專利名稱：一種凋落物總dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及凋落物分子生物學(xué)，具體的說是ー種凋落物總DNA的提取方法。
背景技術(shù)：
隨著DNA分子標記技術(shù)和重組DNA技術(shù)的發(fā)展，制備完整、純度高的基因組DNA日益顯得重要。我們在進行一個物種DNA水平上的研究時，首先遇到的問題就是如何快速、簡單、成本不高的獲得較完整、純度較高的基因組DNA。由于植物細胞與動物細胞不同，具有一層堅硬的細胞壁，且含有較多的多糖、色素、脂質(zhì)和多酚等物質(zhì)，給植物DNA提取帶來很多困難，特別是多糖和多酚類物質(zhì)不容易與DNA分開。相對于植物新鮮樣品，凋落物中植物的次生代謝產(chǎn)物類含量更高，高質(zhì)量基因組DNA提取更難。為了去除多糖類物質(zhì)對后續(xù) 研究的干擾，過去采用費事且價格昂貴的氯化銫密度梯度離心技術(shù)(Murray M G,ThompsonW F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J」· Nucleic Acids Res.,1980,8(19) :4321-4325.) 0從上世紀90年代以來，很多的文獻報道過利用CTAB法提取植物基因組DNA(李希臣，雷學(xué)鈞，盧翠花，等.高效的植物DNA提取方法[J].生物技術(shù)，1994,4(3) :39-41.;盧揚江,鄭康樂.提取水稻DNA的一種簡易方法[J].中國水稻科學(xué)，1992,6(1) :47-48.;鄒喻蘋，汪小全，雷一丁，等.幾種瀕危植物及其近緣類群總DNA的提取與鑒定[J]·植物學(xué)報，1994，36 (7) :528-533. ；Cheng FS, Brown SK, Weeden N F. ADNAextraction protocol from various tissues in woody species[J]. HortScience,1997,32(5) :921-922. ；Edwards K, Johnstone C, Thomson J. A simple and rapid method forthe preparation of plant genomie DNA for PCR analysis[J]. Nucleic Acids Res,1991,19(6) :1349. ；Thomson D, Henry R. Use of DNA from dry leaves for PCRandRAPDanalysis [J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1993,11 (3) :202-206.;王軍，賀普超.山葡萄基因組DNA提取及RAPD鑒定[J].果樹科學(xué)，2000，17 (2) :79-82.)，所提取的DNA可用于RAPD，ISSR等標記研究。但是對于凋落物基因組DNA的提取未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供ー種凋落物總DNA的提取方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為I)將已研成粉末、預(yù)冷的凋落物加入于CTAB提取緩沖液中混勻(Ig 2g粉末加入 500ul 650 μ LCTAB)，于 64-66 °C水浴 5-lOmin ;而后以 12000-13000r · mirT1 離心5-10min，收集沉淀，待用；2)將步驟I)所得沉淀加入到過量的CTAB提取緩沖液混勻，64_66 °C水浴5-10min，待用；3)將步驟2)水浴后沉淀抽提2-4次，抽提過程為將沉淀加入等量的氯仿-異戊醇中混勻，以12000-13000r · mirT1離心5-lOmin,收集上清液；4)將步驟3)抽提后上清液中加入上清液2-2. 5體積的預(yù)冷無水こ醇和上清液O. 2-0. 3倍體積的NaAC混勻，靜止放置15_30min，而后以10000-12000r · mirT1離心5-10min，所得沉淀，即為凋落物總DNA。所述步驟4)所得凋落物總DNA采用70% (體積分數(shù))こ醇洗滌而后室溫干燥，將干燥DNA沉淀溶于去離子水中保存。