專利名稱：穿龍薯蕷內(nèi)生真菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物內(nèi)生真菌，尤其涉及來源于穿龍薯蕷類植物的內(nèi)生真菌，本發(fā)明還涉及該穿龍薯蕷內(nèi)生真菌在生物轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷類成分中的應(yīng)用，屬于植物內(nèi)生真菌及其應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
薯蕷皂苷(dioscin)屬于甾體皂苷，水解后可以得到薯蕷皂苷元(diosgenin)， 不僅具有顯著的抗腫瘤、抗炎、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗艾滋病等作用，而且是目前世界上合成300多種留體激素和避孕藥物的重要原料。薯蕷皂苷主要存在于薯蕷科植物中，目前中國以穿龍薯截(Dioscorea nipponica)、盾葉薯截(Dioscorea zingiberensis)禾口黃山藥 (Dioscorea panthaica)等植物的根莖作為提取皂苷的主要原料，進行加工制劑。例如，生產(chǎn)臨床常用的預(yù)防和治療冠心病、心絞痛的藥典藥物“地奧心血康”等。但隨著皂素工業(yè)的發(fā)展和國內(nèi)、國際市場對薯蕷皂苷元需求量的增加，野生資源已漸趨衰竭，人工栽培面積有限，且薯蕷根莖類藥材的栽培周期較長，從天然植物中提取薯蕷皂苷類原料難以滿足市場日益增長的需求。所以尋求替代品或者加大已有資源的利用勢在必行。內(nèi)生真菌與宿主植物具有互惠共生的關(guān)系，有些內(nèi)生菌具有促進宿主植物合成活性成分的能力，通過內(nèi)生菌的作用增加藥用植物活性成分的產(chǎn)量。如果能從穿龍薯蕷植物中分離得到一株內(nèi)生真菌，將其制備成種子液添加到薯蕷類藥材中進行發(fā)酵，能夠促使藥材中存在的物質(zhì)合成薯蕷皂苷元，這將極大的提高對薯蕷類藥材的利用度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種穿龍薯蕷中分離得到的新的內(nèi)生真菌；本發(fā)明目的之二是將所分離到的內(nèi)生真菌應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷類成分；本發(fā)明目的之三是將生物轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷類成分的轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化篩選得到一種最佳的轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的本發(fā)明從穿龍薯蕷葉片中分離得到一株內(nèi)生真菌(Fusarium sp.)C39，其微生物保藏號是CGMCC NO. 4616 ；其分類命名是鐮孢(Fusarium sp.)；保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是2011年3月1日。本發(fā)明內(nèi)生真菌(Fusarium sp. )C39的形態(tài)學(xué)特征將內(nèi)生真菌(Fusarium sp.) C39菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，25°C，暗培養(yǎng)4天，觀察到整個菌落致密，直徑4. Ocm,正面呈白色絨毛狀，氣生菌絲高2mm，背面菌落圓心處深紅色，向外呈淡紅色，最外周白色，邊緣整齊。顯微鏡下顯示，菌絲纖細，分枝，有隔，無色透明；分生孢子梗無色，細長，不分枝，孢子單生，無色，多細胞，圓筒形，端部漸尖，有的微彎曲。結(jié)合C39菌的形態(tài)特征與《半知菌屬圖解》進行相對比較，初步分析C39菌屬于叢梗孢目，叢梗孢科，鐮孢屬真菌。本發(fā)明內(nèi)生真菌(Fusarium sp.)C39的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果提取C39菌的基因組DNA，序列測定結(jié)果為SEQ ID No. 1所示；將測序結(jié)果與GeneBank中已知序列進行比較分析，從Genebank數(shù)據(jù)庫中獲得相關(guān)種屬的ITS序列信息，應(yīng)用CLUSTAL X 1. 83軟件進行多序列比對，將計算結(jié)果導(dǎo)入PHYLIP軟件，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖7)。