專利名稱：用畢赤酵母分泌表達(dá)重組人去乙酰化酶6的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種重組人去こ酰化酶6 (RecombinantHumanSertuin-6, rhSIRT6)工程菌株的構(gòu)建,發(fā)酵,蛋白產(chǎn)物的純化等制備方法。
背景技術(shù)：
組蛋白的可逆共價修飾調(diào)節(jié)是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式之一，在這些共價修飾中こ?；?去こ酰化修飾作用尤為突出。參與組蛋白去こ酰化的酶有三類，其中的ー類酶比較特殊，它們的催化活性依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(即輔酶I，nicotinamideadeninedinucleotide, NAD+)。這一類酶對應(yīng)的基因在進(jìn)化中保守性很強，除了一些原核生物外，它們廣泛存在于目前研究的所有物種，它們就是Sirtuin蛋白家族(Frye,R. A. (2000) Biochem Biophys Res Commun 273,793-798)。人類的 Sirtuin 有七個成員(SIRT1-7)，它們普遍表達(dá)于各種組織、細(xì)胞，然而在不同物種的組織、細(xì)胞中，各成員的定位、作用底物及發(fā)揮的生物活性不盡相同。它們分別參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞壽命調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)、新陳代謝、脂肪和糖代謝平衡、抵御應(yīng)激、胰島素分泌等生命過程(Zhong，L. , etal. (2010) Cell 140,280-293)、(Tennen, R. I. , et al. (2010)Mech Ageing Dev 131，185-192)，并且很多調(diào)控機制目前還尚未清楚，有待進(jìn)ー步的研究。Sirtuin蛋白家族最早被人們發(fā)現(xiàn)是源自對酵母的沉默信息調(diào)節(jié)因子2 (silentinformation regulator, Sir2)的研究。Sir2是酵母調(diào)控衰老和壽命的重要因子，它還參與熱量限制引起的抗衰老和延壽效應(yīng)。1999年，F(xiàn)rye等根據(jù)與Sir2的蛋白同源性找到人Sirtuin蛋白家族的7個成員。Mostoslavsky等在對小鼠進(jìn)行基因剔除實驗中發(fā)現(xiàn)，SIRT1-7基因在分別剔除后，只有缺失SIRT6的小鼠出現(xiàn)了明顯的衰老癥狀(Mostoslavsky, R.，(2006) Cell 124，315—329)。進(jìn)ー步研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6 是通過促進(jìn)堿基切除修復(fù)(base excision repair, BER)過程的修復(fù)來減少堿基的突變而保證DNA的完整性，SIRT6的功能缺陷使基因組中的DNA損傷修復(fù)減少和缺陷增多從而抑制了細(xì)胞的分裂，促進(jìn)了細(xì)胞的死亡，最終使個體出現(xiàn)衰老癥狀。雖然SIRT6作用的分子機制和其它功能還在研究之中，但僅從作為ー個有抵抗衰老作用的蛋白來看，SIRT6就已經(jīng)具有廣闊的應(yīng)用前景。由于對人SIRT6的研究和應(yīng)用不可避免地會增加該蛋白的需求量，而由于來源的限制，天然提取的蛋白很難滿足這ー需求。所幸日趨成熟基因工程技術(shù)能很好的解決這個問題，所以開發(fā)出人SIRT6的重組蛋白必將推動對它的深入研究和應(yīng)用。國外有報道的文獻(xiàn)中，多數(shù)是用來表達(dá)重組人去こ?；?蛋白的宿主菌都是大腸桿菌，而沒有報道提及所表達(dá)的蛋白能夠達(dá)到エ業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的需要。本發(fā)明選用畢赤酵母作為宿主菌，是因為真核宿主菌對人源的目的蛋白有一定的翻譯后修飾的過程，而且宿主菌可以進(jìn)行高密度培養(yǎng)、目的蛋白能夠分泌到胞外表達(dá)，這些優(yōu)點都有利于對目的蛋白進(jìn)行エ業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備重組人去こ?；? (Recombinant HumanSertuin-6, rhSIRT6)的方法，其中包括，I)制備能表達(dá)、具有生物活性的rhSIRT6cDNA基因；2)突變該基因的部分密碼子，得到新的mSIRT6基因；