所述步驟I)凋落物干-40°c或-20°c冰箱冷凍，而后將其于液氮中研成粉末。所述步驟I)和2)水浴時每隔2分鐘顛倒混勻緩沖液，所述步驟3)中氯仿-異戊醇，按體積比為24 I混勻。凋落物是指未經(jīng)化學(xué)處理的森林凋落物，包括各種腐葉、樹葉。本發(fā)明所具有的優(yōu)點本發(fā)明提取方法與傳統(tǒng)的CTAB法相比，提取效果比較好，時間短，容易操作。這是因為多酚、單寧、多糖、果膠等次生代謝產(chǎn)物為水溶性物質(zhì)，棄掉第一次CTAB上清液，就意味著很好的去掉了水溶性的次生代謝產(chǎn)物，而DNA物質(zhì)大部分在剩余的凋落物中，這樣在加入CTAB就可以將DNA溶出。另外在沉淀過程中，將異丙醇沉淀改為無水こ醇沉淀，這樣可以防止多酚、單寧、多糖、果膠等次生代謝產(chǎn)物與DNA—起被沉淀。將溫度由室溫改為冰箱-20°C內(nèi)，也可以防止DNA在沉淀過程中不被降解。另外縮短離心時間，離心速度(傳統(tǒng)的方法為12000r .mirT1,1Omin,降為IOOOOr *min_1, 5min),也可以減少多酹、單寧、多糖、果膠等次生代謝產(chǎn)物與DNA —起被沉淀。


圖I為本發(fā)明實施例提供的提取牛皮杜鵑凋落物基因組DNA電泳圖(未加RNAse處理)。圖2為本發(fā)明實施例提供的提取篤斯越橘凋落物基因組DNA電泳圖(未加RNAse處理)。圖3為常規(guī)CTAB法提取牛皮杜鵑凋落物基因組DNA電泳圖(未加RNAse處理)。
具體實施例方式實施例I利用本方法提取牛皮杜鵑凋落物，同時作4個平行處理，每個平行處理按如下步驟操作I)將取O. 5g牛皮杜鵑的凋落物放入遇冷的研缽中(研缽提前一天放入_40°C或者-20°C冰箱)，加入液氮研磨成粉末(將研缽遇冷之后可以節(jié)省液氮的使用量)，取O. 2g粉末迅速轉(zhuǎn)移到含有500 μ L預(yù)熱到65°C的CTAB提取緩沖液的Eppendorf管中，水浴5min，而后以120001·· π η'δπ η，用移液器吸出上清液，棄掉，收集沉淀，待用。同時水浴過程中每隔2分鐘顛倒混勻一次Eppendorf管；所述CTAB提取緩沖液為每升緩沖液中加入其體積百分比2 %的CTAB和OmL β -巰基こ醇，即為CTAB提取緩沖液，其中提取緩沖液為IOOmmol ·じ1Tris-HCl (ρΗ8· O)，I. 4mol · I^1NaCUOmmo I ·じ1 EDTA，20mmol ·じ1 Na2 S2O50同時β_巰基こ醇即加即用。此步驟去掉上清液的目的主要是第一次上清液里含有大量的雜質(zhì)。提取效果不好。2)將步驟I)所得沉淀加入到過量的CTAB提取緩沖液混勻，65°C水浴5min，待用；同時水浴過程中每隔2分鐘顛倒混勻一次Eppendorf管；再次加入CTAB的目的再次加入CTAB，可以提取剩余凋落物樣品中的DNA，第二次CTAB可以很好的和DNA結(jié)合。3)將步驟2)水浴后沉淀室溫冷卻而后抽提3次，即為將水浴后沉淀加入500 μ L體積比為24 I的氯仿-異戍醇中，12000r η ηΛδη η。將上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，加入450 μ L體積比為24 : I的氯仿-異戍醇中，輕輕混勻，12000r .mirT1, 5min。在將上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，加入400 μ L體積比為24 I的氯仿-異戊醇中，輕輕混勻，12000r mirT1, 5min,收集上清液,待用；此步驟加入氯仿-異戍醇進行抽提,可以很好去除蛋白質(zhì)、脂類、酚類雜質(zhì)。
