專利名稱：黑青斑河鲀干擾素IFNγ2及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黑青斑河飩II型干擾素IFNY2的編碼基因、蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細胞免疫因子Y干擾素(IFN Y)，作為干擾素系統(tǒng)中重要的II型IFN，是主要的巨噬細胞刺激因子和調(diào)控免疫反應(yīng)的關(guān)鍵信號分子，能激活效應(yīng)細胞，提高自然殺傷細胞 (NK)和巨噬細胞活性，促進免疫球蛋白的轉(zhuǎn)換，具有抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)和增強機體免疫功能等作用。干擾素IFNyI和IFNY2基因是魚類IFNY基因的兩個亞型，其氨基酸序列的特征是含有兩個保守結(jié)構(gòu)，包括氨基酸序列中的6個α-螺旋和在靠近其氨基酸序列C 端的F螺旋中均存在[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E-[LF]-X2-[IV]這個保守結(jié)構(gòu)，這與已研究過的其他區(qū)中的IFNy 二級結(jié)構(gòu)類似。IFNY具有廣泛的生物學(xué)活性。目前已知干擾素作為細胞因子的重要類型，是細胞和機體受到病毒感染或受核酸、細菌內(nèi)毒素等誘導(dǎo)時，由受體細胞分泌的一種具有廣譜抗病毒活性的糖蛋白，能誘導(dǎo)細胞進入抗病毒狀態(tài)。IFNy是由Thl細胞產(chǎn)生的細胞因子。 它主要通過與其受體結(jié)合，活化JAK-STAT信號通路，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，包括相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和免疫分子，如STATl、IRFl、ICSBP和MHC II等，從而誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生毒性物質(zhì)消滅胞內(nèi)細菌，誘導(dǎo)宿主內(nèi)一些抗病毒蛋白的合成，調(diào)節(jié)T細胞的增殖和分化以及增強抗原提呈作用，達到保護宿主的目的。IFNy抗病毒機理主要是能提高細胞表面MHC類分子表達，有助于向細胞毒性T 細胞遞呈抗原，引起靶細胞的溶解，此外還可以通過下游基因的轉(zhuǎn)錄及抗病毒效應(yīng)基因表達而達到抗病毒作用。對于表達MHC I類抗原的細胞，IFN γ可以誘導(dǎo)I類抗原以更高的水平表達；對于無法檢測到的I類抗原基本表達水平的細胞，IFNy也可以誘導(dǎo)I類抗原的表達，且一般比I型干擾素IFNa/β具有更強的作用。在體注射IFNY可以導(dǎo)致許多組織中I類抗原表達水平的廣泛增高。IFNy對MHC II類分子表達的調(diào)節(jié)作用MHC II類分子僅存在于專職的抗原呈遞細胞(如樹突狀細胞及B細胞)，其他細胞中MHC II類分子均可由IFNy 誘導(dǎo)產(chǎn)生。II類抗原呈遞途徑的所有關(guān)鍵基因的正常表達都是必需的，它們受一個單一的受IFNy誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子II類反式激活蛋白(c II TA)的調(diào)節(jié)。IFNy能夠激活吞噬細胞的殺菌活性?；罨木奘杉毎憩F(xiàn)最突出的是對許多細胞內(nèi)的和吞噬的生物體如分支桿菌、剛地弓形蟲、錐蟲和利什曼原蟲的殺菌活性大大增強。與哺乳動物相似，魚類IFN γ重組蛋白能夠影響刺激免疫細胞的增殖，增加IFN γ 自身的基因表達，以及誘導(dǎo)下游免疫基因，如MHC II和Mx基因的表達。Mx是IFN系統(tǒng)中熟為人知的抗病毒蛋白，作為一種GTP酶，它主要通過干擾病毒的聚合酶來抑制RNA的復(fù)制， 從而發(fā)揮抗病毒的作用。它主要受I型IFN誘導(dǎo)大量表達發(fā)揮其作用，II型IFN對其有一定的誘導(dǎo)作用。重組的IFNy可影響魚類的細胞免疫反應(yīng)。初步研究的結(jié)果表明，一定濃度的重組虹鱒IFNy在RTS-Il cells中會促進下游免疫基因IPlO和MHC II β的表達。