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，C39 菌的特征描述符合鐮孢屬真菌。但經(jīng)比對，未發(fā)現(xiàn)目前GeneBank中存在與其基因序列和形態(tài)特征完全相同的已知菌種。初步確定C39菌為叢梗孢目，叢梗孢科鐮孢屬(Fusarium)真菌。C39菌多次傳代后功能的穩(wěn)定性驗證將不同世代C39菌的種子液進行藥材的固體發(fā)酵，經(jīng)過七個世代的傳遞仍然保持固體發(fā)酵提高薯蕷類藥材中薯蕷皂苷元含量的能力。本發(fā)明的另一個目的是將所分離得到的內(nèi)生真菌(Fusarium sp. )C39應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷元，包括(1)制備內(nèi)生真菌(Fusarium sp.)C39的種子液；(2)將薯蕷類植物粉碎成粗粉，得到固體發(fā)酵培養(yǎng)基；(3)向固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種子液，發(fā)酵培養(yǎng)，即得。其中，所述的薯蕷類植物包括穿龍薯蕷(Dioscorea nipponica)、盾葉薯蕷 (Dioscorea zingiberensis) 5 Jt ill M (Dioscorea panthaica) ^ -,^iXi^.^] WMMW. (Dioscorea nipponica)、盾葉薯截(Dioscorea zingiberensis)或黃山藥(Dioscorea panthaica)它們各自的根莖或根。本發(fā)明通過大量的實驗對上述發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化和篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用以下條件能夠有效的提高藥材中薯蕷皂苷元的轉(zhuǎn)化率本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，將薯蕷類植物粉碎成粗粉所得到固體發(fā)酵基進行高溫滅菌后再接入種子液進行發(fā)酵，能夠顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物中薯蕷皂苷元的含量；其中，所述的發(fā)酵條件優(yōu)選為發(fā)酵溫度為25°C，發(fā)酵時間為8天。





圖1薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。 圖2 C39菌正面菌落形態(tài)特征。 圖3 C39菌底面菌落形態(tài)特征。 圖4 C39菌孢子形態(tài)特征。 圖5 C39菌菌絲形態(tài)特征。
圖6 C39菌擴增產(chǎn)物電泳圖譜。M為Marker ；1. 2. 3. 4 :C39擴增產(chǎn)物平行樣。 圖7 C39菌的ITS序列系統(tǒng)進化樹。 圖8薯蕷皂苷元分光光度法含量測定的標(biāo)準曲線。 圖9薯蕷皂苷元標(biāo)準品的紫外吸收光譜圖。 圖10薯蕷皂苷元HPLC法含量測定的標(biāo)準曲線。 圖11薯蕷皂苷元標(biāo)準品的紫外吸收光譜圖。 圖12 C39菌固體發(fā)酵產(chǎn)物的紫外吸收光譜圖。 圖13 C39菌固體發(fā)酵產(chǎn)物、空白藥材和薯蕷皂苷元標(biāo)準品色譜圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
實施例1內(nèi)生真菌C39的分離純化及保存1.內(nèi)生真菌的分離1. 1植物組織表面消毒處理在采集的樣本中，挑選沒有蟲斑病斑的穿龍薯蕷葉片。樣本先用自來水沖洗，洗去表面的泥土和灰塵，自然晾干。按以下方法進行表面消毒75%乙醇漂洗1-5分鐘一3. 5%次氯酸鈉水溶液浸泡3_7分鐘一無菌水沖洗3次， 每次1分鐘。根據(jù)葉片的薄厚對表面消毒的時間進行篩選，對每種植物樣本，選出最佳的表面消毒時間。在次氯酸鈉溶液中浸泡的時間分別設(shè)為:3. Omin, 4. Omin, 5. Omin, 6. Omin, 7. Omin。盡可能多地分離出植物的內(nèi)生真菌，并且進行徹底的表面消毒。1.2內(nèi)生真菌的分離內(nèi)生真菌的分離采用組織塊分離的方法。在無菌條件下，將消毒過的葉片剪去四周邊緣，將中央部分剪成0. 5cm3方塊，然后將葉片接種于PDA培養(yǎng)基平板上，每個平皿內(nèi)接種6塊組織塊，同時做3個平行。接種好的平皿置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7天，每天觀察記錄。