專利名稱：一種免攪拌生物反應器的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)細胞工程及發(fā)酵工程技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)如今，對哺乳動物細胞的體外培養(yǎng)已經(jīng)是很成熟的技術(shù)，但是大部分哺乳動物細胞必須依附于一定的表面才能生長，而當細胞的生長占據(jù)了全部表面后，細胞由于接觸抑制而不能繼續(xù)生長，因此對于貼壁生長的細胞很難進行大規(guī)模培養(yǎng)。為了讓這一類貼壁生長的細胞也可以像細菌一樣高密度生長，便產(chǎn)生了微載體細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)讓細胞貼附于微小顆粒(微載體)上，隨微載體一起懸浮，微載體可以提供相當大的表面積(微載體濃度越大，提供的表面積越大)供細胞貼附，從而使得細胞生長的密度成對數(shù)級增長。但是由于細胞的抗逆能力遠低于細菌，一般的發(fā)酵罐不能適用于細胞的培養(yǎng)。在細菌發(fā)酵罐的基礎上，用于微載體細胞培養(yǎng)的生物反應器需要至少解決三個問題第一、更溫和的懸浮方法。用于懸浮細菌的攪拌槳同樣也被用于攪拌微載體，但攪拌速度必須很低，過高的速度下，攪拌槳會劃傷微載體表面上的細胞，甚至將細胞從貼壁狀態(tài)撕扯下來。這就限制了微載體的使用濃度，因為低速攪拌不足以讓它們?nèi)繎腋。练e下來的細胞過于擁擠也不能生長。第二、溫和高效的氣體交換途徑。細菌發(fā)酵罐的氣體是直接通入罐內(nèi)液體底部的， 而對于細胞，氣泡浮出液面破裂時的表面張力對細胞是致命的。因此用于細胞培養(yǎng)的生物反應器是將氣體交換區(qū)與細胞生長區(qū)隔離開來，或采用液體表面通氣的方式。第三、培養(yǎng)基的更新方法。細菌發(fā)酵過程幾乎不需要補充養(yǎng)分，因為細菌是獨立的生物體，它本身具有分解養(yǎng)分制造自己所需營養(yǎng)物質(zhì)的能力，只要給它們足夠的食物，它們就不會缺少營養(yǎng)；而動物細胞不一樣，自然狀態(tài)下，細胞所需營養(yǎng)成分都來自動物的消化器官，體外培養(yǎng)狀態(tài)下，細胞的培養(yǎng)基成分是一定濃度的、細胞可以直接吸收的營養(yǎng)、維生素等，部分成分的消耗或代謝廢物的增加都會影響細胞的正常生長，因此在高密度培養(yǎng)時，隨時進行培養(yǎng)基更新是非常必要的。而要在保證微載體和細胞不流失的前提下連續(xù)抽出培養(yǎng)基是比較困難的！

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明靈感來源于混合液體的方法，讓微載體懸浮其實也就是讓微載體與液體混合均勻。攪拌的方法應用最廣，也最先被應用到生物反應器中；震搖的方法也很快被應用； 而實際上混合效果最好的方法是反復調(diào)換上下端，因為其中易沉淀的顆粒剛要沉淀到底部，底部又轉(zhuǎn)成了上部，在重力作用下，顆粒又會反向向新的底部沉淀。無論調(diào)換上下端的速度快慢，永遠不會有顆粒沉積，因為沒有一個固定的底部可以讓它們一直呆著。這種混合方法才是最溫和最高效的，因此更適合應用于細胞培養(yǎng)的生物反應器中。本發(fā)明通過讓生物反應器的整個罐體做180 360度往復轉(zhuǎn)動(不可連續(xù)轉(zhuǎn)動) 反復調(diào)換上下端，讓微載體在罐內(nèi)做往復運動，不需要攪拌輕松實現(xiàn)懸浮。這樣做要比僅僅讓一個攪拌槳連續(xù)轉(zhuǎn)動要困難得多，如果這樣做僅僅是為了實現(xiàn)溫和的懸浮就不一定劃算了，而事實上，這樣做也為解決其它問題提供了極大的方便第一、提高控制精度，減少控制盲區(qū)。