專利名稱：一種調(diào)控動(dòng)物內(nèi)源基因表達(dá)的遺傳修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體的，涉及一種可誘導(dǎo)的調(diào)控內(nèi)源基因表達(dá)的模型，及建立該模型的方法，以及該模型的用途。
背景技術(shù)：
后基因組時(shí)代面臨的一個(gè)主要挑戰(zhàn)就是闡明新發(fā)現(xiàn)的成千上萬基因的功能。對(duì)這些基因功能研究的闡明直接關(guān)系到對(duì)發(fā)育和疾病等相關(guān)過程的研究和理解。當(dāng)前對(duì)基因功能研究的一個(gè)有效途徑是在細(xì)胞水平上，通過上調(diào)(過表達(dá))或者下調(diào)(RNAi或者突變失活)該基因的表達(dá)，來研究其對(duì)細(xì)胞功能的影響；在整體動(dòng)物水平上，往往通過建立轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物上調(diào)該基因的表達(dá)，或者通過建立突變和基因剔除動(dòng)物品系失活該基因的功能，來研究其在整體水平上的生理功能病理作用。而在建立轉(zhuǎn)基因和基因剔除動(dòng)物的過程中，目的基因的功能性失活往往是整個(gè)生命周期性的。這種生命周期性的失活經(jīng)常帶來以下 問題1)基因失活導(dǎo)致胚胎致死或者產(chǎn)后致死，導(dǎo)致無法對(duì)其在生長(zhǎng)發(fā)育后期的功能進(jìn)行評(píng)估；2)無法判斷目的基因失活的表型是在觀察時(shí)基因失活的一個(gè)結(jié)果還是因?yàn)樵摶蛟诔砷L(zhǎng)發(fā)育早期失活造成的一個(gè)后果；3)該基因長(zhǎng)期失活造成的功能缺失為其他基因功能所代償，掩蓋了該基因功能的表現(xiàn)。為了解決這些問題，人們開發(fā)了一系列條件性敲除和表達(dá)系統(tǒng)，如=Cre-LoxP介導(dǎo)的組織特異性敲除、四環(huán)素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)和可誘導(dǎo)的RNAi系統(tǒng)。Cre-LoxP系統(tǒng)雖然解決了基因敲除的組織特異性問題但其引發(fā)的功能缺失是不可逆的；四環(huán)素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)無法下調(diào)目的基因的內(nèi)源性表達(dá)，僅適用于過表達(dá)；近年來發(fā)展的可誘導(dǎo)RNAi系統(tǒng)雖然具有時(shí)空可調(diào)控性但RNAi本身的專一性及細(xì)胞毒性問題給研究帶來一定的不確定性，同時(shí)其在高等動(dòng)物如小鼠等整體水平上的應(yīng)用常常在效率上大大低于細(xì)胞的水平，目前原因尚不清楚。由此可見，這些系統(tǒng)均不能完全解決所出現(xiàn)的問題。因此，對(duì)于基因功能的研究迫切需要開發(fā)一種新的具有時(shí)空特異性，可以可逆的上調(diào)或者下調(diào)內(nèi)源基因表達(dá)的系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)控動(dòng)物內(nèi)源基因表達(dá)的遺傳修飾方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種模式動(dòng)物，所述模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因是可誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)的。在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備模式動(dòng)物的方法，所述模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因是可誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)的，所述方法包括(I)建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物I (內(nèi)源基因響應(yīng)動(dòng)物)該動(dòng)物I基因組中，目的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近插入了四環(huán)素響應(yīng)元件(TRE)；(2)建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物2 (調(diào)控動(dòng)物)該動(dòng)物2基因組中，包括轉(zhuǎn)錄抑制因子或轉(zhuǎn)錄激活因子的編碼基因，所述的轉(zhuǎn)錄抑制因子或轉(zhuǎn)錄激活因子可與四環(huán)素響應(yīng)元件結(jié)合，且所述結(jié)合受四環(huán)素或其類似物(如強(qiáng)力霉素)調(diào)控；(3)將 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物I和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物2進(jìn)行交配，選出基因組中既包括四環(huán)素響應(yīng)元件、又包括轉(zhuǎn)錄抑制因子或轉(zhuǎn)錄激活因子的編碼基因的動(dòng)物，作為模式動(dòng)物。