4)將上述收集的上清液中加入800 μ L的預(yù)冷無水こ醇和20 μ L體積的NaAC，輕輕上下?lián)u動離心管，注意觀察有DNA將從溶液中析出。如果DNA含量較少，則出現(xiàn)白色懸浮的DNA顆粒；如果DNA比較多，則出現(xiàn)白色絮狀的DNA懸浮于溶液中。_20°C冰箱里靜置15min。IOOOOr · mirT1離心5min,離心后小心倒掉上清液,用紙吸取管壁處多余的溶液,保留DNA沉淀于管底，即得到牛皮杜鵑凋落物總DNA。將上述總DNA加入70% (體積分數(shù))こ醇500 μ L洗滌沉淀，振蕩起沉淀數(shù)秒鐘，5000r· mirT1離心2min去上清液。重復(fù)洗滌沉淀I次。室溫干燥。在見到無色膠狀物附在管壁時，加入50 μ L無菌蒸餾水溶解沉淀的DNA。(參見圖I)其中電泳條件為I %瓊脂糖電泳IOOv 20min,4條帶分別表示四個牛皮杜醇的凋落物樹葉。此步驟加入無水こ醇和的NaAC(醋酸鈉)可以很好的沉淀DNA，防止雜質(zhì)也隨著沉淀。70%こ醇洗滌沉淀目的是去除沉淀中的鹽分。一般來講，RNA不影響DNA的分析，如果需要高質(zhì)量的DNA，則可以進行純化。加入RNase 2ul，將 RNA 除去。另外從圖I可以看出，利用本發(fā)明的方法提取出的牛皮杜鵑DNA雜質(zhì)少，DNA的率高，沒有發(fā)生降解。而圖3利用傳統(tǒng)的CTAB法提取出的牛皮杜鵑DNA雜質(zhì)高，DNA發(fā)生降解，無法滿足下游實驗需要。實施例2利用本方法提取篤斯越橘凋落物，同時作4個平行處理，每個平行處理按如下步驟操作I)將取O. 5g篤斯越橘的凋落物放入遇冷的研缽中(研缽提前一天放入-20°C冰箱)，加入液氮研磨成粉末(將研缽遇冷之后可以節(jié)省液氮的使用量)，取O. 2g粉末迅速轉(zhuǎn)移到含有500 μ L預(yù)熱到65°C的CTAB提取緩沖液的Eppendorf管中，水浴lOmin，而后以12000r .miniSmin,用移液器吸出上清液，棄掉，收集沉淀，待用。同時水浴過程中姆隔2分鐘顛倒混勻一次Eppendorf管；所述CTAB提取緩沖液為姆升緩沖液中加入其體積百分比2%的CTAB和OmL β-巰基こ醇，即為CTAB提取緩沖液，其中提取緩沖液為IOOmmol · L 1Tris-HCl (ρΗ8. O), I. 4mol · L 1NaCUOmmo I · L 1EDTAJOmmol · L 1Na2S2O50 同時巰基こ醇即加即用。此步驟去掉上清液的目的主要是第一次上清液里含有大量的雜質(zhì)。提取效果不好。 2)將步驟I)所得沉淀加入到過量的CTAB提取緩沖液混勻，65°C水浴5min，待用；同時水浴過程中姆_ 2分鐘顛倒混勻一次Eppendorf管；
再次加入CTAB的目的再次加入CTAB，可以提取剩余凋落物樣品中的DNA，第二次CTAB可以很好的和DNA結(jié)合。3)將步驟2)水浴后沉淀室溫冷卻而后抽提3次，即為將水浴后沉淀加入500 μ L體積比為24 I的氯仿-異戍醇中，12000r η ηΛδη η。將上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，加入450 μ L 體積比為24 : I的氯仿-異戍醇中，輕輕混勻，12000r .mirT1, 5min。在將上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，加入400 μ L體積比為24 I的氯仿-異戊醇中，輕輕混勻，12000r · mirT1, 5min,收集上清液,待用；4)將上述步驟收集的上清液中加入800μ L的預(yù)冷無水こ醇和20μ L體積的NaAC,輕輕上下?lián)u動離心管，注意觀察有DNA將從溶液中析出。如果DNA含量較少，則出現(xiàn)白色懸浮的DNA顆粒；如果DNA比較多，則出現(xiàn)白色絮狀的DNA懸浮于溶液中。_20°C冰箱里靜置15min。IOOOOr · mirT1離心5min,離心后小心倒掉上清液,用紙吸取管壁處多余的溶液，保留DNA沉淀于管底，即得到牛皮杜鵑凋落物總DNA。將上述總DNA加入70% (體積分數(shù))こ醇500 μ L洗滌沉淀，振蕩起沉淀數(shù)秒鐘，5000r· mirT1離心2min去上清液。重復(fù)洗滌沉淀I次。室溫干燥。在見到無色膠狀物附在管壁時，加入50 μ L無菌蒸餾水溶解沉淀的DNA。(參見圖2)。按照本實施方式操作可以保證反應(yīng)均勻且充分，提高植物DNA的提取質(zhì)量。實施例3利用本方法提取長白落葉松凋落物，同時作4個平行處理，每個平行處理按如下步驟操作I)將取O. 5g長白落葉松的凋落物放入遇冷的研缽中(研缽提前一天放入_20°C冰箱)，加入液氮研磨成粉末(將研缽遇冷之后可以節(jié)省液氮的使用量)，取O. 2g粉末迅速轉(zhuǎn)移到含有500 μ L預(yù)熱到65°C的CTAB提取緩沖液的Eppendorf管中，水浴5min，而后以12000r .miniSmin,用移液器吸出上清液，棄掉，收集沉淀，待用。