專利名稱：一種用于發(fā)酵生產(chǎn)核糖核酸的熱帶假絲酵母菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種高產(chǎn)核糖核酸的酵母菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
核糖核酸(Ribonucleic acid,簡稱RNA)是一類十分重要的生物大分子物質(zhì)。RNA不僅在基因表達和蛋白質(zhì)生物合成中起著關(guān)鍵作用，并且能促進細胞諸多生理功能。隨著研究深入，核糖核酸在醫(yī)藥、保健、農(nóng)業(yè)、食品加工等行業(yè)的應(yīng)用前景越來越廣。在醫(yī)藥上RNA作為重要的醫(yī)藥中間體，其降解后得到的核苷酸、核苷及堿基都是用途廣泛的藥物，它們的衍生物在抗腫瘤和抗病毒方面的應(yīng)用則更為顯著?？茖W(xué)研究證明人體的衰老與體內(nèi)合成核酸能力的高低密切相關(guān)，隨著年齡的增加，合成核酸的能力會逐漸減弱，造成體內(nèi)核酸及組成成分的不足，產(chǎn)生人體各種衰老現(xiàn)象；在保護環(huán)境方面，核糖核酸作為綠色農(nóng)藥，具有很重要的意義。核糖核酸及其降解物的衍生物作為抗菌素，可用于防治植物病菌的農(nóng)藥，這類農(nóng)藥對人體無毒害，對環(huán)境無污染。盛建國等(食品エ業(yè)科技，2007，28 (I) : 140-142)分別以原糖液、糖化液和廢糖蜜作為碳源培養(yǎng)熱帶假絲酵母K-79株，發(fā)現(xiàn)以原糖液為碳源時RNA含量最高為8. 6%。周震等(エ業(yè)微生物，2002，32 (3) 28-32)利用2%的葡萄糖培養(yǎng)熱帶假絲酵母QZN0209株，RNA含量達到13. 9%0離子注入技術(shù)作為ー種生物品種改良的新技術(shù)已在誘變育種、植物轉(zhuǎn)基因、生命起源和進化以及環(huán)境輻射與人類健康等方面取得了ー些重要研究成果。其中，在微生物誘變育種的研究中，離子注入已廣泛用于對微生物菌種的誘變育種，并取得了良好效果。離子注入與傳統(tǒng)誘變源相比，除了具有能量沉積效應(yīng)外，還有動量傳遞、質(zhì)量沉積及電荷中和與交換效應(yīng)，是ー種將物理誘變和化學(xué)誘變特性集于一身的綜合誘變方法，能夠在低劑量注入、細胞損傷較輕的情況下，強烈地影響生物細胞的生理、生化性能，造成遺傳物質(zhì)的基本単位-堿基的改變，誘發(fā)染色體結(jié)構(gòu)變異。離子注入在很短的時間內(nèi)同時發(fā)生能量沉積、動量傳遞、質(zhì)量沉積和電荷交換4個過程。離子束的濺射好比一把手木刀，對微生物體進行細微加工，使生物體表面層層剝離，后來的離子就可穿行較長的距離，落在預(yù)定的位置上(余增亮。生物技術(shù)引論[M]。安黴安徽科技出版社，1998)。中國科學(xué)院上海生物工程研究中心的陳祖華(微生物學(xué)報，2000，27 (3) :174-177)用N+離子注入誘變處理熱帶假絲酵母，經(jīng)篩選，獲得了 I株能夠利用正十二烷烴發(fā)酵產(chǎn)生長鏈ニ元酸的高產(chǎn)菌，在底物濃度為15% (體積比)下產(chǎn)酸量由43.5% g/L上升到73.2% g/L。王紀(微生物學(xué)雜志，1998，18(4) 25-28)等通過離子注入誘變篩選得到一株遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)菌，得率較出發(fā)菌提高55% 60 %。虞龍(激光生物學(xué)報，1998，8，(3) :218 220)和姚建銘(生物工程學(xué)報，2000，4 (16) 47-48)分別用低能離子注入選育的VC高產(chǎn)菌株和花生四烯酸(AA)產(chǎn)生菌，其發(fā)酵水平雙雙創(chuàng)國內(nèi)外新高
發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株高產(chǎn)核糖核酸的菌株及利用該菌株進行發(fā)酵的適宜條件。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種用于發(fā)酵生產(chǎn)核糖核酸的熱帶假絲酵母菌，該熱帶假絲酵母菌的保藏編號為CGMCC No. 4204。這種作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)核糖核酸的熱帶假絲酵母菌的分類命名為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)RJ-36,目前該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4204，保藏日期為2010年09月30日。該菌株是通過對土壤篩選到的酵母菌進行低能離子束注入，然后將誘變后的菌株轉(zhuǎn)接于平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑選單菌落轉(zhuǎn)接于麥芽汁斜面培養(yǎng)，后經(jīng)含碳源、氮源、無機鹽和水的液體種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)從而篩選出的核糖核酸高產(chǎn)菌。CGMCC No. 4204菌株具有下述性質(zhì)I、菌落形態(tài)學(xué)特征在葡萄糖一酵母汁一蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30°C，3天，細胞呈球形或卵球形，其中大小約I 5μηιΧ5 30μηι。在麥芽汁瓊脂上菌落為白色到奶油色,無光澤或稍有光澤。軟而平滑或部分有皺紋。培養(yǎng)時間長時，菌落變硬。在加蓋玻片的玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可看到大量的假菌絲和芽生孢子。2、生理與生化特性菌株典型的兼性厭氧型單細胞真菌。在有氧的情況下，它進行有氧呼吸，排出ニ氧化碳；而在缺氧的條件下，其進行無氧呼吸，分解有機物(主要是葡萄糖)，產(chǎn)生酒精和水；該菌的最佳生長溫度為32°C，最適pH值為4. O。3、營養(yǎng)特征該菌能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、糖蜜或甘油。