在另一優(yōu)選例中，所述的四環(huán)素響應(yīng)元件具有SEQ ID NO 1所示的核酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的四環(huán)素響應(yīng)元件插入在所述的目的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游或下游4000bp范圍內(nèi)(較佳地為3000bp范圍內(nèi))。在另一優(yōu)選例中，通過同源重組或隨機(jī)插入的方式將四環(huán)素響應(yīng)元件插入基因組中。在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)錄抑制因子選自tTR-KRAB或RtTR-KRAB ;或所述的轉(zhuǎn)錄激活因子選自tTA或rtTA。在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)錄抑制因子tTR-KRAB具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)錄抑制因子RtTR-KRAB在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)錄激活因子tTA具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)錄激活因子rtTA具有SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，步驟(I)、⑵或⑶中，還分別包括，對(duì)獲得的動(dòng)物進(jìn)行交配建系，獲得子代動(dòng)物。在另一優(yōu)選例中，所述的動(dòng)物是轉(zhuǎn)錄抑制因子或轉(zhuǎn)錄激活因子的編碼基因、四環(huán)素響應(yīng)元件純合的動(dòng)物。在另一優(yōu)選例中，所述的動(dòng)物是有性繁殖的動(dòng)物；如選自蟲、果蠅線、魚、大鼠、小鼠、猴。在另一優(yōu)選例中，所述的四環(huán)素的類似物是強(qiáng)力霉素。在本發(fā)明的另一方面，提供一種誘導(dǎo)調(diào)控模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因表達(dá)的方法，所述方法包括(a)提供模式動(dòng)物，所述模式動(dòng)物通過所述的方法獲得；(b)給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，從而調(diào)控模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因的表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，(a)所述的模式動(dòng)物中，包括轉(zhuǎn)錄抑制因子RtTR-KRAB的編碼基因；(b)中，給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因的表達(dá)受到抑制；不(或撤銷)給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，目的內(nèi)源基因正常表達(dá)；或者(a)所述的模式動(dòng)物中，包括轉(zhuǎn)錄抑制因子tTR-KRAB的編碼基因；(b)中，不(或撤銷)給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因的表達(dá)受到抑制；給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，目的內(nèi)源基因的表達(dá)抑制被解除；或者(a)所述的模式動(dòng)物中，包括轉(zhuǎn)錄激活因子tTA的編碼基因；(b)中，給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因的正常表達(dá)；不(或撤銷)給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，目的內(nèi)源基因超表達(dá)；或者(a)所述的模式動(dòng)物中，包括轉(zhuǎn)錄激活因子rtTA的編碼基因；(b)中，給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，激活模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因的超表達(dá)；不(或撤銷)給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，目的內(nèi)源基因正常表達(dá)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種模式動(dòng)物在基因功能研究中的用途，所述的模式動(dòng)物通過所述的方法獲得。在本發(fā)明的另一方面，提供一種細(xì)胞(非生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞)，其來源于一種模式動(dòng)物，所述的模式動(dòng)物通過所述的方法獲得。