專利名稱：木瓜凝乳蛋白酶作為直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，涉及木瓜凝乳蛋白酶在有機(jī)合成中的新應(yīng)用，特別涉及木瓜凝乳蛋白酶作為直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑的應(yīng)用，以及應(yīng)用木瓜凝乳蛋白酶催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的方法。
背景技術(shù)：
自20世紀(jì)80年代初期Klibanov報(bào)道了酶可以在無(wú)水有機(jī)溶劑中保持活性且溶劑對(duì)酶的選擇性有較大影響以來(lái)，酶作為生物催化劑由于其內(nèi)在的高選擇性，溫和的反應(yīng)條件以及潛存的環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。然而，自然界中酶的種類是有限的，目前實(shí)際投入工業(yè)化生產(chǎn)的酶的種類更是有限的，因此，挖掘每一種酶潛存的催化多功能性非常必要。C-C鍵形成的反應(yīng)是有機(jī)合成中的基礎(chǔ)反應(yīng)。Aldol反應(yīng)是形成C-C鍵的重要反應(yīng)之一。除了醛縮酶對(duì)Aldol反應(yīng)具有天然催化活性以外，關(guān)于其它酶催化Aldol反應(yīng)的報(bào)道極少，僅見C. Brarmeby等報(bào)道突變的脂肪酶可以催化Aldol反應(yīng)(J. Am. Chem. Soc. 2003, 125，874-875) ;C. Li等報(bào)道脂肪酶和具有多功能性的胃蛋白酶可以催化Aldol反應(yīng)(Green Chem. 2008， 10， 616-618 J. Biotechnol. 2010,150， 539-545)；X. Chen 等報(bào)道酰基轉(zhuǎn)移酶和含氮雜環(huán)化合物在有機(jī)溶劑中可以催化Aldol反應(yīng)和脫水反應(yīng)的串聯(lián)反應(yīng)(J. Mol. Catal. B-Enzym. 2011，68，71-76)；以及發(fā)明人在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)， 地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶和核酸酶Pl可以催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)(Catal. Commun. 2011，12，580-582 ；Green Chem. 2011，13，185-189)。木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain) [EC 3. 4. 22. 6]是屬于木瓜蛋白酶家族的一種胞外巰基蛋白酶，具有凝乳和蛋白質(zhì)水解能力，主要來(lái)源于未成熟的木瓜乳中，目前除了用于奶酪的制造外，主要用于醫(yī)藥行業(yè)，如抗菌消炎、他血型的鑒定、腫瘤的輔助治療、短肽的合成等，最主要用于治療腰椎間盤突出癥。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未見其可以作為直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑應(yīng)用的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于確認(rèn)木瓜凝乳蛋白酶是否能夠作為直接不對(duì)稱 Aldol反應(yīng)催化劑應(yīng)用。為達(dá)到此目的，本發(fā)明以對(duì)氰基苯甲醛和環(huán)己酮為底物，首先通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了木瓜凝乳蛋白酶可以催化對(duì)氰基苯甲醛和環(huán)己酮的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)，其次對(duì)影響上述反應(yīng)的主要因素如反應(yīng)溶劑、溶劑含水量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和溶劑PH值等進(jìn)行了系統(tǒng)研究；再在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，進(jìn)一步考察了木瓜凝乳蛋白酶作為直接不對(duì)稱Aldol 反應(yīng)催化劑的底物適用范圍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木瓜凝乳蛋白酶能夠催化芳香醛或雜芳醛與二烷基酮或環(huán)烷酮之間的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)并取得良好的效果。從而確認(rèn)了木瓜凝乳蛋白酶可以作為直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑應(yīng)用。
進(jìn)一步，木瓜凝乳蛋白酶可以作為芳香醛或雜芳醛與二烷基酮或環(huán)烷酮之間的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑應(yīng)用。進(jìn)一步，所述芳香醛為苯甲醛或取代苯甲醛，所述雜芳醛為糠醛。進(jìn)一步，所述取代苯甲醛為苯環(huán)被廣2個(gè)取代基取代的苯甲醛，這些取代基獨(dú)立地選自氟、氯、溴、硝基、羥基、氰基、C1-C5烷基或C1-C5烷氧基。進(jìn)一步，所述二烷基酮為丙酮，所述環(huán)烷酮為環(huán)戊酮、環(huán)己酮或環(huán)庚酮。本發(fā)明的目的之二在于提供一種應(yīng)用木瓜凝乳蛋白酶催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的優(yōu)化方法。為達(dá)到此目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