3)將mSIRT6基因與表達(dá)載體重組；4)用所述載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；5)誘導(dǎo)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；6)純化 rhSIRT6 蛋白。本發(fā)明用基因工程方法對rhSIRT6進(jìn)行生產(chǎn)，所得產(chǎn)品與已知的方法相比，不僅活性更高，表達(dá)量更高，而且成本更低，制備エ藝簡便、安全。本發(fā)明從人肝臟CDNA文庫中用PCR的方法克隆rhSIRT6cDNA基因。所述rhSIRT6cDNA基因序列如序列表SEQ-I所示。在不改變氨基酸的情況下，對該基因的部分密碼子進(jìn)行同義突變，突變?yōu)楫叧嘟湍钙妹艽a子，得到突變后的基因片段mSIRT6，所述mSIRT6基因序列如序列表SEQ-3所示。將獲得的mSIRT6基因與質(zhì)粒pPICZ α重組，DNA限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽性克隆，核苷酸序列分析驗證mSIRT6基因。本發(fā)明不限于特定的表達(dá)質(zhì)粒。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用真核表達(dá)載體，例如pPICZ α等。上述重組表達(dá)載體按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述基因。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母菌株如Χ33等。本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外，存在于宿主細(xì)胞培養(yǎng)液上清內(nèi)。離心去除宿主細(xì)胞，可從培養(yǎng)液上清分離和純化所需產(chǎn)品。所述表達(dá)產(chǎn)物重組人去こ?；? (RecombinantHumanSertuin-6, rhSIRT6)蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列表SEQ-2所示。本發(fā)明上述技術(shù)方法中分子生物學(xué)操作均參照《分子克隆實驗指南》(第三版，科學(xué)出版社，2002)。


圖I :表達(dá)質(zhì)粒ppICZa_mSIRT6基因構(gòu)建過程示意圖。圖2 上游擴增及修改人SIRT6基因M DNA markerI :從人肝cDNA中PCR調(diào)出hSIRT6基因2 PCR修改hSIRT6基因成為mSIRT6基因圖3 Xhol+Notl雙酶切篩選構(gòu)建的質(zhì)粒載體M DNA markerV1-V5 :挑選的質(zhì)粒載體，用Xhol+Notl雙酶切后的電泳情況從電泳情況上看，V1-V5樣品抽出的質(zhì)粒都能被雙酶切下約I. 5Kb左右的條帶，因此，V1-V5樣品都是陽性克隆。圖4:構(gòu)建好的質(zhì)粒pPICZ a-mSIRT6轉(zhuǎn)化X33宿主菌后，挑選7個單克隆，甲醇誘導(dǎo)45小時后，各取上清液，與誘導(dǎo)前樣品上清液作對照，走還原電泳。M :蛋白 markerO :誘導(dǎo)前樣品上清液；1-7 :挑出的7個樣品用甲醇誘導(dǎo)45小時后上清液。劃線處是誘導(dǎo)表達(dá)出來的目的蛋白，大小介于30_45KDa之間,可見1_7號樣品在甲醇誘導(dǎo)45小時后，均有目的蛋白表達(dá)。
具體實施例方式實施例I :設(shè)計、構(gòu)建重組質(zhì)粒，表達(dá)融合蛋白(I)克隆 hSIRIOcDNA 基因參照hSIRT6基因序列，設(shè)計引物，用PCR方法，從商業(yè)化人肝臟cDNA文庫中擴增全長hSIRT6基因。擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a宿主菌。用核苷酸序列分析，證實基因重組的位置以及序列正確，獲得帶有hSIRT6全長基因的陽性克隆。本發(fā)明所采用的限制性內(nèi)切酶來自Takara公司，商業(yè)化人肝臟cDNA文庫來自Biochain公司，甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母菌株X33、畢赤酵母多拷貝表達(dá)載體pPICZ α來自
丄nvitrogen 公 ロJ。(2)突變 hSIRT6 基因用常規(guī)PCR方法，通過合成上下游引物，對hSIRT6基因進(jìn)行同義突變。反映在氨基酸水平上就是對蛋白N末端起始的一段氨基酸(SVNYAAGLSP-)對應(yīng)的核酸序列進(jìn)行同義突變，突變后的基因序列是SEQ-3，設(shè)定名稱是mSIRT6。將PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體重組，構(gòu)建新的表達(dá)質(zhì)粒pGEM-T_mSIRT6，轉(zhuǎn)化NovaBlue宿主菌。抽提質(zhì)粒，再通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶位點酶切分析，以特征片段篩選質(zhì)粒，然后用核苷酸序列分析，證實基因重組的位置以及序列正確，獲得帶有mSIRT6基因的陽性克隆。本發(fā)明所采用的pGEM-T載體來自Promega公司。