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的體細(xì)胞在基因功能研究中的用途。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I顯示了四環(huán)素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)示意圖。 圖2顯示了本發(fā)明受CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的廣泛表達(dá)的tTR-KRAB和RtTR-KRAB質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖3顯示了本發(fā)明CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的tTR-KRAB和RtTR-KRAB轉(zhuǎn)基因小鼠基因型
二次鑒定結(jié)果圖。其中，上圖泳道1-22為tTR-KRAB轉(zhuǎn)基因founder鼠PCR產(chǎn)物，泳道23為野生型小鼠PCR產(chǎn)物，泳道24為PCR模板為純水對(duì)照物的PCR產(chǎn)物，泳道25為DNAmarker ；下圖泳道1-19為tTR-KRAB轉(zhuǎn)基因founder鼠PCR產(chǎn)物，泳道20為野生型小鼠PCR產(chǎn)物，泳道21為PCR模板為純水對(duì)照物的PCR產(chǎn)物，泳道22為DNAmarker。圖4顯示了本發(fā)明用于制備Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖5顯示了 Nmyc-TRE-EGFP-Knockin質(zhì)粒ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染同源重組陽(yáng)性ES細(xì)胞PCR鑒定不意圖。其中，圖A為左臂鑒定示意圖，圖中左邊泳道為DNA marker, 1-5所示為陽(yáng)性ES細(xì)胞PCR產(chǎn)物結(jié)果，6為陰性ES細(xì)胞PCR產(chǎn)物結(jié)果；圖B為右臂鑒定示意圖，1-5所示為陽(yáng)性ES細(xì)胞PCR產(chǎn)物結(jié)果，6，7為陰性ES細(xì)胞PCR產(chǎn)物結(jié)果，右邊泳道為DNA marker。圖6顯示了在無強(qiáng)力霉素情況下tTR-KRAB對(duì)Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠Nmyc啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控效果。其中，圖A為Realtime PCR檢測(cè)結(jié)果圖；圖B為Western檢測(cè)結(jié)果圖；圖C為突光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果圖。圖7顯示了在添加強(qiáng)力霉素情況下tTR-KRAB對(duì)Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠Nmyc啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控效果。其中，圖A為Realtime PCR檢測(cè)結(jié)果圖；圖B為Western檢測(cè)結(jié)果圖；圖C為熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果圖。圖8顯示了有無強(qiáng)力霉素條件下，RtTR-KRAB對(duì)Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠Nmyc啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控效果。其中，圖A為在無強(qiáng)力霉素情況下，Realtime PCR檢測(cè)結(jié)果圖B為在有強(qiáng)力霉素情況下，Realtime PCR檢測(cè)結(jié)果圖；圖C為無強(qiáng)力霉素情況下，熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果圖。圖9顯示了 Cre酶作用前后Nmyc基因的結(jié)構(gòu)。
圖10顯示了有無強(qiáng)力霉素(dox)條件下，tTR-KRAB對(duì)Nmyc-TRE-Knockin小鼠內(nèi)源Nmyc基因的表達(dá)調(diào)控效果。