近年來魚類病害發(fā)生頻繁，其中某些疾病給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成災(zāi)難性的危害，這就使得免疫防治技術(shù)在魚病防治中呈現(xiàn)出日趨廣闊的應(yīng)用前景。IFNy由于其抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)和增強機體免疫功能等作用在哺乳動物中的應(yīng)用已非常廣泛，對人的臨床應(yīng)用治療疾病方面也已很普遍。而其在魚類的研究與應(yīng)用才開始起步，可以預(yù)測其具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中魚類免疫防治中沒有IFNy的缺陷，提供一種黑青斑河飩干擾素IFN γ 2。本發(fā)明的另一目的是提供黑青斑河飩干擾素IFNY2的編碼基因。本發(fā)明的又一目的是提供黑青斑河飩干擾素IFNY2的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供黑青斑河飩干擾素IFN γ 2的應(yīng)用。、 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
一種黑青斑河飩干擾素IFN γ 2，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，共188個氨基酸； 等電點為10. 131，分子量為21. 55千道爾頓。黑青斑河飩干擾素IFN γ 2氨基酸編碼序列含有一段N段信號肽序列，使用Jpred方法預(yù)測其蛋白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它含有6個α-螺旋結(jié)構(gòu)，且在靠近其氨基酸序列C端的F螺旋中存在[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E-[LF]-X2-[ IV]這個保守結(jié)構(gòu)，這與其他已鑒定的IFNy —樣。此外，對IFN γ 2進行糖基化位點的預(yù)測發(fā)現(xiàn)其含有一個糖基化位點。同時，通過對氨基酸序列的C末端進行分析，發(fā)現(xiàn)在黑青斑河飩IFN γ 2氨基酸序列的C末端具有類似核定位序列(NLS)的RRRR序列。上述黑青斑河飩干擾素IFN γ 2的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。上述黑青斑河飩干擾素IFNY2的編碼基因的制備方法，其特征在于以黑青斑河飩總mRNA為模板，以RNA Oligo dT，其序列如SEQ ID NO: 3為引物，進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ； 再以cDNA為模板，設(shè)計上游引物SEQ ID N0:4，下游引物SEQ ID NO: 5，進行PCR，得到黑青斑河飩干擾素IFN γ 2的編碼基因。黑青斑河飩干擾素IFN γ 2可以通過表達載體在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達，具體制備方法是將黑青斑河飩IFN γ 2的編碼基因克隆至表達載體，得到重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，經(jīng)誘導(dǎo)后收集菌體，純化、酶切，得到黑青斑河飩干擾素IFN γ 2ο所述表達載體為大腸桿菌表達載體pET3h，重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建包括以下步驟以含黑青斑河飩干擾素IFN γ 2編碼基因的質(zhì)粒為模板，設(shè)計含有ife H
I酶切位點的上游引物SEQ ID N0:6，含歷idIII酶切位點的下游引物SEQ ID N0:7進行PCR，
PCR產(chǎn)物克隆到原核融合表達載體pET3h上，得到重組表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有6 XHis親和標記位點。該表達載體是以T7為啟動子，獲得的蛋白的C端有6XHis結(jié)構(gòu)，便于利用固定化金屬配體親和層析進行純化。所述培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的培養(yǎng)條件為接單菌落至含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250 rpm，振蕩培養(yǎng)過夜，按1: 50體積比接種到37°C預(yù)熱的含氨芐青霉素TB液體培養(yǎng)基中，37 °C，250 rpm，培養(yǎng)至0D600達到0. 6。大腸桿菌優(yōu)選BL21 (DE3)。