應(yīng)用木瓜凝乳蛋白酶催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的方法，是向反應(yīng)容器中加入芳香醛或雜芳醛、二烷基酮或環(huán)烷酮、木瓜凝乳蛋白酶、水和有機(jī)溶劑，在PH為4. 9^7的條件下控溫25、0°C攪拌反應(yīng)，即生成直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)產(chǎn)物；所述有機(jī)溶劑為四氫呋喃、乙腈、 叔丁基甲醚、環(huán)己烷和二氯甲烷中的任一種或多種混合物；所述水和有機(jī)溶劑的體積比為 0. 09 0. 15。進(jìn)一步，所述有機(jī)溶劑為乙腈。進(jìn)一步，所述水和有機(jī)溶劑的體積比為0. 12。進(jìn)一步，所述反應(yīng)溫度為30°C。進(jìn)一步，所述pH為4. 9。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)木瓜凝乳蛋白酶能夠作為直接不對(duì)稱 Aldol反應(yīng)催化劑應(yīng)用，特別是適用于芳香醛或雜芳醛與二烷基酮或環(huán)烷酮之間的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)，具有催化活性好、對(duì)映選擇性高、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，不僅拓寬了木瓜凝乳蛋白酶的應(yīng)用范圍，而且為直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)提供了一種優(yōu)良的催化劑，在有機(jī)合成領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1示出了有機(jī)溶劑含水量對(duì)木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的影響。圖2示出了反應(yīng)溫度對(duì)木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的影響。圖3示出了反應(yīng)時(shí)間對(duì)木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的影響。圖4示出了溶劑pH值對(duì)木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的影響。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中使用的木瓜凝乳蛋白酶購(gòu)自南寧龐博生物工程有限公司，比活力為20U/ mg。實(shí)施例中采用薄層色譜法(GF2M硅膠板)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，柱色譜法(10(Γ200目硅膠加壓柱，洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯的混合液)純化粗產(chǎn)物。實(shí)施例中給出的產(chǎn)率為經(jīng)柱色譜法純化后的產(chǎn)物收率；產(chǎn)物的相對(duì)構(gòu)型和絕對(duì)構(gòu)型通過(guò)與已知化合物的核磁共振氫譜(1H NMR)、核磁共振碳譜(1 NMR)和手性高效液相色譜數(shù)據(jù)比較確定；d.r. {anti/syn)為反式產(chǎn)物與順式產(chǎn)物(SJ^)的摩爾比，通過(guò)測(cè)定非對(duì)映異構(gòu)體的高效液相色譜確定；產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值(M)通過(guò)測(cè)定對(duì)映異構(gòu)體的手性高效液相色譜測(cè)定。實(shí)施例1、木瓜凝乳蛋白酶催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的活性及構(gòu)效關(guān)系確認(rèn)本實(shí)施例以對(duì)氰基苯甲醛和環(huán)己酮為底物，對(duì)木瓜凝乳蛋白酶催化直接不對(duì)稱Aldol
反應(yīng)的活性及其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)方法為在反應(yīng)瓶中加入對(duì)氰基苯甲醛 (131mg, 1. O mmol)和環(huán)己酮(2Mmg，3. Ommol )，不加入酶或分別加入以下物質(zhì)(200mg)木瓜凝乳蛋白酶、經(jīng)尿素100°C預(yù)處理M小時(shí)使失去活性的木瓜凝乳蛋白酶、經(jīng)苯甲基磺酰氟(PMSF) 25°C預(yù)處理M小時(shí)使活性被抑制的木瓜凝乳蛋白酶、牛血清白蛋白、卵清白蛋白，再加入水(0. 09mL)和乙腈(1. OmL),控溫25°C攪拌反應(yīng)。反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌，合并濾液和洗液，加水(20mL)稀釋后，用乙酸乙酯萃取3次(每次20mL)，合并乙酸乙酯萃取液，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓蒸餾除去溶劑得粗產(chǎn)物，再經(jīng)柱色譜法純化獲得目標(biāo)產(chǎn)物。