專利名稱：利用人工合成的抗菌肽基因培育抗萎病棉花的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及利用一種人工合成的抗菌肽基因培育抗黃萎病棉花的方法。
背景技術(shù)：
棉花不僅是世界上最重要的天然纖維作物，也是我國關(guān)系國計(jì)民生的重要物資， 棉花產(chǎn)業(yè)對(duì)我國紡織工業(yè)乃至整個(gè)國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展都具有舉足輕重的作用。但是，棉花黃萎病自1935年傳入我國以來，對(duì)我國棉花生產(chǎn)的危害逐年加重。黃萎病已成為當(dāng)前棉花實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要限制因素。該病屬土傳維管束病害，其特點(diǎn)是分布廣、危害重、寄主范圍廣、傳播途徑多、病原菌存活時(shí)間久，是棉花生產(chǎn)中最具毀滅性的病害之一。更重要的是我國主栽的陸地棉品種缺乏高抗黃萎病的種質(zhì)資源，生產(chǎn)上一直沒有找到能根治的措施，因此，黃萎病被稱為棉花生產(chǎn)的“癌癥”。生產(chǎn)實(shí)踐證明，選育和推廣抗病品種，是防治黃萎病最經(jīng)濟(jì)有效，而且是唯一有效的途徑(顧本康等，1996)。歷經(jīng)幾十年的努力，利用常規(guī)育種手段，我國獲得了一些對(duì)黃萎病具有一定抗病能力的地方品種，但是由于黃萎病菌變異快、小種多，具有明顯的致病力分化，針對(duì)黃萎病菌這種特性的廣譜抗性棉花品種基本沒有，因此在一個(gè)地區(qū)表現(xiàn)為抗病的棉種，到不同生理和地理?xiàng)l件下，就出現(xiàn)抗病性喪失的現(xiàn)象。另一方面，陸地棉栽培種內(nèi)高抗黃萎病的抗源缺乏，直接導(dǎo)致了我國棉花抗黃萎病育種進(jìn)程緩慢，特別是抗落葉型黃萎病育種基本沒有進(jìn)展。為此，解決生產(chǎn)中抗黃萎病資源缺乏的問題和尋找新的抗病育種方法已迫在眉睫，急需獲得具有廣譜和持久抗性的抗源以減輕棉花生產(chǎn)中黃萎病造成的巨大損失。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程分離、克隆和轉(zhuǎn)化抗性基因，不僅可以定向性地改良植物的抗病性，而且基因型來源豐富，不受抗源親緣關(guān)系限制，育種周期短，理論上不存在性狀負(fù)相關(guān)連鎖，一次克隆亦可用于多次轉(zhuǎn)化。因此，采用生物技術(shù)等多種育種方法，加快抗黃萎病育種進(jìn)程成為必然。抗菌蛋白或多肽(AMP, antimicrobial protein or ρ印tide)是一類由生物產(chǎn)生的具有抗菌活性的蛋白或多肽，廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中，具有抗菌譜廣、抗菌活性高和抗性持久等特點(diǎn)。另外，抗菌肽的抗菌機(jī)制特別，多以在膜上形成孔道導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏的方式摧毀病原菌，致使病原菌難以產(chǎn)生抗性(Yeaman等，2003)。因此，利用抗菌蛋白或抗菌肽提高植物的抗病性受到廣泛關(guān)注。植物抗病分子育種策略中，利用來自植物的抗菌蛋白或抗菌肽提高植物的抗病性是最常用的方法之一，因?yàn)橹参飦碓吹目咕霓D(zhuǎn)入植物中更易于受體植物的識(shí)別和整合。但是植物來源的抗菌肽轉(zhuǎn)入植物后病原菌易產(chǎn)生抗性或具有病原特異性，因此，要獲得對(duì)不同生理小種的黃萎病菌具有廣譜和持久抗性相對(duì)比較困難。而人工合成的非植物源的抗菌蛋白或抗菌肽卻能克服植物源抗菌肽的這種不足， 但是這類抗菌蛋白或抗菌肽可能會(huì)嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育。比如，郭余龍等(2003 )利用基因槍將抗菌肽基因cim轉(zhuǎn)入棉花，轉(zhuǎn)基因棉花葉片呈黃綠相間的條紋狀，電鏡掃描結(jié)果顯示，CEMA抗菌肽嚴(yán)重影響葉綠體片層結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供既能提高植物的抗病性，又不影響植物生長發(fā)育的一種人工合成的抗菌肽基因培育抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花的方法。本發(fā)明培育抗黃萎病棉花的方法，采用的技術(shù)方案是一種利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黃萎病棉花的方法，其特征在于，將人工合成的抗菌肽基因整合入陸地棉栽培種，實(shí)現(xiàn)抗菌肽基因在轉(zhuǎn)基因棉花中組成型表達(dá)，提高棉花對(duì)黃萎病的抗病能力。進(jìn)一步，所述利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黃萎病棉花的方法，包括如下步驟
步驟1 將CaMV35S啟動(dòng)子控制抗菌肽基因577C·的表達(dá)元件可操作地插入植物表達(dá)載體p5中，構(gòu)建植物表達(dá)載體p5-spCEMA ；
步驟2 將上述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主根癌農(nóng)桿菌，獲得轉(zhuǎn)化體； 步驟3 通過轉(zhuǎn)化體將植物表達(dá)載體整合入棉花基因組，然后，經(jīng)過Km抗性愈傷和胚性愈傷的誘導(dǎo)獲得體胚，體胚成苗后獲得抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因棉花植株；
