專利名稱：南海紅樹林內(nèi)生真菌bl321的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利涉及一株產(chǎn)抗腫瘤活性化合物的南海紅樹林內(nèi)生真菌，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
紅樹林是熱帶和亞熱帶沿海地區(qū)特有的植物群落，紅樹林真菌是共生于其中的一個(gè)特殊群體，由于其獨(dú)特的生存環(huán)境，能夠產(chǎn)生出許多結(jié)構(gòu)新穎的代謝產(chǎn)物，成為目前研究最多和最系統(tǒng)的海洋真菌，目前已分離鑒定的紅樹林真菌超過200種，隨著對(duì)其研究的深入，紅樹林內(nèi)生真菌作為一種海洋微生物資源，許多結(jié)構(gòu)新穎、生物活性良好的次級(jí)代謝產(chǎn)物不斷被報(bào)道，已成為海洋藥物開發(fā)的一種重要資源[林永成，周世寧，《海洋微生物及其代謝產(chǎn)物》，北京化工出版社，2003。劉愛榮，吳曉鵬，徐同，紅樹林內(nèi)生真菌研究 進(jìn)展，廢原生態(tài)學(xué)報(bào)，2007,18(4) :912-918。]
對(duì)于紅樹林真菌辦sp.，我們先后從辦hria sp. 2508菌株中發(fā)現(xiàn)了具有鈣離子通道抑制作用的Xyloketal A、B、F，其中Xyloketal F的最大最強(qiáng)抑制濃度達(dá)至Ij 0.03 μ M，[X. -Y. ffu, X. -H. Liu, Y. -C, Lin, J. -H. Luo, Ζ. -G. She, H. -J. Li, L. -ff. Chan, S. Antus, T. Kurtan, B. Elsasser, K. ￥,ro\m,Eur. J. Org. Chem. 2005, 4061-4064.]和具有對(duì) DNA 親和性的 xylopyridine A[Xu Fang. Pang Jiyang, et al. Chinese Journal of Chemistry, 2009，27, 365-368]等活性天然化合物。Xylaria sp. BL321是一株產(chǎn)抗腫瘤天然產(chǎn)物的內(nèi)生真菌，對(duì)其深入研究，有助對(duì)該方面先導(dǎo)化合物的認(rèn)識(shí)與開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可產(chǎn)生抗腫瘤化合物的南海紅樹林內(nèi)生真菌BL321。本發(fā)明的另一目的在于保護(hù)南海紅樹林內(nèi)生真菌BL321在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
本發(fā)明提供了南海紅樹林內(nèi)生菌BL321，采自廣東陽江紅樹林海岸帶白欖樹葉，經(jīng)鑒定為鹿角菌屬a>7ariasp.)，于2010年12月20日寄存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)， 菌種保藏號(hào)為CCTCC M 2010357，該菌株的16S rDNA的Genbank登錄號(hào)為HM569607 ；該菌生物學(xué)特性為菌落表面為乳白色細(xì)絲羽絨狀，背面為麥黃色，匍匐擴(kuò)散型生長，無孢子生成，為好氧型真菌；其所產(chǎn)部分新型化合物具有明顯的抗腫瘤活性。該內(nèi)生真菌BL321的基因序列如SEQ ID NO 1所示
1 tagaggaagt aaaagtcgta acaaggtctc cgttggtgaa ccagcggagg gatcattaaa 61 gagttatcat aactcctaaa acccatgtga accttacctt tgttgcctcg gcaggtctgc 121 agcttaccct gtaagcacct accctgtagg tactttaccc ggtagttgta ggaaagaaac 181 ctgccggtgg tatattaaaa aaacctcttt gtttgttatg ttattctgaa ttctataatt241 aataaagtta aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc 301 gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac 361 attgcgccca ttagtattct agtgggcatg cctgttcgag cgtcatttca acccttaagc 421 cctcgttgct tagcgttggg agcttacaaa acaacccttt gtagttcctt aaagttagtg 481 gcggagttgg tttcacactc tagacgtagt aagatttatt atctcgccta tagatgagcc 541 ggtctcctgc cgtaaaaacc cccttacttc ttaaaggttg acctcggatc aggtaggaat 601 acccgctgaa cttaagcata tcaatagccg ggaggaaa 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
(1)南海紅樹林內(nèi)生真菌BL321產(chǎn)獨(dú)特結(jié)構(gòu)的化合物，經(jīng)測(cè)試，部分化合物具有高效的腫瘤細(xì)胞抑制作用。(2)本發(fā)明生產(chǎn)成本低，節(jié)能環(huán)保，是開發(fā)新型天然藥物的理想載體。 (3)本發(fā)明生產(chǎn)周期短，分離制備較容易，易于擴(kuò)大生產(chǎn)。
具體實(shí)施例實(shí)施例1.