具體實(shí)施例方式針對(duì)目前基因功能研究中的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的缺陷，本發(fā)明人經(jīng)廣泛的研究以及反復(fù)的試驗(yàn)，首次提出了一種對(duì)動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源基因進(jìn)行可誘導(dǎo)的可逆調(diào)控表達(dá)的方法，通過基因重組技術(shù)將四環(huán)素響應(yīng)元件(TRE)定點(diǎn)插入到動(dòng)物擬調(diào)控的內(nèi)源基因的合適位置；通過轉(zhuǎn)基因方法將調(diào)控基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物基因組內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在誘導(dǎo)物四環(huán)素或其類似物的作用下實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源基因的可逆的表達(dá)調(diào)控。該方法建立的小鼠內(nèi)源基因誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控模型可廣泛應(yīng)用于基因功能研究，疾病動(dòng)物模型的建立等領(lǐng)域。術(shù)語(yǔ)如本文所用，所述的“動(dòng)物”沒有特別的限制，只要其是適合于采用本發(fā)明的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作并能夠產(chǎn)生子代(后代)，且是有性繁殖的動(dòng)物。例如，所述的動(dòng)物包括但不限于蟲、果蠅線、魚、大鼠、小鼠、猴。作為一種可選的方式，所述的動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，更特別的是非人哺乳動(dòng)物。例如，所述的非人哺乳動(dòng)物選自小鼠、大鼠、兔、狗、猴。所述的非人哺乳動(dòng)物在基因組的組成、個(gè)體的發(fā)育、代謝方式、器官解剖、疾病發(fā)病機(jī)制等方面和人類接近。優(yōu)選的，所述的非人哺乳動(dòng)物是鼠；更優(yōu)選的是小鼠。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，以小鼠作為模式生物，和人類相比，它無論在基因組的組成、個(gè)體的發(fā)育、代謝方式、器官解剖、疾病發(fā)病機(jī)制等都和人類非常接近，因此可良好地應(yīng)用于人類疾病發(fā)病機(jī)制、藥物藥理學(xué)研究等方面。如本文所用，除非另外說明，“/”表示“或”。如本文所用，所述的“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子區(qū)(域)”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識(shí)別位點(diǎn)。如本文所用，“外源的”或“異源的”是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動(dòng)子對(duì)于該目的基因來說是外源的。特定序列對(duì)于其所插入的細(xì)胞或生物體來說是“外源的”。如本文所用，“內(nèi)源的”基因或蛋白是指天然地或內(nèi)在地包含在動(dòng)物體基因組中的基因或蛋白。如本文所用，“目的基因”是指欲(擬)調(diào)控的基因，也即由本發(fā)明的方法調(diào)控表達(dá)的基因。本發(fā)明中，“目的基因”可以是基因組中任何感興趣的、需要了解其功能的基因。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)
成”、“基本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”；“主要由......構(gòu)成”、“基本上
由......構(gòu)成”和“由......構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。原理本發(fā)明的調(diào)控內(nèi)源基因表達(dá)的原理為轉(zhuǎn)錄抑制因子可通過結(jié)合到近啟動(dòng)子區(qū)域的TRE位點(diǎn)上，引起內(nèi)源基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化和去乙?；?，引發(fā)轉(zhuǎn)錄抑制；轉(zhuǎn)錄激活因子同樣可以結(jié)合TRE位點(diǎn)，達(dá)到激活目標(biāo)基因的過表達(dá)。而這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與TRE的結(jié)合都受四環(huán)素及其類似物調(diào)控，因此可以通過四環(huán)素及其類似物的有無調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與TRE位點(diǎn)的結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)可逆地調(diào)控內(nèi)源基因的表達(dá)。四環(huán)素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)四環(huán)素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)包括Tet-off和Tet-on兩個(gè)系統(tǒng)(圖I)。Tet-off系統(tǒng)由調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒組成。