步驟4:轉(zhuǎn)基因棉花經(jīng)室內(nèi)抗病鑒定和篩選獲得對(duì)黃萎病抗性的提高，表達(dá)適量的轉(zhuǎn)基因棉花材料。再進(jìn)一步，步驟3獲得的轉(zhuǎn)基因棉花再經(jīng)過后代性狀分離篩選，獲得抗病性狀穩(wěn)定遺傳的純合型轉(zhuǎn)基因棉花。本發(fā)明是利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CaMV35S組成型啟動(dòng)子控制spCEMA基因的重組植物表達(dá)載體p5-spCEMA導(dǎo)入棉花細(xì)胞中，經(jīng)組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因植物分子驗(yàn)證、基因表達(dá)檢測(cè)，以及室內(nèi)室外的抗病鑒定和篩選獲得對(duì)黃萎病抗性提高的轉(zhuǎn)基因棉花。本發(fā)明的有益效果在于，利用基因工程技術(shù)首先構(gòu)建了組成型啟動(dòng)子CaMV35S控制抗菌肽基因spCEMA的植物表達(dá)載體，然后將這些植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入棉花基因組。spCEMA是人工合成的一種新的抗菌肽基因，融合了抗病效果好的C·基因，但又能克服體內(nèi)表達(dá)CEMA蛋白對(duì)植物細(xì)胞的毒害作用，在提高植物抗病性的同時(shí)又不影響植物的生長發(fā)育。本發(fā)明通過組成型表達(dá)人工合成的抗菌肽基因5/^·，能將黃萎病菌控制在一定范圍內(nèi)，或阻止其在植株內(nèi)的進(jìn)一步生長，達(dá)到抗黃萎病的目的，培育抗黃萎病棉花新資源。培育的轉(zhuǎn)基因棉花材料對(duì)落葉型和非落葉型黃萎病病情指數(shù)小于10，可較非轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)照降低90%以上。本發(fā)明利用組成型啟動(dòng)子CaMV35S控制抗菌肽基因5/^·，達(dá)到抗菌肽基因在轉(zhuǎn)基因棉花植株內(nèi)組成型表達(dá)，篩選基因表達(dá)適量抗病效果好的株系，有效控制棉花黃萎病菌在植株內(nèi)的進(jìn)一步侵染和擴(kuò)展，達(dá)到抗黃萎病的目的。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便易行，效果顯著，獲得的抗黃萎病棉花材料可以為棉花抗黃萎病育種提供新的資源，服務(wù)于棉花生產(chǎn)，并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1是p5_spCEMA表達(dá)載體構(gòu)建流程圖。
圖2是p5雙元植物表達(dá)載體改造圖譜。圖3是轉(zhuǎn)基因棉花葉柄和葉片組織GUS化學(xué)染色結(jié)果；
A和B 轉(zhuǎn)基因棉花植株葉片和葉柄；C和D 野生型棉花植株葉片和葉柄。圖4是spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花PCR檢測(cè)結(jié)果；
M: Marker2000 ；1:野生型植株對(duì)照；2:質(zhì)粒陽性對(duì)照；3_12: 577C·轉(zhuǎn)基因棉花植株；13:水對(duì)照；黑色箭頭示150bp的特異擴(kuò)增帶。圖5是轉(zhuǎn)基因棉花中spCEMA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)；
1 轉(zhuǎn)基因非純合株系中分離的GUS陰性非轉(zhuǎn)基因植株(null);2-7轉(zhuǎn)基因棉花
植株；spCEMA:以轉(zhuǎn)基因和⑶S陰性植株cDNA為模板擴(kuò)增基因的結(jié)果；HIS3:以轉(zhuǎn)基因和⑶S陰性植株cDNA為模板擴(kuò)增基因的結(jié)果；RNA as template:以RNA為模板擴(kuò)增///幻基因的結(jié)果。spCEMA基因擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，///幻基因擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)。圖6是人工氣候室接種落葉型黃萎病菌15d，spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花 ；、T1和T2代株系的病情指數(shù)；
Null 未純合轉(zhuǎn)基因棉花株系中分離的非轉(zhuǎn)基因棉花植株；SP-5 組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花株系。圖7是人工氣候室接種落葉型黃萎病菌15d，spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花植株表型。圖8是田間接種落葉型黃萎病菌30d，spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花株系的發(fā)病率和病情指數(shù)；
Null 未純合轉(zhuǎn)基因棉花株系中分離的非轉(zhuǎn)基因棉花植株；SP-5 組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花株系。圖9是田間接種落葉型黃萎病菌30d，spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花植株的表型。圖10是田間接種落葉型黃萎病菌的植株生長后期莖內(nèi)部組織的病情指數(shù)； Null 未純合轉(zhuǎn)基因棉花株系中分離的非轉(zhuǎn)基因棉花植株；SP-5 組成型表達(dá)
