專利名稱：一種利用ldr技術(shù)檢測(cè)中國(guó)荷斯垣牛乳脂率分子標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)中國(guó)荷斯垣牛乳脂率分子標(biāo)記的方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
產(chǎn)奶性狀是奶牛業(yè)中的重要經(jīng)濟(jì)性狀。傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為奶牛的產(chǎn)奶性狀(包括產(chǎn)乳量、乳脂量、蛋白含量、乳脂率、乳蛋白率等)為數(shù)量性狀，由微效多基因決定， 并受到環(huán)境因素的影響。由于不能對(duì)單個(gè)微效基因的效應(yīng)直接進(jìn)行觀察和測(cè)定，因而只能借助統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)來(lái)描述數(shù)量性狀的遺傳性質(zhì)。這種研究方法在動(dòng)物的遺傳改良中發(fā)揮了巨大的作用，但它不可能將環(huán)境因素完全剔除，有一定偏差。分子遺傳學(xué)和DNA分析技術(shù)的飛速發(fā)展，使DNA分子遺傳標(biāo)記如單核普酸多態(tài)性 (singlenueleoticbpolymo印hisms，SNps)被廣泛應(yīng)用于遺傳育種研究的各個(gè)領(lǐng)域。在奶牛的產(chǎn)奶性狀上，把靈敏度極高的一些DNA分析手段應(yīng)用于奶牛育種中，其主要目的是在DNA分子水平上尋找與奶牛產(chǎn)奶性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，用于奶牛的標(biāo)記輔助選擇 (markerassistantseleetior^MAS)，實(shí)現(xiàn)早期選擇，加快育種速度。奶牛分子育種是未來(lái)奶牛品種改良的主要手段催乳素(I^olactin，PRL)作為垂體前葉分泌的一種可促進(jìn)乳腺泌乳的肽類激素， 具有廣泛而多樣的生理作用，如繁殖、泌乳、生長(zhǎng)、代謝、維持滲透壓及免疫調(diào)節(jié)等。對(duì)奶牛的乳腺發(fā)育、泌乳及乳蛋白基因的表達(dá)方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。大量研究表明PRL基因第4外顯子A8398G突變位點(diǎn)對(duì)中國(guó)荷斯垣牛的產(chǎn)奶性狀相關(guān)，把其做為分子標(biāo)記應(yīng)用于奶牛的育種具有重要的意義。目前檢測(cè)DNA突變位點(diǎn)的方法一般常用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction FragmentLength Polymorphism,RFLP)技術(shù)禾口單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-StrandCon-format ionalPolymorphism,SSCP)技術(shù)，這兩種方法依靠肉眼進(jìn)行結(jié)果的觀察，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)判斷錯(cuò)誤，從而影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)中國(guó)荷斯垣牛乳脂率分子標(biāo)記的方法，是利用LDR技術(shù)檢測(cè)中國(guó)荷斯垣牛PRL基因GenBank :AF426315中的自5 ‘端第8398處脫氧核糖核酸是A還是G，確定中國(guó)荷斯垣牛的基因型，根據(jù)基因型可以判斷其產(chǎn)乳性能。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)中國(guó)荷斯垣牛乳脂率的方法，步驟如下(1)擴(kuò)增用于LDR反應(yīng)包含A8398G位點(diǎn)的片段以中國(guó)荷斯垣牛A8398G基因組 DNA為模板，在TaqDNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNTPs存在的情況下，用引物在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物大小為156bp，用于LDR反應(yīng)； 所述引物的序列如下(根據(jù)GenBank :AF426315序列設(shè)計(jì)的，包含A8398G位點(diǎn))
上游引物GAGCTTGATTCTTGGGTTGC ；下游引物ATCATCTCCATGCCTTCCAG；(2)進(jìn)行LDR反應(yīng)設(shè)計(jì)三條探針，然后進(jìn)行LDR反應(yīng)；所述三條探針的序列分別如下A8398G MODIFY P-ACCTCGGTGACTAGGTGATACAGAGTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM ；A8398G_A :TTTTTTTTTTTTTTTTATCTGGGGCTCCTTTCATACCCCGT ；A8398G_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTATCTGGGGCTCCTTTCATACCCCGC其中，A8398G_M0DIFY的末端帶有FAM修飾(藍(lán)色熒光)，5，端磷酸化，以便與其它兩條特異性探針連接；探針A8398G_A的3’末端堿基與A對(duì)應(yīng)，探針A8398G_G的3’末端堿基與G對(duì)應(yīng)；(3)分析LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與各基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如下基因型AA的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為82bp，基因型GG的 LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為84bp，基因型AG的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為82bp和84bp的混合。所述步驟(1)中PCR擴(kuò)增的條件和參數(shù)為PCR 反應(yīng)采用 20 μ IQiagen 系包括 2. 0 μ 1 PCR-buffer (10 X), 0. 6 μ 1 Mg2+(IOOmM)，2· 0 μ IdNTP (20mM/each), 0. 2 μ 1 Taq 酶(5U/μ 1)，4· 0μ 1 Q-solution (4Χ), 2. 0 μ 1 primer (5ρΜ)，1· 0 μ 1 基因組 DNA (50ng/L)，最后加入 8. 2 μ 1 去離子水。