(3)構(gòu)建質(zhì)粒，篩選及表達(dá)mSIRT6蛋白；將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pGEM-T_mSIRT6用Xhol+Notl雙酶切，酶切產(chǎn)物與畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α重組，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a-mSIRT6，并轉(zhuǎn)化NovaBlue宿主菌。抽提質(zhì)粒，再通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶位點酶切分析，以特征片段篩選質(zhì)粒，然后用核苷酸序列分析，證實基因重組的位置以及序列正確，獲得帶有mSIRT6基因的陽性克隆。大量抽提構(gòu)建好的質(zhì)粒pPICZ a _mSIRT6，用限制性內(nèi)切酶SacI線性化以后，電穿孔法轉(zhuǎn)入畢赤酵母野生型宿主菌X33中。經(jīng)過Zeocin抗性平板篩選，獲得陽性克隆。將陽性克隆接種至BMGY培養(yǎng)基，其中含I %酵母提取物，2 %蛋白胨，IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH 6. O)，I. 34% YNB, (4X 10_5) %生物素和I %甘油，30°C培養(yǎng)至菌體光密度OD6tltol達(dá)到2 6吋，離心去除培養(yǎng)液，將菌體沉淀用甲醇復(fù)合型培養(yǎng)基BMMY稀釋至OD6tltlnm到1，培養(yǎng)基BMMY含有I %酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸緩沖液(pH 6. 0),1.34% YNB,(4X IO^5) %生物素，O. 5%甲醇。30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)45小吋，每12小時取樣并補加甲醇維持其濃度O. 5%，保留培養(yǎng)液上清，用上清做8% SDS-PAGE非還原電泳，考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，掃描定純度，分子量。結(jié)果顯示，甲醇誘導(dǎo)后，上清液在相應(yīng)的分子量位置有濃集的條帯。經(jīng)掃描大致確定目的蛋白占上清液菌體表達(dá)總蛋白的20%以上。實施例2 :工程菌株的發(fā)酵表達(dá)取上述高表達(dá)的工程菌株種子，接種至BMGY培養(yǎng)基中，30°C搖菌培養(yǎng)，至菌液( 6_ 達(dá)到2 4時，按I : 20的接種比例接種到30L發(fā)酵罐，用全鹽培養(yǎng)基進(jìn)行高密度發(fā)酵。所述全鹽培養(yǎng)基需用氨水調(diào)初始PH值到6. O。待培養(yǎng)基中甘油耗盡后，繼續(xù)流加甘油，并維持溶氧不低于20%。待菌密度達(dá)到要求后，維持培養(yǎng)基pH為6. 0，暫停碳源補給約30分鐘后，流加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，甲醇補料速度從lmL/L/h逐漸升高至12mL/L/h，維持此速度。本發(fā)明發(fā)酵參數(shù)為 .溫度30°C，氧容量控制在不低于20%，pH = 6. 0，攪拌速度與氧容量連動。 經(jīng)過高密度培養(yǎng)和誘導(dǎo)，結(jié)果表明hSIRT6蛋白獲得了高表達(dá)。甲醇誘導(dǎo)45h后，停止發(fā)酵，離心分離發(fā)酵液，收集上清進(jìn)行純化。經(jīng)測試，發(fā)酵工程菌的表達(dá)水平不低于30%。實施例3 :目的蛋白的分離純化(I)陰離子柱層析(DEAE Sepharose Fast Flow)用50mMTris-HCl(pH 7. O)平衡柱子，把含有目的蛋白的樣液稀釋到電導(dǎo)與平衡緩沖液一致，并調(diào)節(jié)PH至7. 0，開始上樣，上樣結(jié)束后用平衡緩沖液沖洗6個柱體積，再用50mMTris-HCl (pH 7. O) +0. 3MNaCl 洗脫，收集 2 個柱體積。(2)超濾濃縮脫鹽Phenyl 洗脫液用 Millipore NMWL 10000 的膜超濾除鹽。(3)疏水柱層析(Phenyl Sepharose Fast Flow)用50mMTris-HCl (pH 7. 0) +1. 2M NaCl 平衡柱子，把 DEAE 洗脫液的電導(dǎo)和 pH調(diào)節(jié)到與平衡緩沖液一致，開始上樣，上樣結(jié)束后用平衡緩沖液沖洗6個柱體積，再用50mMTris-HCl (pH 7. O) +0. 5MNaCl 洗脫，收集 5 個柱體積。(4)超濾濃縮脫鹽Phenyl 洗脫液用 Millipore NMWL 10000 的膜超濾除鹽。(5)蛋白純度鑒定及分子量測定取純化樣品進(jìn)行15% SDS-PAGE非還原和還原電泳，考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，凝膠成像儀掃描測定純度，所得產(chǎn)品純度90%以上，分子量約為40KDa。