的轉(zhuǎn)基因棉花株系。圖11是田間接種落葉型黃萎病菌的植株生長后期莖內(nèi)部組織的病癥。圖12是田間接種非落葉型黃萎病菌30d，spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花的發(fā)病率和病情指數(shù)；
Null 未純合轉(zhuǎn)基因棉花株系中分離的非轉(zhuǎn)基因棉花植株；SP-5 組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花株系。圖13是田間接種非落葉型黃萎病菌30d，spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花的表型。圖14是田間接種非落葉型黃萎病菌的植株生長后期莖內(nèi)部組織的病情指數(shù)； Null 未純合轉(zhuǎn)基因棉花株系中分離的非轉(zhuǎn)基因棉花植株；SP-5 組成型表達(dá)
的轉(zhuǎn)基因棉花株系。圖15是田間接種非落葉型黃萎病菌的植株生長后期，spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花莖內(nèi)部組織的病癥。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但以下說明并不對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定，任何對(duì)本發(fā)明的變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。本發(fā)明實(shí)施實(shí)例中的藥品試劑未進(jìn)行具體說明的均為國產(chǎn)常規(guī)化學(xué)試劑，材料方法未進(jìn)行具體說明的均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Sambrook和Russell，2001)。(一)轉(zhuǎn)基因棉花的獲得及分子驗(yàn)證 UDNA的提取
1.1 DNA提取緩沖液
(1)植物DNA提取緩沖液 CTAB 提取液100 mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)，20 mmol/L EDTA (pH8. 0)，1. 5 mol/ L NaCl，2% CTAB (w/v)，4% PVP40 (w/v)和2%巰基乙醇(ν/ν)，PVP和巰基乙醇使用前加入。TE 溶液10mmol/L Tris-HCl ρΗ8· 0，1 mmol/L EDTA。堿裂解法質(zhì)粒DNA提取緩沖液
STE溶液0. 1 mol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8· 0)，1 mmol/L EDTA (pH 8. 0)。溶液I :50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),10 mmol/L EDTA (ρΗ8· 0)。溶液II :0. 2 mol/L NaOH, 1% (w/v) SDS。溶液III 50 mL 5 mol/L 乙酸鉀，11. 5 mL 冰醋酸，28. 5 mL 水。質(zhì)粒DNA的提取
根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的提取按盧圣棟方法(1993)略作修改。取根癌農(nóng)桿菌菌液1 mL, 10，000 r/min離心1 min收集菌體；用200 mL STE溶液重懸菌體后，離心(10，000 r/min, 1 min)收集菌體；加入180 mL溶液I和20 mL溶菌酶后再重懸菌體，37° C溫浴30 min，加入400 mL溶液II，上下顛倒多次，冰浴不超過3 min ； 再加入300 mL冰預(yù)冷的溶液III，上下顛倒多次，冰浴3 min。12,000 r/min,4° C離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；等體積的酚氯仿異戊醇(25: : 1)和等體積的氯仿 異戊醇(24:1)先后各抽提一次；再將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管，加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫靜置2 min ；12, 000 r/min、4° C離心10 min收集沉淀DNA，然后用75%的乙醇洗滌沉淀一次；室溫干燥，50 mL TE溶解沉淀即得到質(zhì)粒DNA。 棉花基因組DNA的提取方法
采用改良的CTAB法(Doyle，1987;肖月華等，2002a)提取棉花組織DNA，方法為 棉花植株幼嫩葉片組織0.5-lg，在液氮中迅速研成粉末，加入3 mL 65°C預(yù)熱的CTAB 提取液，快速振蕩混勻，65°C水浴30 min，加入1 mL 5 mol/L KAc冰浴20 min。用等體積的氯仿異戊醇(24:1)抽提1次，10, OOOrpm, 4°C離心5min,上清液加入2/3倍體積-20°C 預(yù)冷的異丙醇，混勻，-20°C靜置30 min，用玻棒挑出絮狀沉淀，并用75%的乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次，再用無水乙醇漂洗一次，風(fēng)干后重懸于500 μ L TE溶液。加入10mg/mL的RNaseA 2 μ L, 37°C處理lh，然后用酚(pH8. 0)氯仿異戊醇(25:24:1)和氯仿異戊醇(24:1)各抽提一次，10，OOOrpm, 4°C離心5min，上清液加入2倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，離心棄上清液。 沉淀用75%的乙醇漂洗，風(fēng)干，溶于200 μ 1 TE溶液，-20 °C保存?zhèn)溆谩?