同時水浴過程中姆隔2分鐘顛倒混勻一次Eppendorf管；所述CTAB提取緩沖液為姆升緩沖液中加入其體積百分比2 %的CTAB和OmL β -巰基こ醇，即為CTAB提取緩沖液，其中提取緩沖液為IOOmmol · L 1Tris-HCl(ρΗ8. O)，I. 4mol · L 1NaCl,20mmol · L 1 EDTA,20mmol · L 1Na2S2O50 同時巰基こ醇即加即用。此步驟去掉上清液的目的主要是第一次上清液里含有大量的雜質(zhì)。提取效果不好。2)將步驟I)所得沉淀加入到過量的CTAB提取緩沖液混勻，65°C水浴IOminJt用；同時水浴過程中姆隔2分鐘顛倒混勻一次Eppendorf管；再次加入CTAB的目的再次加入CTAB，可以提取剩余凋落物樣品中的DNA，第二次CTAB可以很好的和DNA結(jié)合。3)將步驟2)水浴后沉淀室溫冷卻而后抽提3次，即為將水浴后沉淀加入500 μ L體積比為24 I的氯仿-異戍醇中，12000r η ηΛδη η。將上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，加入450 μ L體積比為24 : I的氯仿-異戍醇中，輕輕混勻，12000r .mirT1, 5min。在將上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，加入400 μ L體積比為24 I的氯仿-異戊醇中，輕輕混勻，12000r · mirT1, 5min,收集上清液,待用；4)將上述步驟收集的上清液中加入800μ L的預(yù)冷無水こ醇和20μ L體積的NaAC,輕輕上下?lián)u動離心管，注意觀察有DNA將從溶液中析出。如果DNA含量較少，則出現(xiàn)白色懸浮的DNA顆粒；如果DNA比較多，則出現(xiàn)白色絮狀的DNA懸浮于溶液中。_20°C冰箱里靜置15min。IOOOOr · mirT1離心5min,離心后小心倒掉上清液,用紙吸取管壁處多余的溶液，保留DNA沉淀于管底，即得到牛皮杜鵑凋落物總DNA。將上述總DNA加入70% (體積分數(shù))こ醇500 μ L洗滌沉淀，振蕩起沉淀數(shù)秒鐘，5000r· mirT1離心2min去上清液。重復(fù)洗滌沉淀I次。室溫干燥。在見到無色膠狀物附在管壁時，加入50 μ L無菌蒸餾水溶解沉淀的DNA。(參見圖2)。按照本實施方式操作可以保證反應(yīng)均勻且充分，使DNA和CTAB的結(jié)合更充分。實施例4利用本方法提取水曲柳凋落物，同時作4個平行處理，每個平行處理按如下步驟 操作I)將取O. 5g水曲柳的凋落物放入遇冷的研缽中(研缽提前一天放入_40°C或者-20°C冰箱)，加入液氮研磨成粉末(將研缽遇冷之后可以節(jié)省液氮的使用量)，取O. 2g粉末迅速轉(zhuǎn)移到含有500 μ L預(yù)熱到65°C的CTAB提取緩沖液的Eppendorf管中，水浴5min，而后以120001·· π η'δπ η，用移液器吸出上清液，棄掉，收集沉淀，待用。同時水浴過程中每隔2分鐘顛倒混勻一次Eppendorf管；所述CTAB提取緩沖液為每升緩沖液中加入其體積百分比2 %的CTAB和OmL β -巰基こ醇，即為CTAB提取緩沖液，其中提取緩沖液為IOOmmol · L 1Tris-HCl(ρΗ8. O)，I. 4mol · L 1NaCl,20mmol · L 1 EDTA,20mmol · L 1Na2S2O50 同時巰基こ醇即加即用。此步驟去掉上清液的目的主要是第一次上清液里含有大量的雜質(zhì)。提取效果不好。 2)將步驟I)所得沉淀加入到過量的CTAB提取緩沖液混勻，65°C水浴5min，待用；同時水浴過程中姆_ 2分鐘顛倒混勻一次Eppendorf管；再次加入CTAB的目的再次加入CTAB，可以提取剩余凋落物樣品中的DNA，第二次CTAB可以很好的和DNA結(jié)合。3)將步驟2)水浴后沉淀室溫冷卻而后抽提3次，即為將水浴后沉淀加入500 μ L體積比為24 I的氯仿-異戍醇中，13000r mirT1, IOmin0將上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，加入450 μ L體積比為24 : I的氯仿-異戍醇中，輕輕混勻，13000r · mirT1, lOmin。