調(diào)節(jié)質(zhì)粒包含一個(gè)雜合的四環(huán)素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄活化因子(tetracycline_controlled transactivator, tTA),它是由大腸桿菌TnlO 四環(huán)素抗性操縱子中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的阻遏蛋白(tet repressor protein,TetR)與單純皰疫病毒(HSV)VP16蛋白羧基末端的一段轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合而成(序列例如SEQ ID N0:4)，VP16轉(zhuǎn)錄激活區(qū)可招募RNA聚合酶II起始轉(zhuǎn)錄。tTA序列受人巨細(xì)胞病毒IE啟動(dòng)子(Phcmv)調(diào)控。反應(yīng)質(zhì)粒中含有目的基因，并受四環(huán)素反應(yīng)元件(tet-responsive element, TRE)的操縱。TRE包含有操縱基因(tet operator, TetO)的42個(gè)堿基的7次正向重復(fù)序列，它的下游為人巨細(xì)胞病毒的最低限度啟動(dòng)子(minimal CMV promoter,P minCMV) ,minimal Phcmv將PhCMV 中增強(qiáng)子區(qū)去掉后余下的啟動(dòng)子序列，當(dāng)沒有tTA結(jié)合到tetOs的時(shí)候minimal P hcmv處于轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài),如圖IB所示，當(dāng)沒有四環(huán)素或其衍生物的時(shí)候，tTA結(jié)合到tetOs上，起始P minCMV的轉(zhuǎn)錄，目的基因表達(dá)；當(dāng)存在四環(huán)素或其衍生物的時(shí)候，四環(huán)素或其衍生物與tTA結(jié)合，不能結(jié)合到PminCMV上，轉(zhuǎn)錄終止，目的基因不表達(dá)。Tet_on系統(tǒng)與Tet-off系統(tǒng)類似，也是由調(diào)控質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒組成，只是將Tet-on系統(tǒng)中的調(diào)控質(zhì)粒的tTA經(jīng)氨基酸突變成為rtTA (reversetetracycline (Tet) -controlledtransactivator, SEQ ID NO :5), rtTA 具有與 tTA 相反的藥理學(xué)性質(zhì)，如圖IA所示，在沒有四環(huán)素或其衍生物的時(shí)候，不能結(jié)合特異的DNA靶序列(TetO),不能引發(fā)轉(zhuǎn)錄,而在加入四環(huán)素或其衍生物強(qiáng)力霉素(doxycycline, Dox)后,才能與tetO結(jié)合，引發(fā)下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。轉(zhuǎn)錄抑制因子tTR-KRAB/RtTR-KRAB轉(zhuǎn)錄抑制因子tTR-KRAB為一融合蛋白，它是由大腸桿菌TnlO四環(huán)素抗性操縱子中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的阻遏蛋白(tet repressor protein, TetR)與Koxl蛋白的KRAB結(jié)構(gòu)域融合而成；而RtTR-KRAB是由RtTR蛋白(TetR蛋白氨基酸突變體)與KRAB結(jié)構(gòu)域融合而成。tTR/RtTR結(jié)構(gòu)域可以與四環(huán)素響應(yīng)位點(diǎn)(TRE)特異性結(jié)合，但兩者具有相反的藥理學(xué)特性，tTR在沒有四環(huán)素或其衍生物的情況下可以結(jié)合到TRE位點(diǎn)上，有四環(huán)素或其衍生物的情況下不能與TRE位點(diǎn)結(jié)合；而RtTR則是在有四環(huán)素或其衍生物的情況下可以結(jié)合到TRE位點(diǎn)上，沒有四環(huán)素或其衍生物的情況下不能與TRE位點(diǎn)結(jié)合。KRAB結(jié)構(gòu)域可以招募甲基化酶和去乙?；?，導(dǎo)致結(jié)合位點(diǎn)旁邊3kb區(qū)域內(nèi)DNA區(qū)域甲基化去乙酰化，抑制轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。關(guān)于tTR-KRAB或RtTR-KRAB的描述還可參考文獻(xiàn)ULRICH. DEUSCHLE，et. al. Tetracycline-Reversible Silencing ofEukaryotic Promoters. MOLECULARAND CELLULAR BIOLOGY, Apr. 1995，p. 1907-1914 和 Jolanta Szulc, et. al. A versatiletool for conditional geneexpression and knockdown. NATURE METHODS VOL.3 NO. 2FEBRUARY2006 109。因此，可以通過四環(huán)素或其衍生物(如強(qiáng)力霉素)的有無，調(diào)控tTR-KRAB/RtTR-KRAB與TRE位點(diǎn)的結(jié)合，從而可逆地下調(diào)內(nèi)源基因的表達(dá)。當(dāng)將tTA/rtTA代替tTR-KRAB/RtTR-KRAB，上述模型可以演變?yōu)閷?duì)內(nèi)源基因上調(diào)表達(dá)的方式。