ 1 primer (5ρΜ), 1. 0μ 1 基因組 DNA (50ng/L)，最后加入9. 8μ 1去離子水；PCR 程序為95°C 變性 15min，94°C 30s，59°C lm, 72 °C lm，；35 個循環(huán)，最后 72 °C 延伸 7min ；反應結束后，取2 μ 1反應產(chǎn)物在3. 0%瓊脂糖凝膠，0. 5 X TBE中電泳，得到一條清晰的 449bp的DNA條帶。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種利用LDR技術檢測山羊多胎分子標記的方法，其特征在于所述步驟⑵中LDR反應的具體步驟為在200 μ 1的PCR反應管中，分別加入 1 μ Ibuffer(IOX), 1 μ 1 Probe Mix (各 Probe 等比混合)，0· 05 μ 1 連接酶 0OU/μ 1)， 6. 95 μ 1去離子水，最后加入1μ 1 PCR反應產(chǎn)物。連接反應程序為95°C變性an，94°C30s， 60°C 2min,35 個循環(huán)；LDR反應產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測序儀檢測，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長度判斷各基因型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用LDR技術檢測山羊多胎分子標記的方法，步驟如下(1)擴增用于LDR反應包含A901G位點的片段以山羊基因組DNA為模板，在TaqDNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNTPs存在的情況下，用引物在PCR條件下進行擴增，用于LDR反應；(2)進行LDR反應設計三條探針，然后進行LDR反應；(3)分析LDR反應產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測序儀檢測，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長度與各基因型進行關聯(lián)分析。本發(fā)明的利用LDR技術檢測山羊多胎分子標記的方法，以堿基錯配為基礎，使用特異性探針對特定片段DNA進行識別，具有很高的準確性。與其他SNP檢測技術相比，LDR檢測技術擁有準確度高、通用性強、通量大、操作簡單、成本低等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102174656SQ20111005536
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月9日 優(yōu)先權日2011年3月9日
發(fā)明者劉學俊, 李淑青, 王會珍, 董傳河 申請人:山東省農(nóng)業(yè)管理干部學院