結(jié)果如表1所示，可見對(duì)氰基苯甲醛和環(huán)己酮在含水乙腈中25°C攪拌反應(yīng)，(1)不加酶條件下，反應(yīng)96小時(shí)未見產(chǎn)物生成；(2)加入木瓜凝乳蛋白酶，反應(yīng)89小時(shí)獲得Aldol 反應(yīng)產(chǎn)物且產(chǎn)物具有較好的對(duì)映選擇性；(3)加入經(jīng)尿素處理失去活性或經(jīng)PMSF處理活性被抑制的木瓜凝乳蛋白酶，反應(yīng)96小時(shí)僅有微量產(chǎn)物生成；(4)加入牛血清白蛋白或卵清白蛋白等非酶蛋白質(zhì)，反應(yīng)130小時(shí)獲得Aldol反應(yīng)產(chǎn)物但產(chǎn)物不具有對(duì)映選擇性；從而確認(rèn)木瓜凝乳蛋白酶可以催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)且其三維結(jié)構(gòu)對(duì)催化活性來(lái)說(shuō)是必須的，排除了其催化活性是由蛋白質(zhì)或其所含氨基酸殘基帶來(lái)的可能性。表1對(duì)氰基苯甲醛和環(huán)己酮在不同條件下的反應(yīng)結(jié)果
權(quán)利要求
1.木瓜凝乳蛋白酶作為直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木瓜凝乳蛋白酶的應(yīng)用，其特征在于木瓜凝乳蛋白酶作為芳香醛或雜芳醛與二烷基酮或環(huán)烷酮之間的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的木瓜凝乳蛋白酶的應(yīng)用，其特征在于所述芳香醛為苯甲醛或取代苯甲醛，所述雜芳醛為糠醛。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的木瓜凝乳蛋白酶的應(yīng)用，其特征在于所述取代苯甲醛為苯環(huán)被廣2個(gè)取代基取代的苯甲酸，這些取代基獨(dú)立地選自氟、氯、溴、硝基、羥基、氰基^1-C5 烷基或C1-C5烷氧基。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的木瓜凝乳蛋白酶的應(yīng)用，其特征在于所述二烷基酮為丙酮， 所述環(huán)烷酮為環(huán)戊酮、環(huán)己酮或環(huán)庚酮。
6.應(yīng)用木瓜凝乳蛋白酶催化權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的方法，其特征在于向反應(yīng)容器中加入芳香醛或雜芳醛、二烷基酮或環(huán)烷酮、木瓜凝乳蛋白酶、 水和有機(jī)溶劑，在PH為4. 9^7的條件下控溫25、0°C攪拌反應(yīng)，即生成直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)產(chǎn)物；所述有機(jī)溶劑為四氫呋喃、乙腈、叔丁基甲醚、環(huán)己烷和二氯甲烷中的任一種或多種混合物；所述水和有機(jī)溶劑的體積比為0. 09、. 15。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用木瓜凝乳蛋白酶催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑為乙腈。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用木瓜凝乳蛋白酶催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的方法，其特征在于所述水和有機(jī)溶劑的體積比為0. 12。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用木瓜凝乳蛋白酶催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的方法，其特征在于所述反應(yīng)溫度為30°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用木瓜凝乳蛋白酶催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的方法，其特征在于所述pH*4.9。
全文摘要
本發(fā)明涉及木瓜凝乳蛋白酶作為直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑的應(yīng)用，特別涉及其作為芳香醛或雜芳醛與二烷基酮或環(huán)烷酮之間的直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)催化劑的應(yīng)用；還涉及應(yīng)用木瓜凝乳蛋白酶催化直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)的方法，將芳香醛或雜芳醛、二烷基酮或環(huán)烷酮、木瓜凝乳蛋白酶、水和有機(jī)溶劑在pH為4.9~7的條件下控溫25~40℃攪拌反應(yīng)，即生成直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)產(chǎn)物；有機(jī)溶劑為四氫呋喃、乙腈、叔丁基甲醚、環(huán)己烷和二氯甲烷中的任一種或多種混合物；水和有機(jī)溶劑的體積比為0.09~0.15；本發(fā)明不僅拓寬了木瓜凝乳蛋白酶的應(yīng)用范圍，而且為直接不對(duì)稱Aldol反應(yīng)提供了一種優(yōu)良的催化劑，在有機(jī)合成領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P17/04GK102181497SQ201110063369
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者何延紅, 官智, 李海虹 申請(qǐng)人:西南大學(xué)