上下端反復對調(diào)是最高效的混合方式，不僅對微載體懸浮有利，更對反應罐內(nèi)液體的均一性有利，如讓調(diào)節(jié)酸堿度的液體迅速混勻，能降低局部過酸或過堿對細胞的傷害，也能讓檢測探針檢測到的數(shù)據(jù)真實、及時地反饋調(diào)節(jié)效果，從而提高控制精度。相反，如果不能及時混合均勻，就會出現(xiàn)局部缺養(yǎng)、過酸、過堿的情況，這種情況持續(xù)存在，整罐的細胞都不法生存，因此混合方式也是制約細胞培養(yǎng)罐做大和微載體濃度加大的主要因素。只有混合均一，檢測數(shù)據(jù)才能反映罐內(nèi)真實的情況，只有根據(jù)真實情況進行調(diào)整，才能保證調(diào)整的方向正確。第二、完美的氣體交換方式。由于罐體是往復轉(zhuǎn)動的，罐內(nèi)的氣體也可以兩端反復游走，這樣就不需要連續(xù)通氣就可以實現(xiàn)普通罐連續(xù)通氣的效果，而且由于沒有液面，氣泡表面破裂的機會非常少，氣體除了慢慢溶于液體之外，別無它路。因此可以直接向罐內(nèi)通氣而不需要另外劃分氣體交換區(qū)。而氣體在罐中游走能起到攪拌的作用，同時提高了混合效果。而不連續(xù)通氣則可以大大降低高純氣體的浪費——連續(xù)通氣則會讓大部分氣體來不及溶解冒出液面散入空氣中。根據(jù)控制方式的需要或排除氣泡融合時的泡面破裂的影響也可以選用分離的氣體溶解腔。第三、無攪拌槳的障礙。攪拌槳的轉(zhuǎn)動常會帶來安全隱患，因為有了槳，反應器罐中布局需非常謹慎，罐體的運動使得槳被拋棄了，沒有安全隱患，我們可以更隨意地布置罐內(nèi)的設施，比如在罐內(nèi)設濾網(wǎng)。在罐內(nèi)設濾網(wǎng)可以解決兩個問題A.更新培養(yǎng)基。更新培養(yǎng)基的難點是先抽出罐內(nèi)部分舊培養(yǎng)基而不帶走長有細胞的微載體，通常我們都會在抽出培養(yǎng)基的過程中用濾網(wǎng)攔截微載體，而很快濾網(wǎng)就會被堆集的微載體堵住，再加上微載體上細胞的生長延伸到濾網(wǎng)上，堵塞會越來越嚴重使換液無法進行。本發(fā)明從五個方面解決濾網(wǎng)的堵塞問題1.增大濾網(wǎng)面積，降低單位面積的液流量壓力，在罐內(nèi)增大濾網(wǎng)面積不需占用空間；2.由于沒有了攪拌槳，可以將濾網(wǎng)放在罐底(頂)作為罐內(nèi)壁的一部分，這樣沉積在濾網(wǎng)上的微載體可以在高效的混勻方式下重新回到液體中；3.兩個濾網(wǎng)交替使用，這樣空閑濾網(wǎng)上的沉積物更容易被沖洗下來；4.兩個濾網(wǎng)使用的時機配合罐體的轉(zhuǎn)動由重力來控制，即總是從上方的濾網(wǎng)來抽出液體，與重力沉降的方向相反，可以抑制微載體向上沉積于濾網(wǎng)上(見圖2例)。5.配合往復循環(huán)經(jīng)第一個濾網(wǎng)抽出的液體除了被廢棄的一部分外，另一部分回到第二個濾網(wǎng)，反向沖洗堵在上面的微載體；下一次從第二個濾網(wǎng)抽出液體，并沖洗第一個濾網(wǎng)，如此交替進行，形成往復式循環(huán)。這樣可以及時對濾網(wǎng)進行反向沖洗，進一步降低堵塞的可能(見圖3例)。B.用濾網(wǎng)劃分控制區(qū)。調(diào)節(jié)PH用的酸堿液都是細胞不能接觸的極端溶液(極酸或極堿)，如果用濾網(wǎng)劃出一塊區(qū)域讓這些極端溶液在里面有一段緩沖后再與細胞接觸，將大大減小對細胞的傷害(圖2 :7)。第四、循環(huán)通道的形成便于引進在線的檢測設備及處理設備(圖3 22)。循環(huán)通道可以像人的血管一樣，連接各種新陳代謝及功能“器官”，可以根據(jù)需要添加更多的控制功能。