、棉花RNA (核糖核酸，即Ribonucleic Acid，存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體)的提取2.1 RNA提取緩沖液
CTAB 提取緩沖液2%CTAB (w/v)，2% 聚乙烯吡咯烷酮 PVP40 (w/v)，1 OOmmo 1/ L Tris-HCl (pH8. 0，DEPC 處理的水配制)，25mmol/L EDTA，0. 5g/L 亞精胺 Spermidine, 2. Omol/L恥(1，^)巰基乙醇(￥八，使用前加入)。SSTE溶解液lmol/L NaCl，0. 5%SDS(w/v), lOmmol/L Tris_HCl(pH8. 0)，1. Ommo 1/ L EDTA0RNA提取方法
用CTAB法提取棉花組織的總RNA。取約3g棉花組織新鮮材料，在液氮中迅速研成粉末， 裝入DEPC水處理的50ml離心管，然后加入15ml 65°C預(yù)熱的RNA提取液，顛倒混勻后65°C 水浴:3min，8，000 rpm、4° C離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入一新的DEPC水處理的50ml離心管， 用等體積的氯仿異戊醇(24:1)抽提兩次。10，OOOrpmm，室溫離心5min后取上清液，加入 1/4體積10 mol/L LiCl溶液，4°C放置6h以上，10，OOOrpm, 4° C離心10 min，棄上清液， 沉淀用500yL SSTE溶解。再用等體積的酚(pH4. 5):氯仿異戊醇(25: : 1)和氯仿異戊醇(24:1)各抽提一次，10, OOOrpm,室溫離心5min，上清液加入2倍體積-70° C預(yù)冷的無水乙醇，-70° C沉淀30min以上。12，000rpm，4° C離心10 min，棄上清液，沉淀用200 μ L 的DEPC處理水溶解，非變性凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA質(zhì)量后，-80° C保存、spCEMA植物表達(dá)載體的構(gòu)建
3.1組成型表達(dá)spCEMA基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建
人工合成的spCEMA基因序列與pUC-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子。以含有MT//篩選標(biāo)記基因和^依報(bào)告基因的植物表達(dá)載體ρ5為基本骨架， 將基因連接入載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建組成型表達(dá)的植物表達(dá)載體，并命名為 p5-spCEMA。p5-spCEMA植物表達(dá)載體構(gòu)建流程圖見圖1。所有限制性內(nèi)切酶均購自Roche 公司，按照使用說明書操作完成。P5植物表達(dá)載體為改選常用的PBI121載體而得，改選的流程圖見圖2。植物表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404
參考Bio-RAD MicroPulser用戶說明書，將構(gòu)建的組成型表達(dá)基因的植物表達(dá)載體P5-spCEMA通過電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒，并利用HimdIII 和EcoR I進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，獲得農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化子。、棉花的遺傳轉(zhuǎn)化
4.1根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化常用培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基MSB (MS 無機(jī)鹽+B5 有機(jī))(Τ· Murashige, 1962 ；0. L. Gamborg, 1968)； 種子萌發(fā)培養(yǎng)基1/2 MSB+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂，自來水配制，自然pH; 共培養(yǎng)培養(yǎng)基MSB+0. 5mg/L IAA (吲哚乙酸)+0. lmg/L KT (6-糠氨基嘌呤)+30g/L 葡萄糖+100 μ mol/L 乙酰丁香酮+2.0g/L Gelrite (Sigma)，ρΗ5· 4 ；
篩選脫菌培養(yǎng)基MSB+0. 5mg/L IAA+0. lmg/L KT+75mg/L Km (卡那霉素)+500mg/L cef (頭孢霉素)+30g/L 葡萄糖 +2. 0g/L Gelrite，pH5. 8 ；
愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB+0. 5mg/L IAA+0. lmg/L KT+75mg/L Km+200mg/L cef +30g/L 葡萄糖 +2. Og/L Gelrite, ρΗ5· 8 ；
胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB+0. lmg/L KT+30g/L 葡萄糖 +2. Og/L Gelrite, ρΗ5· 8 ； 液體懸浮培養(yǎng)基:MSB+1. 91g/L硝酸鉀+0. lmg/L KT+30g/L葡萄糖，ρΗ5· 8 ； 體胚成熟培養(yǎng)基MSB +15g/L 蔗糖+15g/L 葡萄糖 +0. lmg/L KT+2. 5g/L Gelrite, pH6. 0 ；
成苗培養(yǎng)基:SH +0. 4g/L活性碳+20g/L 蔗糖，pH6. 0。(Schenk & Hildebrandt, 1972)
4. 2棉花遺傳轉(zhuǎn)化具體操作方法
(1)轉(zhuǎn)化外植體的獲得和農(nóng)桿菌浸染液的制備
陸地棉種子去殼，籽仁0. 1%升汞滅菌lOmin，無菌自來水漂洗5_6次后，接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)5-7d。無菌下胚軸切成3-5mm長的切段，作為轉(zhuǎn)化外植體。轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌浸染液的制備