所述誘導(dǎo)為加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，經(jīng)誘導(dǎo)后收集菌體。誘導(dǎo)時間優(yōu)選為7小時，可以獲得最大的可溶性重組蛋白表達量。所述純化是將總菌體用Native Binding Buffer洗滌，再用Native Binding Buffer重懸，超聲處理后，高速離心獲得裂解上清液，經(jīng)固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白。所述酶切是用rEK酶，上述步驟獲得的重組蛋白N端含有Trx融合蛋白，根據(jù)融合蛋白上含有S-tag標簽，可以結(jié)合到S-protein Agarose上，而目的蛋白IFN γ 2不結(jié)合，可被洗脫，在經(jīng)過EKapture Agarose去除目的蛋白中的rEK酶，可得到單一的IFN γ 2重組目的蛋白。通過對培養(yǎng)時間、誘導(dǎo)時間和溫度等條件的摸索和優(yōu)化，使得到的融合蛋白的表達量較高，IFNY2大部分處于可溶狀態(tài)；優(yōu)化了重組蛋白的純化條件后，表達產(chǎn)物的超聲裂解液經(jīng)固定化金屬配體親和層析，得到的蛋白純度在90%以上。黑青斑河飩干擾素IFN γ 2在制備魚類免疫調(diào)節(jié)添加劑或魚類免疫佐劑中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明利用黑青斑河飩基因組數(shù)據(jù)庫結(jié)合分子生物學(xué)方法設(shè)計了特異性引物，PCR擴增克隆得到IFN γ 2基因的ORF序列，并構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中培養(yǎng)，可大量表達黑青斑河飩干擾素IFN γ 2基因所編碼的蛋白。本發(fā)明黑青斑河飩干擾素IFN γ 2基因所編碼的蛋白能夠誘導(dǎo)河飩頭腎細胞中的MX和ISG15基因的表達，豐富了魚類干擾素系統(tǒng)信號通路的理論，并能有效促進疫苗產(chǎn)生的免疫佐劑，還可作為增強魚類免疫的餌料添加劑。


圖1.黑青斑河飩干擾素IFN γ 2氨基酸序列與部分脊椎動物IFN γ氨基酸序列的比較結(jié)果圖，其中，在比較中采用空格以獲得最大的同源性序列，“——”表示此位置無此
氨基酸；
圖2.黑青斑河飩干擾素IFNY2成熟肽編碼序列PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中，M為 100 bp DNA Marker, NC為陰性對照，1為帶有酶切位點的IFN γ 2核苷酸目的片段； 圖3.基因IFN γ 2的重組表達質(zhì)粒構(gòu)建圖4.在N端含有Trx融合蛋白的黑青斑河飩干擾素IFN γ 2重組蛋白表達和純化的 SDS-PAGE (A)及Western雜交(B)分析圖，其中，M為蛋白質(zhì)分子量標準，1為未誘導(dǎo)總菌蛋白，2為誘導(dǎo)后總菌蛋白，3為經(jīng)純化脫鹽后的蛋白樣品；
圖5.切除黑青斑河飩干擾素IFNY2重組蛋白上的Trx融合蛋白后的IFNY2的 SDS-PAGE分析圖，M為蛋白質(zhì)分子量標準，1為IFN γ 2，2為Trx融合蛋白；
圖6.黑青斑河飩干擾素IFN γ 2對頭腎免疫細胞中ISG15和MX基因表達的影響，A為 IFN γ 2對ISG15基因表達的影響，B為IFN γ 2對MX基因表達的影響，*表示與對照組有顯著差異(Ρ<0. 05)。
具體實施例方式實施例1.黑青斑河飩干擾素IFN γ 2編碼基因的制備1.黑青斑河飩頭腎總RNA的提取
取健康黑青斑河飩(Tfeiraoi/o/ nigriviridis、八救物3 5cm，體重約4 6g，以20 300C循環(huán)過濾的水飼養(yǎng)，每天以赤蟲喂食一次。馴養(yǎng)2周后取健康的魚進行實驗。以冰浴麻醉約2 min后，殺魚取樣，分離出肝、脾、腸、頭腎、腮、心臟、皮膚及肌肉，存放于-80°C 冰箱備用。采用Trizol試劑法提取獲得黑青斑河飩頭腎總RNA，其OD26W = 1.85。2. cDNA第一鏈的合成
取5 μ g黑青斑河飩頭腎總RNA樣品進行DNA酶處理以去除基因組DNA的污染，與RNA Oligo dT (序列如SEQ ID NO:3所示)混合，進行反轉(zhuǎn)錄，所得產(chǎn)物置于-20°C保存?zhèn)溆谩?.黑青斑河飩干擾素IFN γ 2基因cDNA全序列的克隆
根據(jù)^isembl及NCBI的Tetraodon nigriviridis基因組數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，在 IFNy開放讀碼框兩端設(shè)計特異引物，上游引物序列如SEQ ID NO:4，下游引物序列如SEQ ID NO: 5，以步驟2合成的第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增片段大小為567 bp。所得PCR產(chǎn)物上樣至1. 8%瓊脂糖凝膠，以低電壓電泳分離DNA片段，從凝膠中純化回收目的產(chǎn)物。將純化后的目的產(chǎn)物連接至PTZ57 R/T載體轉(zhuǎn)化DH5ci大腸桿菌，挑選陽性克隆測序。Blast同源分析表明，目的產(chǎn)物為干擾素IFN γ 2基因的cDNA序列片段。實施例2黑青斑河飩干擾素IFN γ 2的制備 1.重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