這樣更具仿生學的意義。目前有一些檢測設備，還不能直接用于生物反應器的在線適時應用，而需要從反應器中采樣。而循環(huán)通道則可以直接連接這些檢測設備，用于適時監(jiān)控，如紫外監(jiān)測儀。用于細胞大規(guī)模培養(yǎng)過程的處理設備目前還沒有，但是可以預見，一些吸附類或交換類的去除代謝廢物的處理系統(tǒng)將可以被接入循環(huán)通道中。對細胞生長所需營養(yǎng)與環(huán)境的深入研究將使更新培養(yǎng)基沒有必要，而只需去除代謝廢物、添加消耗營養(yǎng)即可完成所需的生物反應周期。為了說明此循環(huán)通道的價值，本發(fā)明附圖4設計了一個簡單適用的反應器細胞代謝產(chǎn)物在線收集裝置，可以在反應器開始產(chǎn)出時替代換液管道，同時承擔收集產(chǎn)物和排出廢液的功能。 第五、無槳及循環(huán)控制有助于將反應器罐做得更小?；旌系男适狗磻鞴蘅梢宰龅酶?；可大可小反應器罐使細胞培養(yǎng)的每個階段都有相同的選擇，不必為細胞進入反應器罐前的大批量培養(yǎng)而擔心，小罐細胞直接傳大罐即可。
四

圖1為本發(fā)明罐體結(jié)構(gòu)的一種設計方案，為罐體的往復轉(zhuǎn)動及往復循環(huán)結(jié)構(gòu)基礎。標號注解如下1-循環(huán)管路接口4-濾網(wǎng)
2-罐蓋5-支撐筒
3_濾網(wǎng)支架6_氣液及電極入口開口處
7-主罐體中部
圖2是一種由本發(fā)明實施的反應器運行控制方案。標號注解如下
1-廢液出口10-死端/空氣入口
2-重力控制閥11-氧氣入口
3_進出液預留口12-二氧化碳氣入口
4-監(jiān)測電極探頭13-培養(yǎng)基入口
5-濾網(wǎng)14-堿液入口
6_濾網(wǎng)支架15-備用入口
控制腔16-液體選擇閥
8_氣體入口17-蠕動泵
9_氣體選擇閥18-液體入口
圖3在圖2基礎上加入往復循環(huán)結(jié)構(gòu)。1 18號同圖2，其它標號注解如下
19-重力控制閥21-蠕動泵
20-重力控制閥22-外置監(jiān)測與處理設備
圖4反應器細胞代謝產(chǎn)物收集裝置，標號注解如下
1-切向流濾6-蠕動泵
2-單向閥7_切向流濾器
3-透過液出口8-透過液出口
4-蠕動泵9-蠕動泵
5-產(chǎn)物收集瓶10-廢棄液收集瓶
五、具體實施方法1.本發(fā)明往復轉(zhuǎn)動罐體的設計方案(圖1)如圖示意了一種形狀、大小、比例、材質(zhì)不限的容器，此為縱切圖上、下端開口 (1)，通過相對比較結(jié)實的不銹鋼支撐筒(5)連接上下罐蓋(2)和主罐體中部(7)，不采用一體式設計是為了便于更換和清洗支撐筒(5)與罐蓋(2)之間的濾網(wǎng)(4)及濾網(wǎng)支架(3)。 支撐筒(5)四周可開孔(6)以插入檢測電極及作為氣體和液體的入口。同時，支撐筒(5) 支持整個罐體的重量，并與轉(zhuǎn)動設備連接，支撐罐體做180 360度往復轉(zhuǎn)動以調(diào)換罐體的上下端。在罐體轉(zhuǎn)過的過程中，所有水電氣接口都通過轉(zhuǎn)軸中心或靠近轉(zhuǎn)軸中心與靜止部分相連。主要有電極數(shù)據(jù)線泵的控制線及電源線、加熱及致冷電源線、補液及廢液管道、氧氣與二氧化碳氣管道等。因為這些管路與線路，所以罐體單方向轉(zhuǎn)動不能超過360度。此外離心力沉淀也是罐體不可連續(xù)轉(zhuǎn)動的原因。2.本發(fā)明反應器運行控制方法(圖2)如圖所示，運行狀態(tài)下，罐體及所有連接管道均充滿液體(氣體管道除外)，氣體選擇閥(9)選擇空氣入口(10)，而空氣入口(10)夾死形成死端；液體入口(18)又被蠕動泵(17)壓實；罐體密封，只有廢液出口(1)為開口，這時液體不會流出。