利用劃線法獲得整合植物表達(dá)載體p5-spCEMA的農(nóng)桿菌單菌落，然后挑取單菌落接種入附加50mg/L Km和125mg/L Sm (鏈霉素)IOmL液體YEB (5g/L蔗糖，lg/L細(xì)菌用酵母抽提物，10g/L細(xì)菌用胰化蛋白胨，0. 5g/L MgSO4 · 7Η20, ρΗ7· 0)，28°C、200rpm培養(yǎng)過夜，然后按5%的比例將菌液接種入20mL不含抗生素的液體YEBJ8°C、200rpm培養(yǎng)至0D600約為 0. 5。取5mL菌液6000rpm離心5min收集菌體，再用5mL不添加Gelrite共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基重懸菌體，重懸菌液即為浸染外植體的農(nóng)桿菌浸染液。下胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化和胚性愈傷的誘導(dǎo)
外植體用農(nóng)桿菌浸染液浸染20min，傾去菌液，再用無菌濾紙吸去外植體表面多余的菌液，浸染后的下胚軸切段接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，26°C暗培養(yǎng)2d，將下胚軸接種至篩選脫菌培養(yǎng)基，20d后繼代入附加卡那霉素(Km)和頭孢霉素(cef)的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷的誘導(dǎo)，間隔20d繼代一次，60d后繼代入胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，獲得胚性愈傷后進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)，以獲得大量生長一致的胚性愈傷。體胚的誘導(dǎo)和成苗培養(yǎng)
液體懸浮培養(yǎng)的胚性愈傷，30目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，篩下的胚性愈傷均勻分散地接種入體胚成熟培養(yǎng)基，約15d產(chǎn)生大量的體胚，將其繼代入SH培養(yǎng)基，促進(jìn)體胚進(jìn)一步成苗。3-4 葉的再生苗移栽入溫室進(jìn)行繁殖。、spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花的獲得和分子驗(yàn)證
按照4的棉花遺傳轉(zhuǎn)化和再生方法，將位·基因轉(zhuǎn)入棉花基因組。歷經(jīng)Km抗性愈傷、胚性愈傷和體胚的誘導(dǎo)，體胚成苗，然后獲得spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花植株。轉(zhuǎn)基因植株的⑶S組織化學(xué)染色
GUS 染色液500mg/L X-Gluc，0. lmol/L K3Fe (CN) 6,0. lmol/L K4Fe (CN)6,1% Triton X-100 (V/V),0. Olmol/L Na2EDTA, 0. lmol/L 磷酸緩沖液(pH7. 0)。P5-spCEMA植物表達(dá)載體含有35S啟動(dòng)子控制的基因，因此，轉(zhuǎn)基因植株首先可以利用⑶S組織化學(xué)染色法進(jìn)行快速鑒定。參照J(rèn)efferson (1987)的方法剪取Km抗性幼苗的葉柄和葉片組織少許，分別加入⑶S組織化學(xué)染色液中，37°C染色2h，然后95%乙醇脫色，至綠色去凈。最后出現(xiàn)圖3所示的藍(lán)色為轉(zhuǎn)基因陽性植株，否則為非轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因棉花PCR分析
以棉花幼嫩葉片為材料，提取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的總DNA，然后以總DNA為模板，序列1和2為引物擴(kuò)增基因片段。PCR 反應(yīng) 25 μ 1 總體系，包括 IXPCR buffer, 1. 5mmol/L 的 MgCl2,0. 2mmol/L 的 dNTPs，上下游引物均為 0. 2ymol/L，25ng DNA, IU Taq DNA 聚合酶。PCR反應(yīng)參數(shù):94°C預(yù)擴(kuò)增 5min，然后 94°C，30s ；55°C，30s ；72°C,60s ；30 個(gè)循環(huán)， 最后再72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。部分?jǐn)U增結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，所有經(jīng)GUS檢測(cè)為陽性的轉(zhuǎn)基因植株都能擴(kuò)增獲得目標(biāo)特異帶。的RT-PCR 分析
轉(zhuǎn)基因棉花植株分別以幼嫩葉片為材料，分別提取轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株 (null)葉片的RNA，按cDNA —鏈合成試劑盒說明書合成各樣品RNA的一鏈cDNA，然后以 CDNA為模板擴(kuò)增位■基因的特異片段。位■基因的上下游引物分別為序列1和序列 2。以棉花組蛋白基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)。HIS3的引物為序列3和序列4 (Zhu YQ等，2003)。25 μ 1 PCR 反應(yīng)體系包括1XPCR buffer, 1. 5mmol/L 的 MgCl2,0. 2mmol/L 的 dNTPs，上下游引物均為 0. 2ymol/L，lyL cDNA, IU Taq DNA 聚合酶。RT-PCR結(jié)果表明(圖5)，轉(zhuǎn)基因棉花植株內(nèi)spCEMA基因都能有效進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)， 而野生型植株幼莖和葉片內(nèi)都沒有檢測(cè)到基因的表達(dá)。(二)轉(zhuǎn)基因棉花的抗病鑒定
