專利名稱：多種重要水源性人獸共患原蟲同時(shí)檢測(cè)試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種多種重要水源性人獸共患原蟲同時(shí)檢測(cè)試劑盒，用于藍(lán)氏賈第蟲、微小隱孢子蟲和剛地弓形蟲的快速熒光定量PCR檢測(cè)，本發(fā)明還提供了該試劑盒的制備方法，屬于寄生蟲檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
賈第蟲病(giardiasis)是由賈第蟲引起的一種以腹瀉為主要癥狀的腸道疾病， 為一種嚴(yán)重的人獸共患病，該病已被列為危害人類健康的10種主要寄生蟲病之一。隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)是由隱孢子蟲所引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患原蟲病，可造成哺乳動(dòng)物尤其是反芻動(dòng)物以及人的嚴(yán)重腹瀉。目前已經(jīng)命名隱孢子蟲有 27種，能感染人的隱孢子蟲有多種，其中以微小隱孢子蟲的感染最為常見和嚴(yán)重，微小隱孢子蟲宿主范圍廣泛且危害嚴(yán)重，多感染人、家畜等哺乳動(dòng)物，因此是隱孢子蟲屬中危害最大的隱孢子蟲種。病原學(xué)診斷多通過糞便顯微鏡檢及改良的抗酸染色法檢查，此法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且檢出率低下。免疫學(xué)診斷特異性和敏感性也較低。弓形蟲病(toxoplasmosis)又稱弓形體病，是由剛地弓形蟲(Toxophasma gondii ) 所引起的人畜共患病，可感染人及家畜，貓科等多種哺乳動(dòng)物。病原可通過胎盤感染胎兒， 直接影響胎兒發(fā)育，致畸嚴(yán)重，其危險(xiǎn)性較未感染者大10倍，是畜牧業(yè)的重大威脅，也是人類先天性感染中最嚴(yán)重的疾病之一，已引起廣泛重視，本病與艾滋病(AIDS)的關(guān)系亦很密切。上述三種病的病原體分別為藍(lán)氏賈第蟲、微小隱孢子蟲和剛地弓形蟲，均為細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，其卵囊或包囊均較小，鏡檢不易發(fā)現(xiàn)，且其病原體在污染的水中存活時(shí)間持久，難以被普通消毒劑殺滅，因此給疾病診斷、病原檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)帶來較大的困難，亟需開發(fā)一種多重快速檢測(cè)試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種多種重要水源性人獸共患原蟲同時(shí)檢測(cè)試劑盒，可用于藍(lán)氏賈第蟲、微小隱孢子蟲和剛地弓形蟲三種原蟲的同時(shí)快速檢測(cè)和診斷。本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述試劑盒的制備方法。本發(fā)明的多種重要水源性人獸共患原蟲同時(shí)檢測(cè)試劑盒，包括以下部分
(1)樣本裂解液與DNA提取試劑
樣本裂解液NaCl、Tris-HCl, EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，濃度配比為 NaCl IOOmM, Tris-HCKpH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K 0. 1 μ g/ μ 1 ； DNA提取試劑為酚氯仿異戊醇(24:25:1)；
(2)熒光定量PCR反應(yīng)液含反應(yīng)終濃度各100-300μ M的4種dNTPs，反應(yīng)終濃度各 IO-IOOpmol/μ 1的引物，反應(yīng)終濃度為IO-IOOpmol/μ 1的探針，1. 5-4. 5mM的Mg2+濃度； DNA聚合酶，滅菌蒸餾水；(3)多重引物及探針 藍(lán)氏賈第蟲
Ga 5' - GGCATCTTCATTCATAGACCTTCTG -3'
Gs 5' -ATATGCTGACATCTGGAGGAAAATC-3'
G-probe 5'-FAM-TCTTCCGTCTCGCCGTAACTGGTAA-BHQ1-3，
微小隱孢子蟲
Ca 5' -ATTGAAATAGATTCTGGTCCTTTGG-3'
Cs 5' -CATATTCCCTGTCCCTTGAGTTG-3'
C-probe 5'-J0E-CCGACCTCTCTCTCATTTGGTGACC-BHQ1-3，
剛地弓形蟲
Ta 5' -ATTTGCCAGCGGGAAATACAG-3' Ts 5'-CCACAAGACGGCTGAAGAATG-3' T-probe 5'-Cy5-TTCTTGTGCTGCCTCCTCTCATGG-BHQ2-3'；