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本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)RNA的熱帶假絲酵母菌株。本發(fā)明又提供了一種生產(chǎn)核糖核酸的發(fā)酵方法，該方法包括采用上述酵母菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵。本發(fā)明還提供了上述酵母菌在提高發(fā)酵生產(chǎn)核糖核酸的產(chǎn)量中的應(yīng)用。在上述發(fā)酵方法中，液體種子培養(yǎng)基包括溶劑水，碳源I 300g/L，氮源I 100g/L，除此之外還含有無機鹽O. 01 100g/L ;優(yōu)選地液體種子培養(yǎng)基包括溶劑水，碳源10 30g/L，氮源10 30g/L，除此之外還含有無機鹽0. I 10g/L ;進一步優(yōu)選地，所述無機鹽的含量為O. 6 I. 6g/L。在本發(fā)明的另ー個方面，液體發(fā)酵培養(yǎng)基包括溶劑水，碳源I 500g/L，氮源I 10g/L，磷酸0. I 5ml/L，除此之外還含有無機鹽0. 01 10g/L ;優(yōu)選地，所述發(fā)酵的液體發(fā)酵培養(yǎng)基包括溶劑水，碳源10 60g/L，氮源2 5g/L，磷酸0. 66 2ml/L，除此之外還含有無機鹽0. 55 2. 4g/L ;進一步優(yōu)選地，所述發(fā)酵的液體發(fā)酵培養(yǎng)基包括溶劑水，碳源30 47g/L,氮源3 4g/L,磷酸I. 3 2. 2ml/L,除此之外還含有無機鹽I I. 5g/し其中，碳源可以選自葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、糖蜜和甘油中的ー種或多種；氮源可以選自蛋白胨、酵母膏、玉米漿和硫酸銨中的ー種或多種；無機鹽可以選自鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、鐵鹽、鹽酸鹽中的ー種或多種。液體發(fā)酵培養(yǎng)基將其pH調(diào)節(jié)到2. 5 9. 5 ;優(yōu)選地，調(diào)節(jié)到為4 6 ;進一步優(yōu)選地，調(diào)節(jié)到為4 5。該pH調(diào)節(jié)可采用氨水進行。在上述發(fā)酵方法中，發(fā)酵溫度可以為29 37°C，優(yōu)選為30 33°C;發(fā)酵時間可以為12 20小時，優(yōu)選為16 18小時。其中，發(fā)酵前按照體積比為I 30 100，優(yōu)選為8 12 : 100的接種量接種。本發(fā)明的有益效果包括I.與傳統(tǒng)的輻射法及化學(xué)誘變劑相比，離子束誘變具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳穩(wěn)定、易于獲得理想新品種等特點。2.本發(fā)明的核糖核酸高產(chǎn)菌熱帶假絲酵母菌RJ-36 (CGMCC No. 4204)，具有高產(chǎn)性狀穩(wěn)定的特點，該菌株經(jīng)過20代的傳代，生產(chǎn)核糖核酸的性能保持穩(wěn)定。3.本發(fā)明的核糖核酸高產(chǎn)菌熱帶假絲酵母菌RJ-36 (CGMCC No. 4204)能夠利用多種碳源和氮源發(fā)酵生產(chǎn)核糖核酸，操作方便簡單。牛物材料的保藏?zé)釒Ъ俳z酵母菌(Candida tropicalis) RJ-36已經(jīng)于2010年09月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4204。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，根據(jù)下述實施例可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易理解的是，實施例所描述的具體物料配比、エ藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書所涵蓋的本發(fā)明的范圍。實施例I以從實驗室分離得到的產(chǎn)核糖核酸的菌株為出發(fā)菌株，將經(jīng)N+離子束誘變(低能、離子注入機靶室內(nèi)真空度為2X10_4，注入能量為50kev，劑量為5X1013ions ·αιΓ2 -s^1)后的孢子懸浮液經(jīng)無菌水稀釋100倍后，取O. Iml涂布于麥芽汁平板培養(yǎng)基上30°C下培養(yǎng)3天，從中挑選單菌落在麥芽汁斜面培養(yǎng)3天。