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的轉(zhuǎn)錄抑制因子tTR-KRAB具有SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列；所述的轉(zhuǎn)錄抑制因子RtTR-KRAB具有SEQ ID NO : 3所示的氨基酸序列。轉(zhuǎn)基因在本發(fā)明中，四環(huán)素響應(yīng)元件(TRE)的插入可通過同源重組或隨機(jī)插入等方法進(jìn)行。在本領(lǐng)域中，通過同源重組或者隨機(jī)插入在基因組中插入DNA片段的技術(shù)是已知的，這些常規(guī)技術(shù)都可用于本發(fā)明。在本發(fā)明中，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制因子tTR-KRAB/RtTR-KRAB對(duì)目的基因的表達(dá)調(diào)控可以將目的基因組中含TRE位點(diǎn)的動(dòng)物和預(yù)先制備好的tTR-KRAB/RtTR-KRAB轉(zhuǎn)基因動(dòng)物交配獲得，也可以通過對(duì)含TRE位點(diǎn)動(dòng)物受精卵或機(jī)體注射表達(dá)tTR-KRAB/RtTR-KRAB的病毒 或者質(zhì)粒載體實(shí)現(xiàn)，這些常規(guī)方法都可用于本發(fā)明。在本發(fā)明的一具體實(shí)例中，通過將TRE位點(diǎn)及EGFP基因定點(diǎn)插入到Nmyc基因第一個(gè)內(nèi)元中建立了一個(gè)Nmyc基因的響應(yīng)小鼠(命名為Nmyc-TRE-EGFP-Knockin小鼠)，在該小鼠中EGFP的表達(dá)受Nmyc內(nèi)源啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)，因此可通過EGFP表達(dá)來反映Nmyc基因啟動(dòng)子的表達(dá)活性，將該Nmyc-TRE-EGFP-Knockin響應(yīng)小鼠與tTR-KRAB轉(zhuǎn)基因小鼠交配，檢測(cè)表明在其后代胚胎中的EGFP和tTR-KRAB雙陽(yáng)性胚胎中，EGFP的表達(dá)受到tTR-KRAB的嚴(yán)格調(diào)控在無強(qiáng)力霉素的情況下，雙陽(yáng)性胚胎中EGFP的表達(dá)約為單EGFP陽(yáng)性小鼠的1/300，即雙陽(yáng)性小鼠中Nmyc啟動(dòng)子的活性為正常水平的1/300，Nmyc啟動(dòng)子受到了tTR-KRAB的顯著抑制；而在強(qiáng)力霉素的誘導(dǎo)下，雙陽(yáng)性胚胎中EGFP的表達(dá)與EGFP單陽(yáng)性小鼠的表達(dá)，無顯著性差別，Nmyc基因啟動(dòng)子處于全開放狀態(tài)。在本發(fā)明的另一具體實(shí)例中，將該Nmyc-TRE-EGFP-Knockin響應(yīng)小鼠與RtTR-KRAB轉(zhuǎn)基因小鼠交配，檢測(cè)表明在其后代胚胎中的EGFP和RtTR-KRAB雙陽(yáng)性胚胎中，EGFP的表達(dá)受到RtTR-KRAB的嚴(yán)格調(diào)控在有強(qiáng)力霉素的情況下，雙陽(yáng)性胚胎中EGFP的表達(dá)約為單EGFP陽(yáng)性小鼠的1/500，即雙陽(yáng)性小鼠中Nmyc啟動(dòng)子的活性為正常水平的1/500，Nmyc啟動(dòng)子受到了 RtTR-KRAB的顯著抑制；而在無強(qiáng)力霉素的情況下，雙陽(yáng)性胚胎中EGFP的表達(dá)與EGFP單陽(yáng)性小鼠的表達(dá)，無顯著性差別，Nmyc基因啟動(dòng)子處于全開放狀態(tài)。細(xì)胞此外，本發(fā)明還提供了一種來源于所述模式動(dòng)物的細(xì)胞，所述的細(xì)胞的基因組中既包括四環(huán)素響應(yīng)元件、又包括轉(zhuǎn)錄抑制因子或轉(zhuǎn)錄激活因子的編碼基因。較佳地，所述的細(xì)胞為非胚胎干細(xì)胞或生殖細(xì)胞。優(yōu)選地，所述的細(xì)胞為體細(xì)胞。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于I)所調(diào)控的基因可以為動(dòng)物內(nèi)源基因；2)對(duì)目的基因的調(diào)控具有可誘導(dǎo)性；3)對(duì)目的基因的開關(guān)具有可逆性；4)該方法建立的動(dòng)物模型,遺傳穩(wěn)定,表型穩(wěn)定。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork :Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和