6、轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)黃萎病的抗病鑒定方法 6. 1抗病鑒定接種用病原菌的制備
挑取少許固體PD培養(yǎng)基(馬鈴薯培養(yǎng)基)保存的落葉型和非落葉型黃萎病菌接種入液體PD培養(yǎng)基，180rpm，振蕩培養(yǎng)7d，再按10% (菌液/PD培養(yǎng)基)的比例接種入液體PD 培養(yǎng)基，180rpm，^TC振蕩培養(yǎng)10d，用四層無菌紗布過濾去除菌液中的菌絲及雜質(zhì)，去離子水調(diào)整落葉型黃萎病菌孢子濃度達(dá)到IO8個(gè)/ml，非落葉型黃萎病菌孢子濃度達(dá)到IO9個(gè)/ ml作為接種菌液。人工氣候室內(nèi)抗病鑒定方法
T0代轉(zhuǎn)基因棉花4-6片真葉，其余世代3-4片真葉，生長相對(duì)一致的幼苗植株采用傷根灌菌液法接種病原菌。移栽入盆缽慢慢澆灌菌液IOOmL,盡量讓菌液濕潤有棉花植株的土壤團(tuán)，接種兩天后澆透水，以保持盆缽內(nèi)土壤的濕度。接種后于20°C (夜)_25°C (晝)，濕度 80%以上，14h光照/IOh暗培養(yǎng)的光周期條件下生長，接種15d按5級(jí)病級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(0級(jí)棉花植株外表無病癥 ’1級(jí):棉株葉片1/3以下顯病癥；2級(jí)棉株葉片1/3-2/3顯病癥；3 級(jí)棉株葉片2/3以上顯病癥；4級(jí)棉株葉片全部出現(xiàn)病癥，葉片和花蕾脫落嚴(yán)重或植株光桿甚至死亡)統(tǒng)計(jì)植株病級(jí)，并計(jì)算植株的發(fā)病率和病情指數(shù)。T0代每次接種均以野生型和空載載體轉(zhuǎn)基因棉花幼苗為對(duì)照。其余各世代以野生型和未純合株系分離的GUS陰性非轉(zhuǎn)基因植株為對(duì)照。落葉型黃萎病菌接種濃度為IO8個(gè)孢子/ml，非落葉型黃萎病菌接種濃度為IO9個(gè)孢子/ml。發(fā)病率和病情指數(shù)計(jì)算公式如下
_ 出.現(xiàn)病癥植稼數(shù)6.3田間病圃抗病鑒定方法
純合株系收獲的種子播種于苗床，3-4片真葉幼苗移栽入田間病圃時(shí)，采用傷根灌菌液法分別接種落葉型和非落葉型黃萎病菌。按2000株/畝的密度栽種，移栽時(shí)每株澆灌黃萎病菌液200ml，盡量讓菌液濕透營養(yǎng)團(tuán)，然后于幼苗周圍扶濕潤土壤，移栽兩天后澆透水， 以保證幼苗正常生長。接種25d后統(tǒng)計(jì)植株的發(fā)病率和病情指數(shù)。植株生長后期將莖桿均分為上部、中部和下部三部分，剖桿按5級(jí)病級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(0級(jí)莖內(nèi)部無變色；1級(jí)莖桿變暗褐色部分占剖面的25%以下；2級(jí)變色部分占50% ;3級(jí)變色部分占70%以上；4級(jí) 莖桿木質(zhì)部全部變暗褐色)統(tǒng)計(jì)莖桿不同部位內(nèi)部組織的病級(jí)，并計(jì)算病情指數(shù)。以接種分離于未純合轉(zhuǎn)基因株系的GUS陰性植株和野生型植株為對(duì)照，并設(shè)置未接種野生型植株對(duì)照。接種試驗(yàn)按隨機(jī)區(qū)組排列，試驗(yàn)重復(fù)三次，每個(gè)重復(fù)60株幼苗。落葉型黃萎病菌接種濃度為IO8個(gè)孢子/ml，非落葉型黃萎病菌接種濃度為IO9個(gè)孢子/ml。、人工氣候室內(nèi)spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花幼苗對(duì)黃萎病的抗性
按照6人工氣候室內(nèi)的抗病鑒定方法，spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花未純合株系植株，分別于人工氣候室接種落葉型黃萎病菌進(jìn)行抗病鑒定和篩選。人工氣候室內(nèi)，印位·轉(zhuǎn)基因株系植株接種落葉型黃萎病菌15d，T0^T1和T2代未純合株系中分離的非轉(zhuǎn)基因棉花植株的病情指數(shù)都達(dá)到100，而577C·株系SP-5 TpT1和 T2代的病情指數(shù)分別為25. 0,12. 5和18. 4，與非轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)照相比，差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)(圖6)。接種15d，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓陣?yán)重發(fā)病，植株因嚴(yán)重感染落葉型黃萎病菌葉片脫落，而抗病植株葉片沒有病癥，葉色鮮綠，生長正常(圖7)。轉(zhuǎn)基因棉花株系的病情指數(shù)和病癥表明，棉花內(nèi)組成型表達(dá)基因能顯著提高棉花對(duì)落葉型黃萎病的抗病性，利用spCEMA基因可培育抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因棉花。、田間spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)落葉型黃萎病的抗性
8. 1田間spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花苗期對(duì)落葉型黃萎病的抗性
按6田間病圃抗病鑒定方法，鑒定577C·轉(zhuǎn)基因棉花純合株系的抗病性。結(jié)果顯示， 3-4片真葉幼苗接種落葉型黃萎病菌30d，分離于未純合轉(zhuǎn)基因株系的非轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為100. 0%和95. 2 ；組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花株系SP-5的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為10. 0%和7. 8，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晗啾龋町惗歼_(dá)到極顯著水平 (Ρ<0. 01)(圖 8)。接種30d植株的表型見圖9，非轉(zhuǎn)基因植株因黃萎病菌的感染而嚴(yán)重發(fā)病，甚至因嚴(yán)重發(fā)病而死亡，而轉(zhuǎn)基因棉花植株葉片病癥不明顯或輕微發(fā)病，植株生長正常。田間spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花生長后期莖內(nèi)部組織表現(xiàn)的抗性