PCR 程序?yàn)?5°C變性 15min，94°C 30s，59°C lm，72°C lm，;35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 7min。反應(yīng)結(jié)束后，取2μ 1反應(yīng)產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE中電泳，得到一條清晰的的DNA條帶。所述步驟O)中LDR反應(yīng)的具體步驟為在200μ 1 的 PCR 反應(yīng)管中，分別加入 1 μ 1 buffer(IOX), 1 μ 1 Probe Mix(各 Probe等比混合),0. 05μ 1連接酶(40U/ μ 1),6. 95 μ 1去離子水，最后加入1 μ 1 PCR反應(yīng)產(chǎn)物。連接反應(yīng)程序?yàn)?5°C變性2m，94°C 30s,60°C 2min，;35個(gè)循環(huán)。LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長(zhǎng)度判斷各基因型。上述分析后，可根據(jù)基因判斷中國(guó)荷斯垣牛乳脂率PRL基因A8398G突變位點(diǎn)的基因型對(duì)對(duì)中國(guó)荷斯垣牛乳脂率有顯著影響(P < 0. 05)，各基因型效應(yīng)值依次為AA (4. 40) > GA (3. 77) >GG(3. 72)，AA型的乳脂率比GA型多 0. 63，比 GG型多 0. 68 只，PRL基因 A8398G 突變位點(diǎn)可以做為中國(guó)荷斯垣牛乳脂率分子標(biāo)記。本發(fā)明的利用LDR技術(shù)檢測(cè)中國(guó)荷斯垣牛乳脂率分子標(biāo)記的方法，以堿基錯(cuò)配為基礎(chǔ)，使用特異性探針對(duì)特定片段DNA進(jìn)行識(shí)別，具有很高的準(zhǔn)確性。同時(shí)，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽(yáng)性低。結(jié)果分析直接由軟件分析，客觀性強(qiáng)，避免用肉眼判斷電泳圖的主觀誤差及酶切不完全造成的判斷錯(cuò)誤。與其他SNP檢測(cè)技術(shù)相比，LDR檢測(cè)技術(shù)擁有準(zhǔn)確度高、通用性強(qiáng)、通量大、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。


圖1 :PRL基因用于LDR分析的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。圖2 =PRL基因A8398G突變位點(diǎn)LDR圖譜。圖3 =PRL基因A8398G突變位點(diǎn)測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1利用LDR技術(shù)檢測(cè)中國(guó)荷斯垣牛乳脂率分子標(biāo)記對(duì)中國(guó)荷斯垣牛乳脂率進(jìn)行檢測(cè)，步驟如下(1)擴(kuò)增用于LDR反應(yīng)包含A8398G位點(diǎn)的片段以中國(guó)荷斯垣牛A8398G基因組 DNA為模板，在TaqDNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNTPs存在的情況下，用引物在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物大小為156bp，用于LDR反應(yīng)；所述引物的序列如下(根據(jù)GenBank :AF426315序列設(shè)計(jì)的，包含A8398G位點(diǎn))上游引物GAGCTTGATTCTTGGGTTGC；下游引物ATCATCTCCATGCCTTCCAG；PCR擴(kuò)增的條件和參數(shù)為PCR 反應(yīng)采用 20 μ IQiagen 系包括 2. 0 μ 1 PCR-buffer (10 X), 0. 6 μ 1 Mg2+(IOOmM)，2· 0 μ IdNTP (20mM/each), 0. 2 μ 1 Taq 酶(5U/μ 1)，4· 0μ 1 Q-solution (4Χ), 2. 0 μ 1 primer (5ρΜ)，1· 0 μ 1 基因組 DNA (50ng/L)，最后加入 8. 2 μ 1 去離子水。PCR 程序?yàn)?5°C變性 15min，94°C 30s，59°C lm，72°C lm，;35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 7min。反應(yīng)結(jié)束后，取2μ 1反應(yīng)產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE中電泳，得到一條清晰的156bp的DNA條帶。凝膠電泳結(jié)果如圖1。(2)進(jìn)行LDR反應(yīng)設(shè)計(jì)三條探針，然后進(jìn)行LDR反應(yīng)；所述三條探針的序列分別如下A8398G_M0DIFY P-ACCTCGGTGACTAGGTGATACAGAGTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM ；A8398G_A :TTTTTTTTTTTTTTTTATCTGGGGCTCCTTTCATACCCCGT ；A8398G_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTATCTGGGGCTCCTTTCATACCCCGC ；其中，A8398G_M0DIFY的末端帶有FAM修飾(藍(lán)色熒光)，5’端磷酸化，以便與其它兩條特異性探針連接；探針A8398G_A的3’末端堿基與A對(duì)應(yīng)，探針A8398G_G的3’末端堿基與G對(duì)應(yīng)；LDR反應(yīng)的具體步驟為在200μ 1 的 PCR 反應(yīng)管中，分別加入 1 μ 1 buffer(IOX), 1 μ 1 Probe Mix(各 Probe等比混合),0. 05μ 1連接酶(40U/ μ 1),6. 95 μ 1去離子水，最后加入1 μ 1 PCR反應(yīng)產(chǎn)物。連接反應(yīng)程序?yàn)?5°C變性2m，94°C 30s,60°C 2min，;35個(gè)循環(huán)。(3)分析LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與各基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如下基因型AA的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為82bp，基因型GG的 LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為84bp，基因型AG的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為82bp和84bp的混合。如圖2 所示。 (4)測(cè)序結(jié)果測(cè)序結(jié)果顯示PRL基因GenBank :AF426315序列第8398bp發(fā)生了 A-G突變。如圖3所示。