(4)陽性對(duì)照藍(lán)氏賈第蟲、微小隱孢子蟲和剛地弓形蟲檢測(cè)片段標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，比較PCR 產(chǎn)物以及監(jiān)測(cè)PCR操作過程是否正確。(5)陰性對(duì)照取滅菌蒸餾水為陰性對(duì)照樣本，目的在排除反應(yīng)液中的核酸污染和操作過程中的假陽性問題。(6)多重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線通過陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增繪制。在本發(fā)明的試劑盒中還可以含有smart cycler system PCR反應(yīng)管。本發(fā)明所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟 (1)樣本裂解液與DNA提取試劑
樣本裂解液將NaCl、Tris-HCl, EDTA, SDS和蛋白酶K制成混合溶液；其中，濃度配比為NaCl IOOmM, Tris-HCl(pH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K 0. 1 μ g/ μ ；
DNA提取試劑為酚氯仿異戊醇(25:Μ: 1)。(2)多重?zé)晒舛縋CR引物與探針
藍(lán)氏賈第蟲特異引物( 與(is及探針G-probe，微小隱孢子蟲特異引物Ca與Cs及探針 C-probe,剛地弓形蟲特異引物Ta與1Ts及探針T-probe
(3)熒光定量PCR反應(yīng)液，含反應(yīng)終濃度各100-300μ M的4種dNTPs，反應(yīng)終濃度各 IO-IOOpmol/μ 1的引物，反應(yīng)終濃度為IO-IOOpmol/μ 1的探針，1. 5-4. 5mM的Mg2+濃度; DNA聚合酶，滅菌雙蒸水；
(4)陽性對(duì)照樣本標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為含有藍(lán)氏賈第蟲、微小隱孢子蟲和剛地弓形蟲種特異基因的pMD-18T重組質(zhì)粒；
(5)陰性對(duì)照取滅菌蒸餾水為陰性對(duì)照樣本，目的在排除反應(yīng)液中的核酸污染和操作過程中的假陽性問題。(6)多重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線通過陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增繪制。(7)本發(fā)明的試劑盒還可以含有smart cycler system PCR反應(yīng)管。本發(fā)明所述的試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟
1)樣本的預(yù)處理取樣本用PBS混勻過篩，先過60目，再過100目篩，濾液反復(fù)離心沉淀三次，沉淀即為備用樣本；
2)樣本DNA的提取
(1)將上述沉淀轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入Iml裂解液，在液氮和65°C水浴中反復(fù)凍融三次；
(2)將凍融后的樣品加入5-6μ 1 (20mg/ml)蛋白酶K，使其終濃度為100yg/ml。混勻后在65°C水浴中浸泡2h;
(3)用酚氯仿:異戊醇(25:24:1)進(jìn)行抽提兩次，700017/1^11離心十分鐘；
3)、熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)
(1)準(zhǔn)備待檢樣品數(shù)+2的PCR反應(yīng)管，管內(nèi)包括PCR反應(yīng)液等，蓋緊蓋子，在渦旋器上混勻備用；
(2)將陰性和陽性對(duì)照分別加入標(biāo)記好的管中，然后把樣品依次加入并標(biāo)記好，置于 Smart Cycler System PCR儀中。PCR條件為95°C預(yù)變性 5min、94°C變性 10s、60°C退火延伸30s，40-50個(gè)循環(huán)，讀取結(jié)果。本發(fā)明的積極效果在于利用多重?zé)晒舛縋CR特異性檢測(cè)方法，根據(jù)藍(lán)氏賈第蟲、微小隱孢子蟲和剛地弓形蟲種特異基因序列設(shè)計(jì)引物與探針，通過優(yōu)化熒光定量PCR 反應(yīng)體系和條件來提高其敏感性，擴(kuò)增同時(shí)可直接實(shí)時(shí)觀察擴(kuò)增結(jié)果。本發(fā)明可同時(shí)對(duì)三種重要水源性人獸共患原蟲進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，具有設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，簡(jiǎn)單易操作，靈敏度高， 特異性強(qiáng)，判定準(zhǔn)確客觀等特點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明多重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； 圖2為本發(fā)明多重?zé)晒舛縋CR特異性驗(yàn)證圖3為本發(fā)明多重?zé)晒舛縋CR核酸檢測(cè)靈敏度圖； 圖4為本發(fā)明多重?zé)晒舛縋CR對(duì)樣本檢測(cè)靈敏度圖。