根據(jù)干擾素IFN γ 2重組蛋白編碼基因的兩端序列合成一對引物，上游引物含有ife H I切割位點，序列如SEQ ID NO:6所示，下游引物含有歷·/ d III切割位點，其序列如SEQ ID NO:7所示。以含有干擾素IFN γ 2編碼基因的pTZ57R/T質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增，得到特異擴增的單一條帶，產(chǎn)物大小在570 bp左右，電泳結(jié)果如圖2。將PCR擴增產(chǎn)物克隆至原核表達載體pET22b上，得到重組表達載體(其構(gòu)建過程如圖3所示)。表達載體中的外源基因序列經(jīng)測序鑒定正確。2.黑青斑河飩干擾素IFN γ 2重組蛋白基因的表達
將步驟1中所構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)?；蚬こ叹暳呀馍锨褰?jīng) SDS-PAGE電泳分析表明，工程菌在受IPTG誘導(dǎo)后與無IPTG誘導(dǎo)的總菌蛋白相比在約35 kDa的地方出現(xiàn)一條蛋白條帶，與軟件估算的含有Trx融合蛋白的IFN γ 2重組蛋白分子量大小相近(圖4)。經(jīng)rEK酶切除1Trx融合蛋白后，SDS-PAGE電泳分析表明，IFN γ 2重組目的蛋白約在18.0—25.0 kDa之間的地方出現(xiàn)一條蛋白條帶，與軟件估算的重組IFN γ 2蛋白分子量大小相近(圖5)。對培養(yǎng)時間，誘導(dǎo)濃度，溫度等條件的優(yōu)化得出基因工程菌的最佳培養(yǎng)條件為接單菌落至5 ml的含氨芐青霉素LB加富液體培養(yǎng)基中，37°C，250 rpm，振蕩培養(yǎng)過夜；按1 50體積比接種到200 ml 37°C預(yù)熱的含氨芐青霉素TB液體培養(yǎng)基中，37°C，250 rpm，培養(yǎng)至0D600達到0. 6 ；在30°C，加入IPTG至終濃度0. 5mM,對IFN γ 2蛋白表達工程菌誘導(dǎo)7h， 可獲得最大的可溶性重組蛋白表達量。3.重組黑青斑河飩干擾素IFN γ 2的純化
將IFN γ 2蛋白表達工程菌總菌體用Native Binding Buffer洗滌，再用結(jié)合緩沖液重懸，超聲處理后，高速離心獲得裂解上清液，經(jīng)固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白，SDS-PAGE分析重組蛋白的表達和層析的結(jié)果。從SDS-PAGE結(jié)果可以得出6 XHis-黑青斑河飩干擾素IFNY2重組蛋白基因編碼的蛋白能被固定化鎳金屬親和層析柱所吸附， 用洗脫緩沖液洗鎳層析柱時，能把目的蛋白洗下(如圖4中3)。IFNY2重組蛋白的洗脫峰經(jīng)過G25凝膠柱更換緩沖液，去除所含咪唑。獲得的IFN γ 2重組蛋白N端含有Trx融合蛋白，經(jīng)rEK酶切除融合蛋白后，獲得單一的IFNY2目的蛋白(圖5中1)。實施例3.黑青斑河飩干擾素IFN γ 2對免疫相關(guān)基因表達影響的活性分析
用剪刀分離黑青斑河飩的頭腎組織，用烘好的磨砂玻片磨砂面進行研磨，磨至末狀; 將磨好的細胞與培養(yǎng)基一起過細胞濾網(wǎng)(BD Falcon, 70 μ m，Nylon)轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中；洗滌、離心后使用完全培養(yǎng)基(RPMI 1640含2 mM L-glutamine, 10% FBS和1% penicillin /streptomycin)2 ml重懸細胞，計數(shù)后將細胞數(shù)調(diào)整至1 X IO7 /mL，分別向 6孔培養(yǎng)板各孔中加入2 mL上述細胞懸浮液；分別向各分組孔中加入終濃度為1 ng/mL，10 ng/mL和100 ng/mLIFN γ 2重組蛋白的完全培養(yǎng)基2 mL，并設(shè)置陰性對照組(細胞懸浮液和完全培養(yǎng)基各2 mL)。將細胞培養(yǎng)板置于27°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育4 h后收集各孔細胞，Real Time-PCR檢測重組蛋白對ISG15和MX基因表達的影響。其中ISG15基因表達所用引物上游引物序列如SEQ ID NO: 10，下游引物序列如SEQ ID NO: 11 ;MX基因表達所用引物上游引物序列如SEQ ID NO: 12，下游引物序列如SEQ ID N0:13。18s rRNA作為內(nèi)參基因來調(diào)節(jié)各樣品模板cDNA量，反映重組蛋白的活化能力及對下游基因表達的影響。18s rRNA基因的上游引物序列如SEQ ID N0:8，下游引物序列如SEQ ID N0:9。每組六個重復(fù)， 數(shù)據(jù)用平均值士標準誤表示，*表示與對照組有顯著差異(P<0. 05)，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，在頭腎細胞中，10 ng/ml的重組IFN γ 2孵育頭腎細胞4小時后能顯著上調(diào)ISG15 mRNA水平，而高濃度的重組蛋白則對ISG15轉(zhuǎn)錄本沒有顯著影響。對于I型IFN的標志性因子MX基因，與之前研究相似，與其他物種II型IFN同源性較高的IFN γ 2對該基因無顯著性影響。