權(quán)利要求
1.一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)中國(guó)荷斯垣牛乳脂率分子標(biāo)記的方法，其特征在于，步驟如下(1)擴(kuò)增用于LDR反應(yīng)包含A8398G位點(diǎn)的片段以中國(guó)荷斯垣牛A8398G基因組DNA為模板，在TaqDNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNTPs存在的情況下，用引物在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物大小為156bp，用于LDR反應(yīng)；所述引物的序列如下 上游引物:GAGCTTGATTCTTGGGTTGC ； 下游引物ATCATCTCCATGCCTTCCAG ；(2)進(jìn)行LDR反應(yīng)設(shè)計(jì)三條探針，然后進(jìn)行LDR反應(yīng)；所述三條探針的序列分別如下 A8398G_M0DIFY P-ACCTCGGTGACTAGGTGATACAGAGTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM ； A8398G_A :TTTTTTTTTTTTTTTTATCTGGGGCTCCTTTCATACCCCGT ； A8398G_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTATCTGGGGCTCCTTTCATACCCCGC ； 其中，A8398G_M0DIFY的末端帶有FAM修飾，5，端磷酸化；探針A8398G_A的3，末端堿基與A對(duì)應(yīng)，探針A8398G_G的3’末端堿基與G對(duì)應(yīng)；(3)分析LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABIPRISM-377DNA測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與各基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如下基因型AA的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為82bp，基因型GG的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為84bp，基因型AG的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為82bp和84bp的混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)中國(guó)荷斯垣牛乳脂率分子標(biāo)記的方法，其特征在于所述步驟(1)中PCR擴(kuò)增的條件和參數(shù)為PCR 反應(yīng)采用 20 μ IQiagen 系包括 2. 0 μ 1 PCR-buffer (10 X)，0· 6 μ 1 Mg2+(IOOmM)， 2. 0 μ IdNTP (20mM/each), 0. 2 μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ,4. 0 μ 1 Q-solution (4 X ), 2. 0 μ 1 primer (5ρΜ)，1· 0 μ 1 基因組 DNA (50ng/L)，最后加入 8. 2 μ 1 去離子水；PCR 程序?yàn)?5°C 變性 15min，94°C 30s，59°C lm, 72 °C lm，；35 個(gè)循環(huán)，最后 72 °C 延伸 7min ；反應(yīng)結(jié)束后，取2 μ 1反應(yīng)產(chǎn)物在3. 0%瓊脂糖凝膠，0. 5 X TBE中電泳，得到一條清晰的 156bp的DNA條帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)中國(guó)荷斯垣牛乳脂率分子標(biāo)記的方法，其特征在于所述步驟O)中LDR反應(yīng)的具體步驟為在 200μ 1 的 PCR 反應(yīng)管中，分別加入 1 μ 1 buffer(IOX), 1 μ 1 Probe Mix(各 Probe 等比混合)，0. 05 μ 1連接酶(40U/ μ 1),6. 95μ 1去離子水，最后加入1 μ 1 PCR反應(yīng)產(chǎn)物。 連接反應(yīng)程序?yàn)?5°C變性2m，94°C 30s, 60°C 2min,35個(gè)循環(huán)；LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長(zhǎng)度判斷各基因型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)中國(guó)荷斯垣牛乳脂率分子標(biāo)記的方法，其特征在于，步驟如下(1)擴(kuò)增用于LDR反應(yīng)包含A8398G位點(diǎn)的片段以中國(guó)荷斯垣牛A8398G基因組DNA為模板，在TaqDNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNTPs存在的情況下，用引物在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，用于LDR反應(yīng)；(2)進(jìn)行LDR反應(yīng)設(shè)計(jì)三條探針，然后進(jìn)行LDR反應(yīng)；(3)分析LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與各基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。本發(fā)明的利用LDR技術(shù)檢測(cè)中國(guó)荷斯垣牛乳脂率分子標(biāo)記的方法，以堿基錯(cuò)配為基礎(chǔ)，使用特異性探針對(duì)特定片段DNA進(jìn)行識(shí)別，具有很高的準(zhǔn)確性與其他SNP檢測(cè)技術(shù)相比，LDR檢測(cè)技術(shù)擁有準(zhǔn)確度高、通用性強(qiáng)、通量大、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102181524SQ20111005629
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者劉學(xué)俊, 李淑青, 王會(huì)珍, 董傳河 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)管理干部學(xué)院