為檢查材料表面消毒是否徹底做以下對照實驗(1)無菌水對照法將上述組織消毒的最后一次無菌水0. ImL涂于培養(yǎng)基表面，置于相同條件下培養(yǎng)，觀察記錄是否有真菌生長。(2)組織塊對照法植物樣本經(jīng)過2. 1. 1項下的表面消毒后，將整片葉片不剪切，直接放在PDA培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)，觀察記錄。(3)空白培養(yǎng)基對照將未種植植物組織片的空白培養(yǎng)基，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7天，每天觀察記錄。1.3內(nèi)生真菌的純化待樣品切割邊緣長出新菌絲，及時轉(zhuǎn)入新配制的PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)長出菌落的形態(tài)、大小、顏色的不同，分別挑取各菌落邊緣的菌絲，接于新的平板上進行培養(yǎng)，繼續(xù)觀察。采用三點法逐步純化，培養(yǎng)數(shù)日后，觀察菌落的形態(tài)及顏色是否均勻，邊緣是否整齊，確定是否純化。1.4內(nèi)生真菌菌種保存將多次純化的菌種，移至試管PDA斜面培養(yǎng)基上，25°C下培養(yǎng)5天，待觀察沒有污染后，加入無菌液體石蠟，液面高于培養(yǎng)基Icm左右，對菌株編號后，放于室溫及4°C的冰箱中保存。從穿龍薯蕷新鮮植物中，共分離出內(nèi)生真菌52株。
1. 5對照實驗穿龍薯蕷內(nèi)生真菌最佳分離條件下的對照試驗結(jié)果如下(1)當(dāng)無菌水的培養(yǎng)基表面無菌落長出，表明穿龍薯蕷組織表面消毒徹底，在實驗培養(yǎng)基中自組織邊緣分離出的真菌是植物的內(nèi)生真菌而不是空氣中或組織塊表面附生的微生物。(2)經(jīng)過7天觀察，未做分割葉片組織周圍無菌長出，葉片枯萎。(3)經(jīng)過7天觀察，未種植組織片的空白培養(yǎng)基表面微干，水分蒸發(fā)所致，但無菌生長，表明培養(yǎng)基配置及消毒合格，可用于內(nèi)生真菌的培養(yǎng)。實施例2穿龍薯蕷內(nèi)生真菌C39的鑒定1、C39菌的形態(tài)學(xué)鑒定主要根據(jù)分離得到的內(nèi)生真菌菌落特征，觀察個體形態(tài)特征及其他一些生物學(xué)特征進行經(jīng)典分類鑒定。1. 1載片培養(yǎng)取直徑7cm左右圓形濾紙一張，鋪放于一個直徑9cm的平皿底部，上放一 U形玻棒，其上再平放一張干凈的載玻片與一張蓋玻片，蓋好平皿蓋進行滅菌。挑取真菌孢子接入盛有滅菌水的試管中，搖振試管制成孢子懸液備用。用滅菌滴管吸取滅菌后融化的真菌固體培養(yǎng)基少許，滴于上述滅菌平皿內(nèi)的載玻片中央，并以接種環(huán)將孢子懸液接種在培養(yǎng)基四周，加上蓋玻片，并輕輕壓貼一下。為防止培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基干燥，可在濾紙上滴加滅菌后的20%甘油液3 細1，然后蓋上平皿蓋，即成所謂濕室載片培養(yǎng)。放在25°C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期取出在低倍鏡下觀察。1. 2挑片觀察在載玻片上加一滴乳酸苯酚液棉蘭染色液，用接種針從生長有真菌的平板中挑取帶有孢子的真菌菌絲，放入載玻片上的液滴中，并且用針尖將其分散開，蓋好蓋玻片即得載片標(biāo)本。1. 3插片培養(yǎng)插片法將內(nèi)生真菌接種在瓊脂平板上，將滅菌的蓋玻片45度角插于固體培養(yǎng)基中，使內(nèi)生真菌菌絲沿著培養(yǎng)基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻片上。觀察時，輕輕取出蓋玻片，置于載玻片上直接鏡檢。乳酚棉藍染色插片用苯胺藍染色15min后，加入幾滴乳酚油為浮載劑，在顯微鏡下觀察。乳酸苯酚液加苯胺藍(棉藍)是真菌標(biāo)準的浮載劑。(堿性染料苯胺藍可使真菌的原生質(zhì)著色，而不染色細胞壁。)2、C39菌的分子生物學(xué)鑒定2. 1 C39菌基因組DNA的提取(1)取C39菌斜面培養(yǎng)的菌種，接種于200mLPD液體培養(yǎng)基中，25°C，130r/min振蕩培養(yǎng)3d。2層無菌紗布過濾出菌絲，用無菌水洗2次，再用滅菌生理鹽水洗2次，無菌濾紙吸去菌體表面水分，獲得菌絲體。(2)將收集的菌絲加液氮研磨，置于含有700μ 1 DNA提取緩沖液[200mM Tris-HCl (PH = 8. 0), 25mM EDTA(PH = 8. 0), 250mM NaCl，0· 5% SDS (PH = 7. 5)]的 1. 5ml 離心管中，用微量移液槍混勻，37 °C水浴30min。