權(quán)利要求
1.一種制備抗衰老因子，即重組人去こ?；?(Recombinant Human Sertuin-6,rhSIRT6)的方法，其特征在于采取下列步驟 (1)分離組織總RNA，用RT-PCR的方法克隆hSIRT6cDNA基因，得到的基因序列是SEQ-I ； (2)同義突變hSIRT6cDNA基因，得到mSIRT6基因； (3)mSIRT6基因與表達(dá)載體重組； (4)用上述重組表達(dá)載體電穿孔法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使mSIRT6基因以多拷貝形式與宿主染色體發(fā)生重組； (5)誘導(dǎo)培養(yǎng)宿主細(xì)胞； (6)從培養(yǎng)液中回收和純化蛋白產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備重組人去こ?；?(rhSIRT6)方法，其中所分離總RNA不限于來源于人體特定的細(xì)胞、細(xì)胞株或組織，只要它含hSIRT6 mRNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組人去こ?；?(rhSIRT6)，整個蛋白分子是一條含有354個氨基酸的多肽鏈，其N-端前8個氨基酸殘基是SVNYAAGL-，C-端末尾8個氨基酸殘基是-VKAKAVPS，rhSIRT6的基因序列和氨基酸序列分別是SEQ-I和SEQ-2。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述的同義突變不局限于hSIRT6基因上任何特定位置的同義突變，只要它能夠促進(jìn)hSIRT6基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I和4所述的方法，其中所述的同義突變在于對hSIRT6蛋白的N末端起始的10個氨基酸(即SVNYAAGLSP-)的密碼子進(jìn)行修改，突變后的基因序列是SEQ-3。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體的目的蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求I和4所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞為甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母菌株X33。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中培養(yǎng)宿主細(xì)胞采用發(fā)酵方法。
9.根據(jù)權(quán)利要求I和6所述的方法，其中培養(yǎng)宿主細(xì)胞采用的發(fā)酵方法為用全鹽培養(yǎng)基擴增工程菌，誘導(dǎo)前用甘油溶液補料，達(dá)菌體濃度后用甲醇溶液誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)酵參數(shù)為 溫度30°C，氧容量控制在35±5%，pH = 6. 5，攪拌速度與氧容量連動。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中rhSIRT6蛋白終產(chǎn)物通過工程菌發(fā)酵后離心搜集上清，經(jīng)陰離子層析、超濾脫鹽、疏水層析、超濾脫鹽等方法純化所得。
全文摘要
用畢赤酵母分泌表達(dá)重組人去乙?；?。本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組人去乙酰化酶6(Recombinant HumanSertuin-6，rhSIRT6)及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明應(yīng)用RT-PCR方法，擴增得到人去乙酰化酶6(hSIRT6)cDNA，并將其中的幾處密碼子經(jīng)過同義突變，突變成畢赤酵母偏好密碼子，將突變的基因mSIRT6與畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)載體pPICZ α重組，獲得表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α-mSIRT6，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌X33，篩選出高效表達(dá)工程菌株。實現(xiàn)在畢赤酵母中以分泌形式大量表達(dá)重組人去乙?；?。工程菌經(jīng)發(fā)酵、誘導(dǎo)表達(dá)，分離純化后，能夠得到純度90％以上可溶的重組人去乙?；?。
文檔編號C12N15/10GK102676465SQ201110066688
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者張潔 申請人:張潔