在將上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，加入400 μ L體積比為24 I的氯仿-異戊醇中，輕輕混勻，13000r · mirT1, lOmin,收集上清液,待用；此步驟加入氯仿-異戊醇進行抽提，可以很好去除蛋白質(zhì)、脂類、酚類雜質(zhì)。4)將上述步驟收集的上清液中加入800μ L的預(yù)冷無水こ醇和20μ L體積的NaAC,輕輕上下?lián)u動離心管，注意觀察有DNA將從溶液中析出。如果DNA含量較少，則出現(xiàn)白色懸浮的DNA顆粒；如果DNA比較多，則出現(xiàn)白色絮狀的DNA懸浮于溶液中。_20°C冰箱里靜置15min。IOOOOr · mirT1離心5min,離心后小心倒掉上清液,用紙吸取管壁處多余的溶液，保留DNA沉淀于管底，即得到牛皮杜鵑凋落物總DNA。將上述總DNA加入70% (體積分數(shù))こ醇500 μ L洗滌沉淀，振蕩起沉淀數(shù)秒鐘，5000r· mirT1離心2min去上清液。重復(fù)洗滌沉淀I次。室溫干燥。在見到無色膠狀物附在管壁時，加入50 μ L無菌蒸餾水溶解沉淀的DNA。
按照本實施方式操作可以保證溶液中物質(zhì)充分分層，進一歩去除胚中蛋白和多糖等雜質(zhì)。實施例5提取紅松凋落物本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟四中加入上清液2. 5體積的預(yù)冷無水こ醇和上清液O. 3倍體積的NaAC混勻，靜止30min。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。利用本方法提取紅松凋落物，同時作4個平行處理，每個平行處理按如下步驟操作I)將取O. 5g紅松的凋落物放入遇冷的研缽中(研缽提前一天放入-40°C或者-20°C冰箱)，加入液氮研磨成粉末(將研缽遇冷之后可以節(jié)省液氮的使用量)，取O. 2g粉末迅速轉(zhuǎn)移到含有500 μ L預(yù)熱到65°C的CTAB提取緩沖液的Eppendorf管中，水浴5min， 而后以120001·· π η'δπ η，用移液器吸出上清液，棄掉，收集沉淀，待用。同時水浴過程中每隔2分鐘顛倒混勻一次Eppendorf管；所述CTAB提取緩沖液為每升緩沖液中加入其體積百分比2 %的CTAB和OmL β -巰基こ醇，即為CTAB提取緩沖液，其中提取緩沖液為IOOmmol · L 1Tris-HCl (ρΗ8. O), I. 4mol · L 1NaCl, 20mmol · L 1EDTAJOmmol · L 1Na2S2O50 同時巰基こ醇即加即用。此步驟去掉上清液的目的主要是第一次上清液里含有大量的雜質(zhì)。提取效果不好。2)將步驟I)所得沉淀加入到過量的CTAB提取緩沖液混勻，65°C水浴5min，待用；同時水浴過程中姆_ 2分鐘顛倒混勻一次Eppendorf管；再次加入CTAB的目的再次加入CTAB，可以提取剩余凋落物樣品中的DNA，第二次CTAB可以很好的和DNA結(jié)合。3)將步驟2)水浴后沉淀室溫冷卻而后抽提3次，即為將水浴后沉淀加入500 μ L體積比為24 I的氯仿-異戍醇中，12000r .mirTSSmino將上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，加入450 μ L體積比為24 : I的氯仿-異戍醇中，輕輕混勻，12000r .mirT1, 5min。在將上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，加入400 μ L體積比為24 I的氯仿-異戊醇中，輕輕混勻，12000r · mirT1, 5min,收集上清液,待用；此步驟加入氯仿-異戊醇進行抽提，可以很好去除蛋白質(zhì)、脂類、酚類雜質(zhì)。4)將上述步驟上清液中加入上清液2. 5體積的預(yù)冷無水こ醇和上清液O. 3倍體積 的NaAC混勻，輕輕上下?lián)u動離心管，注意觀察有DNA將從溶液中析出。如果DNA含量較少，則出現(xiàn)白色懸浮的DNA顆粒；如果DNA比較多，則出現(xiàn)白色絮狀的DNA懸浮于溶液中。-20°C冰箱里靜置30min。