菌種的分離與保藏。將采來的白欖樹葉表面徹底消毒后，在超凈臺(tái)內(nèi)將其剪碎，放入預(yù)先準(zhǔn)備好的無菌水中浸泡十分鐘，用浸提液涂布于PDA平板上，28°C靜置培養(yǎng)5-7天，等菌長出后，挑取單個(gè)菌落二次涂布平板，直到所長菌落為單一菌落為止。于PDA斜面內(nèi)4°C保藏。BL321的菌落形態(tài)為無包子生成的乳白色細(xì)絲羽絨狀，背面為麥黃色，匍匐擴(kuò)散型生長。實(shí)施例2. 菌種BL321的鑒定。將BL321從PDA斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入PDA平皿培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)5_7天，形成白色匍匐菌絲，刮去菌絲體，用真菌DNA提取試劑盒提取DNA。提取的DNA用ITS4RATSiF 50 μ L反應(yīng)體系，擴(kuò)增 ITS-rRNA。反應(yīng)條件為 94°C 3min，35 次循環(huán)-MV 30s, 50°C 30s, 72°C lmin, 72°C8min。DNA鑒定用DNA雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)基因文庫檢索比對(duì)為Max index為91%， 確定為鹿角菌。實(shí)施例3.
活性成分的提取與分離。B321從斜面活化后，將帶有菌絲體的瓊脂快接種于含250mL GYT培養(yǎng)基的500mL 三角瓶中，在28°C下，搖床rpm 120，培養(yǎng)5_7天，在對(duì)數(shù)生長期轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)，每個(gè)含500mL GYT培養(yǎng)基的IL三角瓶接種lmL，在28°C下，搖床rpm 120，培養(yǎng)5_7天(或靜置30天)，收取菌體。菌體經(jīng)干燥粉碎后，用3倍體積乙酸乙酯(EA)萃取5次，萃取液濃縮后用EA/石油醚(PE)以10%的梯度進(jìn)行柱色譜層析，得到極性EA/PE在40%左右的組分，組分經(jīng)濃縮、 重結(jié)晶后得含量在80%左右的已知艾里莫芬烷類的倍半萜化合物S6-2 (07H239-A)，其每升發(fā)酵液的產(chǎn)量達(dá)到20mg左右，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步色譜柱層析和HPLC，在極性為甲醇水 乙酸=75:25:0. 1、流速為1. 5mL/min、254nm波長檢測(cè)的條件下，又得到同系列的4個(gè)微量新化合物。初步檢測(cè)部分化合物具有明顯的抗腫瘤活性和α-葡萄糖甘酶的激活活性。 07Η239-Α曾有報(bào)道其對(duì)24株腫瘤細(xì)胞的平均IC5tl為3. 2 μ g/mL [L. A. McDonald, L. R. Barbieri, V. S. Bernan, J. Janso, P. Lassota, G. T. Garter, J. Nat. Prod. 2004, 67, 1565.]。
權(quán)利要求
1.南海紅樹林內(nèi)生菌BL321，為分自廣東陽江紅樹林海岸帶白欖樹葉的內(nèi)生真菌， 經(jīng)鑒定為鹿角菌屬(Jylariasv.)，于2010年12月20日寄存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，菌種保藏號(hào)為CCTCC M 2010357，該菌株的16S rDNA的Genbank登錄號(hào)為 HM569607 ；該菌生物學(xué)特性為菌落表面為乳白色細(xì)絲羽絨狀，背面為麥黃色，匍匐擴(kuò)散型生長，無孢子生成，為好氧型真菌。
2.如權(quán)利要求1所述的南海紅樹林內(nèi)生菌BL321在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的南海紅樹林內(nèi)生菌BL321，其特征在于其基因序列如SEQID NO 1所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種南海紅樹林內(nèi)生真菌，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域。所用菌株為BL321，經(jīng)鑒定為鹿角菌屬(Xylariasp.)，菌種保藏號(hào)為CCTCCM2010357，該菌株的16SrDNA的Genbank登錄號(hào)為HM569607。主要生物學(xué)特性為該菌菌落表面為乳白色細(xì)絲羽絨狀，背面為麥黃色，匍匐擴(kuò)散型生長，無孢子生成，為好氧型真菌，其所產(chǎn)部分新型化合物具有明顯的抗腫瘤活性。本發(fā)明生產(chǎn)方便，成本低，節(jié)能環(huán)保，是開發(fā)新型天然藥物的一種理想載體。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102181370SQ20111006238
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者劉嵐, 宋永相, 林永成, 王軍 申請(qǐng)人:中山大學(xué)