下面分述反應器細胞培養(yǎng)過程中的常用控制在本發(fā)明中的操作2. 1更新罐內(nèi)培養(yǎng)基液體選擇閥(16)選擇培養(yǎng)基入口(13)，開啟蠕動泵(17)， 培養(yǎng)基泵入罐中，罐中液體則經(jīng)濾網(wǎng)(5)流到重力控制閥(2)經(jīng)廢液出口⑴排出。如罐體轉(zhuǎn)動使罐的上下端對調(diào)，重力控制閥(2)會自動堵住下方的通道，同時開放上端通道，保證了液體總是從上方流出。2. 2罐中液體pH偏低同2. 1，液體選擇閥(16)選擇堿液入口，泵入堿液以提高 pH。2. 3罐中液體pH偏高氣體選擇閥(9)選擇二氧化碳氣入口(12)，形成開口，廢液出口(1)出液，吸入氣體。氣體入口不宜長時間開啟，應及時返回死端(10)——夾死的空氣入口，否則液體就可能全部排空！所以，當我們想排空反應器罐時，就需要打開空氣入口。2. 4罐中液體溶氧偏低同2. 3，氣體選擇閥(9)選擇氧氣入口(11)，通入氧氣。2. 5微載體細胞小罐傳大罐罐體停轉(zhuǎn)后，使用預留進出液口(3)將大小兩個罐用管道連接向小罐泵入培養(yǎng)基或通入壓力空氣，從而將小罐內(nèi)的微載體和細胞導流到大罐。2. 6采樣采樣用進出液預留口(3)，進出液預留口(3)平時密封，采樣時開啟并將廢液出口(1)關閉，泵入培養(yǎng)液則自動流出罐內(nèi)細胞液。3.往復循環(huán)結(jié)構(gòu)的液體流向控制(圖3)圖3比圖2僅多了往復循環(huán)結(jié)構(gòu)，蠕動泵(21)作為液體循環(huán)的動力，只需要定速工作即可，液流方向由兩個重力控制閥(19，20)來控制，如圖示，從而保證在罐體轉(zhuǎn)過過程中液體始終從罐上方流出，罐下方流入。循環(huán)通道的形成便于將罐中的液體輸送給相關檢測及處理設備(22)，并將處理后的液體輸回罐中。4.生物反應產(chǎn)物即時收集器(圖4)本收集器具有較大的實用性，它不僅可以即時地將代謝產(chǎn)物從罐中分離出來，而且在生物反應周期結(jié)束的同時，基本可以完成濃縮工序，節(jié)省了工藝時間。設計原理就是將罐內(nèi)液體經(jīng)切向流過濾后收集于瓶中，瓶中的收集液再經(jīng)小孔徑的切向流過濾進行濃縮， 濃縮時排出的透過液可以輸回罐中再利用。而目前采用收集產(chǎn)物方法是收集十幾萬到幾十萬的培養(yǎng)液后再一起濃縮，濃縮產(chǎn)生的十幾萬到幾十萬的培養(yǎng)液全部廢棄，這是巨大的浪費。本設計通過用兩個等速的蠕動泵(4，9)放在兩個濾器的透過液端(3，8)來控制收集產(chǎn)物速度和產(chǎn)物被濃縮的速度相等，這樣產(chǎn)物不斷地被收集，而收集液的體積卻不會變化，只是產(chǎn)物越來越濃。產(chǎn)物收集瓶(5)可以放進冰箱內(nèi)，以保持收集產(chǎn)物的生物學活性。濃縮機透過液出口(8)分出一支管路連接廢液瓶(10)，當罐中營養(yǎng)不足補充新培養(yǎng)基時，廢液會自動流出。單向閥(2)則可以防止含有產(chǎn)物的液體倒流入廢液瓶(10)。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明是通過反復調(diào)換容器上下端的混合方式來達到讓微載體細胞懸浮的目的，從而將這一懸浮方法應用到所有生物反應器的設計中。與已有專利和應用相比，本發(fā)明具有以下特點A.大幅度的罐體運動——上下端對調(diào)的懸浮(混勻)方式，有別于現(xiàn)有的罐體不動的內(nèi)部攪拌和罐體小幅度搖晃的懸浮方式；B.罐內(nèi)完全被液體充滿而消除了固定的液面，如果存在氣體也只是混雜于液體中；C.