IOOOOr · mirT1離心5min，離心后小心倒掉上清液，用紙吸取管壁處多余的溶液，保留DNA沉淀于管底，即得到牛皮杜鵑凋落物總DNA。將上述總DNA加入70% (體積分數(shù))こ醇500 μ L洗滌沉淀，振蕩起沉淀數(shù)秒鐘，5000r· mirT1離心2min去上清液。重復(fù)洗滌沉淀I次。室溫干燥。在見到無色膠狀物附在管壁時，加入50 μ L無菌蒸餾水溶解沉淀的DNA。按照本實施方式操作可以有效的沉淀DNA，提高胚DNA的得率。對比實施例I試驗常規(guī)CTAB法提取凋落物DNA I、將牛皮杜鵑凋落物葉片放入液氮預(yù)冷的研缽中，在液氮中研碎，收集到2ml離心管中，裝入的組織少于1/2離心管。2、向裝有材料的離心管加入預(yù)熱的CTAB提取液(和本發(fā)明所用的提取液ー樣)，置于60°C水浴O. 5h。3、加等體積的氯仿-異戊醇，輕輕混勻。4、室溫IOOOOrpm,離心IOmin,將上清液移至新的離心管。5、重復(fù)步驟2、3。5、每個樣品中加樣品2/3體積的異丙醇，輕輕搖勻，等待沉淀，甚至可以過夜。6、取出樣品,8000rpm離心2min,棄去上清。 7、用洗滌緩沖液洗滌兩次，至少20min。8、2000rpm 離心 lOmin,棄去上清。9、自然風干或真空抽干DNA樣品。10、將DNA重懸在適量I X TE中，-20°C保存(參見圖3)。其中電泳條件為1%瓊脂糖電泳 IOOv 20min。
權(quán)利要求
1.一種凋落物總DNA的提取方法，其特征在于 1)將已研成粉末、預(yù)冷的凋落物加入于CTAB提取緩沖液中混勻，于64-66°C水浴5-10min ;而后以 12000-13000r mirT1 離心 5-lOmin，收集沉淀，待用； 2)將步驟I)所得沉淀加入到過量的CTAB提取緩沖液混勻，64-66°C水浴5-10min，待用； 3)將步驟2)水浴后沉淀抽提2-4次，抽提過程為將沉淀加入等量的氯仿-異戊醇中混勻，以 12000-13000r mirT1 離心 5-lOmin,收集上清液；4)將步驟3)抽提后上清液中加入上清液2-2.5體積的預(yù)冷無水乙醇和上清液0.2-0. 3倍體積的NaAC混勻，靜止放置15_30min，而后以10000_12000r mirT1離心5-10min，所得沉淀，即為凋落物總DNA。
2.按權(quán)利要求I所述的凋落物總DNA的提取方法，其特征在于所述步驟4)所得凋落物總DNA采用70%乙醇洗滌而后室溫干燥，將干燥DNA沉淀溶于去離子水中保存。
3.按權(quán)利要求I所述的凋落物總DNA的提取方法，其特征在于所述步驟I)凋落物于-40°C或-20°C冰箱冷凍，而后將其于液氮中研成粉末。
4.按權(quán)利要求I所述的凋落物總DNA的提取方法，其特征在于所述步驟I)和2)水浴時每隔2分鐘顛倒混勻緩沖液。
5.按權(quán)利要求I所述的凋落物總DNA的提取方法，其特征在于所述步驟3)中氯仿-異戊醇，按體積比為24 I混勻。
全文摘要
本發(fā)明涉及凋落物分子生物學(xué)，具體的說是一種凋落物總DNA的提取方法。將已研成粉末、預(yù)冷的凋落物加入于CTAB提取緩沖液中混勻，于64-66℃水浴5-10min；而后以12000-13000r·min-1離心5-10min，收集沉淀，待用；將步驟1)所得沉淀加入到過量的CTAB提取緩沖液混勻，64-66℃水浴5-10min，待用；將步驟2)水浴后沉淀抽提2-4次，抽提過程為將沉淀加入等量的氯仿-異戊醇中混勻，以12000-13000r·min-1離心5-10min，收集上清液；將步驟3)抽提后上清液中加入上清液2-2.5體積的預(yù)冷無水乙醇和上清液0.2-0.3倍體積的NaAC混勻，靜止放置15-30min，而后以10000-12000r·min-1離心5-10min，所得沉淀，即為凋落物總DNA。本發(fā)明提取方法與傳統(tǒng)的CTAB法相比，提取效果比較好，時間短，容易操作。
文檔編號C12N15/10GK102676496SQ20111006243
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月15日
發(fā)明者馮富娟, 隋心, 韓士杰 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所