份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例ICAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的tTR-KRAB和RtTR-KRAB轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒構(gòu)建pcDNA3-CAG promoter-tTR-KRAB 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建流程為I)pcDNA3. I (-)-Hygromycin (購(gòu)自 Invitrogen 公司)質(zhì)粒 BglII 和 NheI 雙酶切去除原有的CMV promoter后補(bǔ)平、連接，經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切后作為載體以備連入CAG promoter ；2) PLVCT-tTR-KRAB 或 PLVCT-RtTR-KRAB 質(zhì)粒(購(gòu)自 addgene 公司)SpeI 和 BamHI雙酶切得到CAG promoter片段；3)將I)中的載體片段與2)中的CAG promoter連接得至IjpcDNA3. I (-) -Hygromycin-CAG promoter 載體，將該載體用 BamHI 和 KpnI 雙切后，與PCR(以PLVCT-tTR-KRAB或PLVCT-RtTR-KRAB質(zhì)粒為模板)獲得的經(jīng)BamHI和KpnI酶切后的tTR-KRAB或RtTR-KRAB (也稱為tTR-KRAB/RtTR-KRAB)片段連接，得到pcDNA3-CAGpromoter-tTR-KRAB/RtTR-KRAB,簡(jiǎn)稱 CAG 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 tTR-KRAB 和 RtTR-KRAB質(zhì)粒，結(jié)構(gòu)如圖2所示。實(shí)施例2CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的tTR-KRAB和RtTR-KRAB轉(zhuǎn)基因小鼠制備將pcDNA3-CAG promoter-tTR-KRAB/RtTR-KRAB 質(zhì)粒用 BciVI 和 EcoRI 酶切后，割膠回收含 CAG promoter-tTR-KRAB-polyA 和含 CAGpromoter-RtTR-KRAB-polyA 片段,通過受精卵細(xì)胞雄原核DNA顯微注射獲得轉(zhuǎn)基因Founder鼠(制備Founder鼠參見GordonK，Ruddle FH.1986. Genetransfer into mouse embryos. Dev Biol(NY1985) 4 :1-36.Kupriyanov S, Zeh K, Baribault H. 1998. Double pronuclei injection of DNA intozygotes increasesyields of transgenic mouse lines. Transgenic Res 7 :223-226)。CAG promoter-tTR-KRAB-polyA片段顯微注射共出生101只小鼠，經(jīng)兩次PCR鑒定得到20只轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠；CAG promoter-RtTR-KRAB-polyA片段顯微注射所生后代中，經(jīng)兩次PCR鑒定得到19只轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠。PCR鑒定結(jié)果如圖3所示。實(shí)施例3Nmyc-TRE-EGFP-Knockin 打祀載體構(gòu)建利用ET-Clone技術(shù)通過兩步同源臂套取，獲得目的打靶載體。步驟如下首先從Nmyc BAC(購(gòu)自英國(guó)Gene Service公司)上通過PCR獲得長(zhǎng)度為200_400bp間的4個(gè)同源小臂a、b、c和d(其分別位于打靶載體5’臂的5’端、3’臂的3’端、5’臂的3’端和3’臂的5’端)。采用的引物如表I。表I
權(quán)利要求
1.一種制備模式動(dòng)物的方法，所述模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因是可誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)的，所述方法包括 (1)建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物I:該動(dòng)物I基因組中，目的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近插入了四環(huán)素響應(yīng)元件； (2)建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物2:該動(dòng)物2基因組中，包括轉(zhuǎn)錄抑制因子或轉(zhuǎn)錄激活因子的編碼基因，所述的轉(zhuǎn)錄抑制因子或轉(zhuǎn)錄激活因子可與四環(huán)素響應(yīng)元件結(jié)合，且所述結(jié)合受四環(huán)素或其類似物調(diào)控； (3)將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物I和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物2進(jìn)行交配，選出基因組中既包括四環(huán)素響應(yīng)元件、又包括轉(zhuǎn)錄抑制因子或轉(zhuǎn)錄激活因子的編碼基因的動(dòng)物，作為模式動(dòng)物。