轉(zhuǎn)接ー環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基糖蜜(可購自上海實驗試劑有限公司奧佳化工有限公司，以下同)30g/L，硫酸銨10g/L，酵母膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，以下同)20g/L，氯化鉀I. 5g/L，NaCl O. lg/L，pH 4. O)的500mL搖瓶中，于32°C下IlOrpm搖床培養(yǎng)24小時。再轉(zhuǎn)接IOmL于裝有IOOmL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(糖蜜 47. 21g/L，(NH4)2SO4 2g/L,H3PO4 O. 66ml/L,MgSO4 O. 5g/L,FeSO4 0.05g/L，用氨水將培養(yǎng)基PH調(diào)節(jié)為4. O)的500mL搖瓶中，于32°C下240rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)16小時。經(jīng)過初篩，得到90株比出發(fā)菌株產(chǎn)量高的突變株。用同樣的條件下進行復(fù)篩，最終得到產(chǎn)量最高的菌株RJ-36，菌體RNA含量可達到菌體干重的17%，比原始菌株的9%提高了 8%。實施例2將菌株RJ-36從麥芽汁斜面轉(zhuǎn)接ー環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(糖蜜10g/L，硫酸銨 5g/L，酵母膏 10g/L，氯化鉀 O. lg/L，NaCl O. 5g/L，pH4. O)的 500mL 搖瓶中，于 33°C下IIOrpm搖床培養(yǎng)24小時。轉(zhuǎn)接8mL于裝有IOOmL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(糖蜜60g/L，(NH4)2SO4I. Og/L，H3PO4 0. 66ml/L，MgSO4 0. 2g/L，F(xiàn)eSO4 2. 0g/L，用氨水將培養(yǎng)基 pH 調(diào)節(jié)為 5. 5)的500mL搖瓶中，于30°C下240rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)16小時。菌體RNA含量可達到菌體干重的15%。實施例3將菌株RJ-36從麥芽汁斜面轉(zhuǎn)接ー環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖25g/L，硫酸銨15g/L，玉米漿(可購自華北制藥集團有限責(zé)任公司，以下同)30g/L，氯化鉀6g/L7NaCl 8g/L，pH 6. O)的500mL搖瓶中，于31°C下IlOrpm搖床培養(yǎng)24小時。轉(zhuǎn)接IOmL于裝有 IOOmL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基(麥芽糖 47g/L，(NH4)2SO4 3g/L，H3PO4 lml/L，MgSO4 O. 8g/L,FeSO4 I. 6g/L，用氨水將培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)為5. O)的500mL搖瓶中，于32°C下240rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)17小吋。菌體RNA含量可達到菌體干重的16%。實施例4將菌株RJ-36從麥芽汁斜面轉(zhuǎn)接ー環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(甘油40g/L，硫酸銨 30g/L，尿素 20g/L，氯化鉀 10g/L，NaCl 5g/L，pH 4. O)的 500mL 搖瓶中，于 30°C下IlOrpm搖床培養(yǎng)24小吋。轉(zhuǎn)接12mL于裝有IOOmL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(蔗糖30g/L，(NH4)2SO44g/L, H3PO4 I.、 5ml/L，MgSO4 I. 5g/L，F(xiàn)eSO4 0. 8g/L，用氨水將培養(yǎng)基 pH 調(diào)節(jié)為 4. O)的500mL搖瓶中，于32°C下240rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)18小時。菌體RNA含量可達到菌體干重的16%。實施例5將菌株RJ-36從麥芽汁斜面轉(zhuǎn)接ー環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(麥芽糖40g/し硫酸銨30g/L，蛋白胨30g/L，氯化鉀10g/L，NaCl 5g/L，pH 6. O)的500mL搖瓶中，于33°C下IlOrpm搖床培養(yǎng)24小吋。轉(zhuǎn)接12mL于裝有IOOmL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 5g/L，H3PO4 2ml/L，MgSO4 2g/L，F(xiàn)eSO4 0. 2g/L，用氨水將培養(yǎng)基 pH 調(diào)節(jié)為 5. 0)的500mL搖瓶中，于33°C下240rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)18小時。菌體RNA含量可達到菌體干重的 15%。實施例6將菌株RJ-36連續(xù)傳10代，在實施例3的培養(yǎng)條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)核糖核酸。結(jié)果表明(見表I和2)，連續(xù)10代遺傳培養(yǎng)，菌株RJ-36與未經(jīng)離子束誘變的出發(fā)菌株No. 121相比，生產(chǎn)核糖核酸的性能穩(wěn)定。表I連續(xù)傳I 5代的菌株No. 121的生產(chǎn)核糖核酸性能