收獲纖維和種子后將植株莖桿均分為上中下三部分，然后剖桿統(tǒng)計(jì)莖內(nèi)部組織的病情指數(shù)，結(jié)果顯示(圖10)，非轉(zhuǎn)基因棉花植株莖下部、中部和上部的病情指數(shù)分別為100.0、 95. 7和87. 5 ;SP-5株系植株分別為12. 5、2. 5和0. 0。與非轉(zhuǎn)基因棉花植株相比，差異都達(dá)到極顯著水平(P<0. 01)。植株生長后期剖桿非轉(zhuǎn)基因棉花植株莖內(nèi)部的中心維管組織和木質(zhì)部部分都褐化變色，而轉(zhuǎn)基因棉花植株僅莖下部中心維管組織產(chǎn)生了褐色斑點(diǎn)，周圍木質(zhì)部和中部維管組織都沒有褐色病斑產(chǎn)生(圖11)。轉(zhuǎn)基因棉花株系植株苗期的病情指數(shù)和病癥，植株生長后期莖內(nèi)部組織的病情指數(shù)和變褐的病癥表明，棉花內(nèi)組成型表達(dá)基因能有效提高棉花對(duì)落葉型黃萎病的抗性，利用spCEMA基因可培育抗黃萎病棉花。、田間spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)非落葉型黃萎病的抗性
9. 1田間轉(zhuǎn)基因棉花苗期對(duì)非落葉型黃萎病的抗性 為明確轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)不同致病菌引起的黃萎病菌的抗性，人工氣候室內(nèi)抗病鑒定和篩選獲得的轉(zhuǎn)基因抗病株系，田間接種落葉型黃萎病菌的同時(shí)接種非落葉型黃萎病菌，接種30d統(tǒng)計(jì)植株的發(fā)病率和病情指數(shù)。結(jié)果表明(圖12)，接種非落葉型黃萎病菌30d， 非轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)照的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為98. 7%和92. 3，組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系SP-5分別為8. 1%和5. 0，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾炔町惗歼_(dá)到極顯著水平(P<0. 01)。接種30d，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖堪l(fā)病，多數(shù)植株葉片都出現(xiàn)了明顯的病癥，而轉(zhuǎn)基因株系僅個(gè)別植株下部葉片有少許病斑，對(duì)黃萎病的抗性明顯(圖13)。轉(zhuǎn)基因棉花植株接種非落葉型黃萎病菌的發(fā)病率、病情指數(shù)和病癥表明，組成型表達(dá)基因都能有效提高棉花對(duì)非落葉型黃萎病的抗性。田間spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花生長后期莖內(nèi)部組織表現(xiàn)的對(duì)非落葉型黃萎病的抗性 田間接種非落葉型黃萎病菌的轉(zhuǎn)基因棉花植株生長后期剖桿，根據(jù)6的方法統(tǒng)計(jì)植株
莖內(nèi)部組織的病情指數(shù)。結(jié)果表明(圖14)，非轉(zhuǎn)基因植株生長后期莖下部、中部和上部的病情指數(shù)分別為100. 0,92. 1和89. 4 ；SP-5株系分別為32. 1,14. 3和0. 0。轉(zhuǎn)基因株系不同莖段莖內(nèi)部組織的病情指數(shù)與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾龋町惗歼_(dá)到了極顯著水平(P<0. 01)。植株生長后期，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ涨o不同部位的中心維管組織和木質(zhì)部部分都褐化變色，而轉(zhuǎn)基因植株僅中心維管組織有輕微變色，上部中心維管組織和周圍木質(zhì)部部分都沒有明顯的變褐斑點(diǎn)(圖15)。轉(zhuǎn)基因棉花植株生長后期莖內(nèi)部組織的病情指數(shù)和褐化變色程度表明， spCEMA轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)非落葉型黃萎病抗性明顯，利用spCEMA基因能有效培育抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花。綜上，再生植株經(jīng)嚴(yán)格的分子生物學(xué)驗(yàn)證后，4-6片真葉的I；、T1和T2代幼苗分別于人工氣候室內(nèi)接種高濃度的落葉型黃萎病菌，經(jīng)抗性鑒定和篩選獲得抗性提高的株系 SP-5，并篩選獲得不再分離的純合轉(zhuǎn)基因株系。純合株系再于田間接種落葉型和非落葉型黃萎病菌，進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花的抗性穩(wěn)定性進(jìn)行鑒定。純合T3代田間抗病鑒定結(jié)果顯示，苗期轉(zhuǎn)基因株系與野生型對(duì)照相比，接種落葉型和非落葉型黃萎病菌的病情指數(shù)都可以較非轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)照降低90%以上。植株生長后期莖內(nèi)部組織的病情指數(shù)顯示，中上部莖內(nèi)部組織的病情指數(shù)與對(duì)照相比，都可以降低80% 以上。轉(zhuǎn)基因株系植株莖內(nèi)部組織的變褐現(xiàn)象主要集中在下部莖段的中部維管組織，周圍木質(zhì)部部分沒有肉眼可見的病癥，而野生型對(duì)照植株莖內(nèi)部各部位都嚴(yán)重褐化。說明在棉花內(nèi)組成型表達(dá)spCEMA可有效抑制棉花黃萎病菌在植株內(nèi)部滋生，提高棉花對(duì)黃萎病的抗性，培育抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花。本發(fā)明利用CaMV35S啟動(dòng)子控制人工合成的抗菌肽基因5/^·，實(shí)現(xiàn)該基因在轉(zhuǎn)基因棉花中組成型表達(dá)，有效提高轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)落葉型和非落葉型黃萎病的抗性，培育抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便易行，效果顯著，具有很好的市場(chǎng)前景。