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的四環(huán)素響應(yīng)元件插入在所述的目的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游或下游4000bp范圍內(nèi)。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于， 所述的轉(zhuǎn)錄抑制因子選自tTR-KRAB或RtTR-KRAB ； 所述的轉(zhuǎn)錄激活因子選自tTA或rtTA。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)、⑵或(3)中，還分別包括，對(duì)獲得的動(dòng)物進(jìn)行交配建系，獲得子代動(dòng)物。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的四環(huán)素的類似物是強(qiáng)力霉素。
6.一種誘導(dǎo)調(diào)控模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因表達(dá)的方法，所述方法包括 (a)提供模式動(dòng)物，所述模式動(dòng)物通過權(quán)利要求I所述的方法獲得； (b)給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，從而調(diào)控模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因的表達(dá)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于， (a)所述的模式動(dòng)物中，包括轉(zhuǎn)錄抑制因子RtTR-KRAB的編碼基因；(b)中，給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因的表達(dá)受到抑制；不給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，目的內(nèi)源基因正常表達(dá)；或者 (a)所述的模式動(dòng)物中，包括轉(zhuǎn)錄抑制因子tTR-KRAB的編碼基因；(b)中，不給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因的表達(dá)受到抑制；給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，目的內(nèi)源基因的表達(dá)抑制被解除；或者 (a)所述的模式動(dòng)物中，包括轉(zhuǎn)錄激活因子tTA的編碼基因；(b)中，給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因的正常表達(dá)；不給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，目的內(nèi)源基因超表達(dá)；或者 (a)所述的模式動(dòng)物中，包括轉(zhuǎn)錄激活因子rtTA的編碼基因；(b)中，給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，激活模式動(dòng)物中目的內(nèi)源基因的超表達(dá)；不給予(a)的模式動(dòng)物四環(huán)素或其類似物，目的內(nèi)源基因正常表達(dá)。
8.一種模式動(dòng)物在基因功能研究中的用途，所述的模式動(dòng)物通過權(quán)利要求I所述的方法獲得。
9.一種細(xì)胞,其來源于一種模式動(dòng)物,所述的模式動(dòng)物通過權(quán)利要求I所述的方法獲得。
10.權(quán)利要求9所述的體細(xì)胞在基因功能研究中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種調(diào)控動(dòng)物內(nèi)源基因表達(dá)的遺傳修飾方法。本發(fā)明通過基因重組技術(shù)將四環(huán)素響應(yīng)元件定點(diǎn)插入到動(dòng)物擬調(diào)控的內(nèi)源基因的合適位置；通過轉(zhuǎn)基因方法將調(diào)控基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物基因組內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在誘導(dǎo)物四環(huán)素或其類似物的作用下實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源基因的可逆的表達(dá)調(diào)控。該方法建立的小鼠內(nèi)源基因誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控模型可廣泛應(yīng)用于基因功能研究，疾病動(dòng)物模型的建立等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102669057SQ20111006697
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者孫瑞林, 毛積芳, 王鑄鋼, 費(fèi)儉 申請(qǐng)人:上海南方模式生物研究中心, 上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司