_遺傳代數(shù)—I _ 2 _3_4_5_
RNA (%) 97496表2連續(xù)傳6 10代的菌株No. 121的生產(chǎn)核糖核酸性能
遺傳代數(shù) 6 7 8 9 10-RNA (%) 5 _ 8 _4_6_4.5_表3連續(xù)傳I 5代的菌株RJ-36的生產(chǎn)核糖核酸性能
權(quán)利要求
1.一種用于發(fā)酵生產(chǎn)核糖核酸的熱帶假絲酵母菌(Candida tropicalis),其特征在于，所述熱帶假絲酵母菌已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4204，保藏日期為2010年09月30日。
2.一種發(fā)酵生產(chǎn)核糖核酸的方法，其特征在于，所述方法包括采用權(quán)利要求I所述的熱帶假絲酵母菌進行發(fā)酵。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵的液體種子培養(yǎng)基包括溶劑水，碳源I 300g/L，氮源I 100g/L，除此之外還含有無機鹽O. 01 100g/L ;優(yōu)選地，所述發(fā)酵的液體種子培養(yǎng)基包括溶劑水，碳源10 30g/L，氮源10 30g/L，除此之外還含有無機鹽0. I 10g/L ;進一步優(yōu)選地，所述無機鹽的含量為0. 6 I. 6g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3中任一項所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵的液體發(fā)酵培養(yǎng)基包括溶劑水，碳源I 500g/L,氮源I 10g/L,磷酸0. I 5ml/L,除此之外還含有無機鹽0. 01 10g/L ;優(yōu)選地，所述發(fā)酵的液體發(fā)酵培養(yǎng)基包括溶劑水，碳源10 60g/L，氮源2 5g/L，磷酸0. 66 2ml/L，除此之外還含有無機鹽0. 55 2. 4g/L ;進一步優(yōu)選地，所述發(fā)酵的液體發(fā)酵培養(yǎng)基包括溶劑水，碳源30 47g/L，氮源3 4g/L，磷酸I. 3 2. 2ml/L，除此之外還含有無機鹽I I. 5g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4中任一項所述的方法，其特征在于，所述碳源選自糖蜜、葡萄糖、甘油、麥芽糖、蔗糖中的ー種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述氮源選自蛋白胨、酵母膏、玉米漿、尿素和硫酸銨中的ー種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述無機鹽選自鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、鐵鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽中的ー種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的方法，其特征在于，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為2. 5 9. 5 ;優(yōu)選地，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為4 6 ;進一步優(yōu)選地，為4 5。
9.根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項所述的方法，其特征在干，所述發(fā)酵的溫度為29 37°C，發(fā)酵的時間為12 20小時；優(yōu)選地，所述發(fā)酵的溫度為30 33°C，發(fā)酵的時間為16 18小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至9中任一項所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵前按照體積比為I 30 : 100的接種量接種；優(yōu)選地，所述發(fā)酵前按照體積比為8 12 : 100的接種量接種。
11.權(quán)利要求I所述的熱帶假絲酵母菌在發(fā)酵生產(chǎn)核糖核酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于發(fā)酵生產(chǎn)核糖核酸的熱帶假絲酵母菌及其應(yīng)用，該熱帶假絲酵母菌的保藏編號為CGMCC No.4204。保藏編號為CGMCC No.4204的本發(fā)明的熱帶假絲酵母菌RJ-36菌株菌體RNA含量可達到菌體干重的17％，比出發(fā)菌株的RNA產(chǎn)量提高了8％。該菌株經(jīng)過10代以上傳代，生產(chǎn)RNA的性能保持穩(wěn)定。
文檔編號C12P19/34GK102676406SQ201110063488
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者任華景, 吳菁嵐, 應(yīng)漢杰, 曹家明, 柏建新, 熊健, 謝婧婧, 陳勇, 陳曉春 申請人:南京同凱兆業(yè)生物技術(shù)有限責(zé)任公司, 南京工業(yè)大學(xué)