具體實(shí)施例方式為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實(shí)施例。其作用被理解為是對(duì)本發(fā)明的闡釋而非對(duì)本發(fā)明的任何形式的限制。實(shí)施例1
1、多重快速熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的引物與探針設(shè)計(jì)
在GeneBank上比對(duì)選取藍(lán)氏賈第蟲、微小隱孢子蟲和剛地弓形蟲三種人獸共患原蟲特異診斷基因分別為beta-giardin基因、TRAP-C2基因和Bl基因。根據(jù)選取的特異基因生物軟件Beacon Designer-v7. 5設(shè)計(jì)多重?zé)晒舛縋CR引物和探針如下
藍(lán)氏賈第蟲
Ga:5’- GGCATCTTCATTCATAGACCTTCTG -3’
Gs 5' -ATATGCTGACATCTGGAGGAAAATC-3'
G-probe 5'-FAM-TCTTCCGTCTCGCCGTAACTGGTAA-BHQ1-3，
微小隱孢子蟲Ca 5' -ATTGAAATAGATTCTGGTCCTTTGG-3'
Cs 5' -CATATTCCCTGTCCCTTGAGTTG-3'
C-probe 5'-J0E-CCGACCTCTCTCTCATTTGGTGACC-BHQ1-3，
剛地弓形蟲
Ta 5' -ATTTGCCAGCGGGAAATACAG-3' Ts 5'-CCACAAGACGGCTGAAGAATG-3' T-probe 5'-Cy5-TTCTTGTGCTGCCTCCTCTCATGG-BHQ2-3'
以上三對(duì)引物在同一體系中(多重?zé)晒舛縋CR)能同時(shí)擴(kuò)增檢測(cè)出三種原蟲的特異基因片斷，能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)檢測(cè)微小隱孢子蟲、藍(lán)氏賈第蟲和剛地弓形蟲等三種重要水源性人獸共患原蟲的目的。2、樣本裂解液與DNA提取試劑的配制
按照下列濃度配比 NaCl IOOmM, Tris-HCl(pH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v) 和蛋白酶K O.lyg/μ 進(jìn)行混合，制備樣本裂解液；DNA提取試劑體積比為25:24: 1的酚氯仿異戊醇。3、熒光定量PCR反應(yīng)液的配制
含反應(yīng)終濃度各100-300 μ M的4種dNTPs，反應(yīng)終濃度各IO-IOOpmol/ μ 1的引物，反應(yīng)終濃度為IO-IOOpmol/ μ 1的探針，1. 5-4. 5mM的Mg2+濃度；DNA聚合酶，滅菌雙蒸水。4、陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備
在上述熒光定量多重引物的兩端分別設(shè)計(jì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒引物，通過PCR擴(kuò)增目的基因，與PMD-18T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，選取單克隆進(jìn)行測(cè)序、Blast比對(duì)鑒定，將100%同源質(zhì)粒確定為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。5、陰性對(duì)照
陰性對(duì)照為滅菌雙蒸水。6、反應(yīng)體系優(yōu)化
本發(fā)明試劑盒PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，將合成的引物與探針以滅菌蒸餾水稀釋為10 μ M 濃度，每個(gè)反應(yīng)體系按照表1所示濃度比，對(duì)同一濃度已知陽性樣本進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)CT值及擴(kuò)增曲線選擇最優(yōu)濃度比。表1熒光定量PCR檢測(cè)方法中引物與探針濃度配比
權(quán)利要求