只進不出的給氣方式，只有氣體溶入培養(yǎng)液中后才會繼續(xù)消耗氣體；D.大面積濾網(wǎng)內(nèi)置于反應器罐中，用以在抽出罐內(nèi)液體時攔截微載體細胞；E.隔離的控制區(qū)，減小極端液體對細胞的傷害；F.通過濾網(wǎng)的高效濾過能力而實現(xiàn)的循環(huán)系統(tǒng)可以實現(xiàn)即時的罐外檢測與控制；G.一種應用于反應器循環(huán)管路的在線裝置在將產(chǎn)物收集的同時將培養(yǎng)液返還于反應器罐內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述，生物反應器大小及形狀不受限制，而上下端對調(diào)的途徑和幅度有很多種，途徑應不限于轉(zhuǎn)動或滾動，而應以罐體(容器)運動的幅度為準。單向運動幅度包括但不限于大于180度的角度變化，而應包括不小于45度的所有角度(與垂直線的夾角，并以起始點為0度點)變化(雙向運動的總幅度不小于90度)。
3.如權(quán)利要求1所述，液體充滿反應器罐是指罐內(nèi)沒有預留空間，存在的氣體也只是混雜于液體中，有別于搖動或震蕩的混合懸浮方式需要在液體上方留有一定空間。
4.如權(quán)利要求1所述，只進不出的給氣方式是針對現(xiàn)有的連續(xù)通氣方式而提出的，連續(xù)通氣讓大部分氣體來不及溶解就通過冒泡的方式散失掉；而本發(fā)明使用的給氣方法是只向罐內(nèi)通氣，不允許氣體從罐中出來，氣體除了溶于液體中為生物反應所用以外別無它路。
5.如權(quán)利要求1所述，大面積濾網(wǎng)內(nèi)置于反應器罐中是指將濾網(wǎng)部分或全部作為反應器罐的內(nèi)壁，讓反應器罐同時具備固液分離的功能，而不需要專門的固液分離裝置。
6.如權(quán)利要求1所述的循環(huán)系統(tǒng)是一種實現(xiàn)了固液分離的液體循環(huán)，是指液體流出反應器罐在管道中轉(zhuǎn)一圈又回到罐中，因為循環(huán)液基本保持了與罐內(nèi)液體的一致性，因此可用于即時檢測或處理；為保證濾網(wǎng)通暢，這種循環(huán)可以往復交替進行。
7.如權(quán)利要求1所述的在線收集裝置是用兩個切向流過濾器合作完成通過第一個濾器過濾得到較為澄清的含產(chǎn)物的培養(yǎng)液，第二個濾器分離產(chǎn)物與培養(yǎng)液，這樣產(chǎn)物將被濃縮，而培養(yǎng)液可以導入反應器罐中再次利用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)細胞工程及發(fā)酵工程技術(shù)領域。本發(fā)明提出了一個能適用于微載體細胞培養(yǎng)的生物反應器設計方案，完美解決微載體懸浮、氣體交換及換液收獲等技術(shù)難題，并使該反應器具有更好的擴展性。本發(fā)明是通過讓罐體上下端反復調(diào)換的方式讓微載體懸浮，這種方式不僅是最溫和的懸浮方式，還讓氣體在罐中游走而實現(xiàn)高效的氣體交換；由于沒有了攪拌槳，可以更方便在罐內(nèi)安裝換液時攔截微載體的濾網(wǎng)，在罐內(nèi)安濾網(wǎng)的好處是在防止微載體沉降的方法也可以防止了微載體堵塞濾網(wǎng)；濾網(wǎng)過濾條件的改善將有助于建立一條罐外檢測與控制連接的循環(huán)通道，隨時了解罐內(nèi)的更多參數(shù)，隨時擴展調(diào)節(jié)罐內(nèi)環(huán)境的裝置或設備。
文檔編號C12M3/02GK102199538SQ20111006665
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月14日
發(fā)明者胡威 申請人:胡威