權(quán)利要求
1.一種黑青斑河飩干擾素IFN γ 2，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.權(quán)利要求1所述黑青斑河飩干擾素IFNY2的編碼基因，其核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
3.權(quán)利要求2所述黑青斑河飩干擾素IFNγ 2的編碼基因的制備方法，其特征在于以黑青斑河飩總mRNA為模板，以RNA Oligo dT，其序列如SEQ ID NO:3為引物，進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；再以cDNA為模板，設(shè)計上游引物SEQ ID N0:4，下游引物SEQ ID N0:5，進行PCR， 得到權(quán)利要求2所述黑青斑河飩干擾素IFN γ 2的編碼基因。
4.權(quán)利要求1所述黑青斑河飩干擾素IFNγ 2的制備方法，是將黑青斑河飩干擾素 IFN γ 2的編碼基因克隆至表達載體，得到重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，經(jīng)誘導(dǎo)后收集菌體，純化、酶切，得到黑青斑河飩干擾素IFN γ 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述表達載體為大腸桿菌表達載體 pET3h，重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建包括以下步驟以含黑青斑河飩干擾素IFNY2編碼基因的質(zhì)粒為模板，設(shè)計上游引物SEQ ID N0:6，下游引物SEQ ID NO: 7進行PCR，PCR產(chǎn)物克隆到 pET32a上，得到重組表達質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的培養(yǎng)條件為含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基，300C，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜，再接種到37°C預(yù)熱的含氨芐青霉素TB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D600達到0. 6。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述誘導(dǎo)為加入IPTG至終濃度為 0. 5mmol/L，誘導(dǎo)時間為7小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述純化是將總菌體用Native Binding Buffer洗滌，再用Native Binding Buffer重懸，超聲處理后，高速離心獲得裂解上清液，經(jīng)固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述酶切是用rEK酶。
10.權(quán)利要求1所述黑青斑河飩干擾素IFNγ 2在制備魚類免疫調(diào)節(jié)添加劑或魚類免疫佐劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黑青斑河鲀干擾素蛋白IFNγ2，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，該蛋白的編碼基因，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，編碼基因的制備方法，是用序列用SEQIDNO:4和SEQIDNO:5序列為引物克隆得到干擾素蛋白IFNγ2的編碼基因；同時還公開了干擾素蛋白IFNγ2的制備方法，是將黑青斑河鲀干擾素IFNγ2的編碼基因克隆至表達載體，得到重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，經(jīng)誘導(dǎo)后收集菌體，純化、酶切，得到黑青斑河鲀干擾素IFNγ2。本發(fā)明的黑青斑河鲀干擾素IFNγ2可以用于制備魚類免疫調(diào)節(jié)添加劑或免疫佐劑，具有誘導(dǎo)魚類免疫基因表達的作用。
文檔編號C12R1/19GK102180961SQ20111006444
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者盧丹琪, 張勇, 張旭, 林浩然, 汪婷, 貝錦新, 陳潔琳 申請人:中山大學(xué)