1.一種多種重要水源性人獸共患原蟲同時(shí)檢測(cè)試劑盒，包括以下部分(1)樣本裂解液與DNA提取試劑樣本裂解液NaCl、Tris-HCl, EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，濃度配比為 NaCl IOOmM, Tris-HCKpH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K 0. 1 μ g/ μ 1 ； DNA提取試劑為酚氯仿異戊醇(24:25:1)；(2)熒光定量PCR反應(yīng)液含反應(yīng)終濃度各100-300μ M的4種dNTPs，反應(yīng)終濃度各 IO-IOOpmol/μ 1的引物，反應(yīng)終濃度為IO-IOOpmol/μ 1的探針，1. 5-4. 5mM的Mg2+濃度； DNA聚合酶，滅菌蒸餾水；(3)多重引物及探針 藍(lán)氏賈第蟲Ga:5’- GGCATCTTCATTCATAGACCTTCTG -3’Gs 5' -ATATGCTGACATCTGGAGGAAAATC-3'G-probe 5'-FAM-TCTTCCGTCTCGCCGTAACTGGTAA-BHQ1-3，微小隱孢子蟲Ca 5' -ATTGAAATAGATTCTGGTCCTTTGG-3'Cs 5' -CATATTCCCTGTCCCTTGAGTTG-3'C-probe 5'-J0E-CCGACCTCTCTCTCATTTGGTGACC-BHQ1-3，剛地弓形蟲Ta 5' -ATTTGCCAGCGGGAAATACAG-3' Ts 5'-CCACAAGACGGCTGAAGAATG-3' T-probe 5'-Cy5-TTCTTGTGCTGCCTCCTCTCATGG-BHQ2-3'；(4)陽性對(duì)照藍(lán)氏賈第蟲、微小隱孢子蟲和剛地弓形蟲檢測(cè)片段標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；(5)陰性對(duì)照取滅菌蒸餾水為陰性對(duì)照樣本；(6)多重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線通過陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增繪制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于還含有smartcycler system PCR反應(yīng)管。
3.權(quán)利要求1所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟(1)樣本裂解液與DNA提取試劑樣本裂解液將NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K制成混合溶液；其中，濃度配比為NaCl IOOmM, Tris-HCl(pH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K 0. 1 μ g/ μ 1 ；DNA提取試劑為酚氯仿異戊醇(24:25:1)；(2)多重?zé)晒舛縋CR引物與探針?biāo){氏賈第蟲特異引物( 與(is及探針G-probe，微小隱孢子蟲特異引物Ca與Cs及探針 C-probe,剛地弓形蟲特異引物Ta與1Ts及探針T-probe ；(3)熒光定量PCR反應(yīng)液為2X預(yù)混液，含反應(yīng)終濃度各100-300μ M的4種dNTPs，反應(yīng)終濃度各IO-IOOpmol/μ 1的引物，反應(yīng)終濃度為IO-IOOpmol/μ 1的探針，1. 5-4. 5mM的 Mg2+濃度；DNA聚合酶，滅菌雙蒸水；(4)陽性對(duì)照樣本標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為含有藍(lán)氏賈第蟲、微小隱孢子蟲和剛地弓形蟲種特異基因的pMD-18T重組質(zhì)粒；(5)陰性對(duì)照取滅菌蒸餾水為陰性對(duì)照樣本；(6)組裝試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開一種多種重要水源性人獸共患原蟲同時(shí)檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明還提供了該試劑盒的制備方法，利用多重?zé)晒舛縋CR特異性檢測(cè)方法，根據(jù)藍(lán)氏賈第蟲、微小隱孢子蟲和剛地弓形蟲種特異基因序列設(shè)計(jì)引物與探針，通過優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件來提高其敏感性，擴(kuò)增同時(shí)可直接實(shí)時(shí)觀察擴(kuò)增結(jié)果。本發(fā)明可同時(shí)對(duì)三種重要水源性人獸共患原蟲進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，具有設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，簡(jiǎn)單易操作，靈敏度高，特異性強(qiáng)，判定準(zhǔn)確客觀等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102154496SQ20111006643
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月19日
發(fā)明者任文陟, 宮鵬濤, 張國才, 張楠, 張西臣, 李巍, 李建華, 李 赫, 楊舉, 王景林, 蘇利波 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)