(3) 12000r/min離心5min，將上清液移入新的離心管中。(4)加入等體積苯酚-氯仿(1 1)溶液，混勻5min, 12000r/min離心5min,將上清液移入新的離心管。(5)加入等體積氯仿，混勻，12000r/min離心2min，將上層溶液移入新的離心管中。(6)加入2倍體積冰乙醇，-20 V放置2小時。(7)取放置后的DNA提取液，12000r/min離心5min，去上清液，加入70%乙醇，清洗沉淀2次，12000r/min離心2min。(8)去上清液，揮干溶劑，加入75 μ 1 IXTE溶解沉淀即為DNA模板。(9) DNA模板置于_20°C保存?zhèn)溆谩?. 2 C39菌基因組DNA的檢測取少量DNA模板，采用分光光度法測定A26Q/A28Q比值，檢測DNA模板純度，并計算 DNA濃度。采用IX TAE作為電泳緩沖液，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測真菌基因組DNA模板。加樣量為6 μ 1，電場強度為5V/cm，電泳時間1. 5小時。紫外分析儀下檢測真菌基因組DNA提
取結(jié)果。2. 3 C39菌基因組DNA的PCR擴增反應(yīng)在超凈工作臺內(nèi)配制PCR擴增試劑擴增的反應(yīng)體系見表1。表 權(quán)利要求
1.一株從穿龍薯蕷(Dioscorea nipponica)中分離到的內(nèi)生真菌(Fusarium sp.) C39，其特征在于，其微生物保藏號CGMCC NO. 4616。
2.權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌(Fusariumsp.)C39在制備薯蕷皂苷元中的用途。
3.按照權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，包括(1)制備權(quán)利要求1所述內(nèi)生真菌 (Fusarium sp.)C 39的種子液；(2)將薯蕷類植物粉碎成粗粉，得到固體發(fā)酵基；(3)向固體發(fā)酵基中接入內(nèi)生真菌(Fusarium sp.)C39的種子液，發(fā)酵培養(yǎng)，即得。
4.按照權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的薯蕷類植物包括穿龍薯蕷 (Dioscorea nipponica)、盾葉薯蔬(Dioscorea zingiberensis)或黃山藥(Dioscorea panthaica)0
5.按照權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述的穿龍薯蕷(Dioscorea nipponica)、)§"卩十—(Dioscorea zingiberensis) $胃山胃(Dioscorea panthaica) ^ 它們各自的根莖或根。
6.按照權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于將所述固體發(fā)酵基進行高溫滅菌后再接入種子液進行發(fā)酵培養(yǎng)。
7.按照權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度為 25°C，發(fā)酵時間為8天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株穿龍薯蕷內(nèi)生真菌及其應(yīng)用。本發(fā)明從穿龍薯蕷葉片中分離得到一株內(nèi)生真菌(Fusarium sp.)C39，其微生物保藏號是CGMCC NO.4616；結(jié)合基因組DNA測序和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，本發(fā)明所分離的C39菌為叢梗孢目，叢梗孢科鐮孢屬(Fusarium)真菌。將本發(fā)明內(nèi)生真菌C39的種子液接入到由穿龍薯蕷等植物所制備得到的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，可以有效地提高藥材中薯蕷皂苷元的含量。穩(wěn)定性驗證實驗表明，內(nèi)生真菌(Fusarium sp.)C39的穩(wěn)定性良好，不同世代的C39菌經(jīng)多世代的傳遞仍然保持固體發(fā)酵提高穿山龍等薯蕷類植物藥材中薯蕷皂苷元含量的能力。
文檔編號C12N1/14GK102154123SQ201110063388
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者孟凡佳, 牟晉超, 都曉偉 申請人:都曉偉