序列表序列1 轉(zhuǎn)基因棉花內(nèi)SpCEMA基因PCR和RT-PCR擴(kuò)增上游引物 5， -TGGCTTGTGCTTCCTTTTC-3， (19bp)。序列2 轉(zhuǎn)基因棉花內(nèi)spCEMA基因PCR和RT-PCR擴(kuò)增下游引物 5， -CCTTACTTGGTCAACTTCA-3， (19bp)。序列3 棉花基因擴(kuò)增上游引物 5， - GAAGCCTCATCGATACCGTC -3’ QObp)。序列4 棉花基因擴(kuò)增下游引物 5， - CTACCACTACCATCATGGC -3， (19bp)。序列5 ,spCEMA基因序列(人工合成168bp)
1 ATGGAGAAGA AGTCTCTTGC TGGCTTGTGC TTCCTTTTCT TGGTTCTTTT TGTTGCTCAA GAAATTGTGG ；
71 TGACTGAAGC TAAGTGGAAG TTGTTCAAGA AGATCGGTAT CGGTGCTGTT
TTGAAGGTTT TGACTACTGG ；
141 ATTGCCAGCT TTGAAGTTGA CCAAGTAA。
權(quán)利要求
1.利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黃萎病棉花的方法，其特征在于，將人工合成的抗菌肽基因SpCEMA整合入陸地棉栽培種，實(shí)現(xiàn)抗菌肽基因SpCEMA在轉(zhuǎn)基因棉花中組成型表達(dá)，提高棉花對(duì)黃萎病的抗病能力。
2.如權(quán)利要求1所述利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黃萎病棉花的方法，包括如下步驟步驟1 將CaMV35S啟動(dòng)子控制抗菌肽基因spCEMA的表達(dá)元件可操作地插入植物表達(dá)載體p5中，構(gòu)建植物表達(dá)載體p5-spCEMA ；步驟2 將上述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主根癌農(nóng)桿菌，獲得轉(zhuǎn)化體；步驟3 通過轉(zhuǎn)化體將植物表達(dá)載體整合入棉花基因組，然后，經(jīng)過Km抗性愈傷和胚性愈傷的誘導(dǎo)獲得體胚，體胚成苗后獲得抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因棉花植株；步驟4:轉(zhuǎn)基因棉花經(jīng)室內(nèi)抗病鑒定和篩選獲得對(duì)黃萎病抗性的提高，基因表達(dá)適量的轉(zhuǎn)基因棉花材料。
3.如權(quán)利要求1所述利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黃萎病棉花的方法，其特征在于，步驟3獲得的轉(zhuǎn)基因棉花再經(jīng)過后代性狀分離篩選，獲得抗病性狀穩(wěn)定遺傳的純合型轉(zhuǎn)基因棉花。
4.如權(quán)利要求3所述利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黃萎病棉花的方法，其特征在于，所述抗病性遺傳穩(wěn)定的純合型轉(zhuǎn)基因棉花經(jīng)田間抗病鑒定和篩選獲得抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因棉花新資源。
5.如權(quán)利要求1所述利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黃萎病棉花的方法，其特征在于，所述步驟1構(gòu)建植物表達(dá)載體p5-spCEMA，是以含有NPTII篩選標(biāo)記基因和GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體P5為基本骨架，將基因連接入載體的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建組成型植物表達(dá)載體p5-spCEMA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用人工合成的抗菌肽基因培育抗萎病棉花的方法。它將人工合成的抗菌肽基因整合入陸地棉栽培種，實(shí)現(xiàn)抗菌肽基因spCEMA在轉(zhuǎn)基因棉花中組成型表達(dá)，提高棉花對(duì)黃萎病的抗病能力。本發(fā)明融合了抗病效果好的CEMA基因，但又能克服體內(nèi)表達(dá)CEMA蛋白對(duì)植物細(xì)胞的毒害作用，在提高植物抗病性的同時(shí)又不影響植物的生長發(fā)育。本發(fā)明通過組成型表達(dá)人工合成的抗菌肽基因spCEMA，能將黃萎病菌控制在一定范圍內(nèi)，或阻止其在植株內(nèi)的進(jìn)一步生長，達(dá)到抗黃萎病的目的，培育抗黃萎病棉花新資源。應(yīng)用這一方法可以獲得病情指數(shù)小于10左右的轉(zhuǎn)基因抗黃萎病棉花。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102174571SQ20111006486
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者侯磊, 宋水清, 李先碧, 李德謀, 羅小英, 羅明, 肖月華, 裴炎 申請(qǐng)人:西南大學(xué)