專利名稱：密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素b氨基端基因序列及其核酸疫苗的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領域，涉及密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列及其核酸疫苗。
背景技術(shù)：
艱難梭菌是一種有芽胞的、專性厭氧的革蘭氏染色陽性梭狀桿菌，其主要的毒力因子為外毒素A和外毒素B。自2000年以來，艱難梭菌相關(guān)性腹瀉已經(jīng)成為醫(yī)學界一個亟需解決的難題。一方面，艱難梭菌感染發(fā)病率、重癥率、死亡率越來越高，耐藥率也逐年上升。首先，艱難梭菌廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境中，而且其能夠耐受多種院內(nèi)常用消毒劑的芽胞這一特殊生存狀態(tài)的存在加劇了它在醫(yī)院內(nèi)的播散，艱難梭菌已經(jīng)成為院內(nèi)感染性腹瀉的最主要的病原體之一。其次，甲硝唑、萬古霉素，作為治療艱難梭菌感染的兩種主要的藥物，它們的耐藥性也在不斷地累積、傳播，療效日趨降低，而且對于復發(fā)病例的治療，這兩種藥物呈現(xiàn)出無能狀態(tài)。另外一方面，艱難梭菌感染形勢異常嚴峻但其預防、診斷、治療卻面臨著重重困難。第一，目前尚無針對艱難梭菌的商品化的疫苗；第二，現(xiàn)有的基于外毒素A和B的 ELISA檢測試劑盒價格昂貴且存在著一定的假陽性和假陰性率，難以對艱難梭菌進行臨床常規(guī)檢測并且也難以進行大規(guī)模的流行病學調(diào)查和長期的監(jiān)測；第三，雖然新近已有針對外毒素A和外毒素B羧基端的治療性單克隆抗體問世，但仍處在早期臨床試驗階段，所呈現(xiàn)的治療效果也有一定的局限性。所以，急需開發(fā)以艱難梭菌外毒素B為基礎的安全、有效、 方便、廉價的艱難梭菌疫苗來保護高危人群；同時，爭取在疫苗的基礎上開發(fā)相應的單克隆抗體，為靈敏度高、特異性好、高效、經(jīng)濟的診斷試劑及安全、有效、廉價的治療性抗體打下扎實基礎。艱難梭菌外毒素B是一種強烈的細胞毒素。傳統(tǒng)觀點認為外毒素A是艱難梭菌致病所必需的而外毒素B則可有可無，但最近的一些研究結(jié)果卻提示外毒素A陰性、外毒素B 陽性的菌株與外毒素A和B均陽性的菌株一樣也能致病，且有研究發(fā)現(xiàn)外毒素B可以不依賴于外毒素A而獨立致病，尤其值得注意的是外毒素A陰性、外毒素B陽性菌株的分離率有增高的趨勢但迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)外毒素A陽性、外毒素B陰性的菌株?；诖?，疫苗的開發(fā)必須包括外毒素B、診斷的時候必須強調(diào)外毒素B、治療的時候必須同時針對外毒素B。外毒素B氨基端的546個氨基酸構(gòu)成了其毒性區(qū)域，即外毒素B的毒性作用依賴于這一區(qū)域所具有的酶活性，通過一系列信號轉(zhuǎn)導最終導致細胞凋亡。而且有研究發(fā)現(xiàn)，即使將外毒素 B羧基端的受體結(jié)合域去除，外毒素B的毒性作用不會完全消失，只是降為原來的1/10左右。所以，艱難梭菌外毒素B氨基端是疫苗研究和抗體開發(fā)的理想結(jié)構(gòu)域。目前針對這一區(qū)域具有體內(nèi)中和效應的抗體還尚未見報到。核酸疫苗(nucleicvaccine)，又名基因疫苗(gene vaccine)或 DNA 疫苗(DNA vaccine)，其本質(zhì)是含有抗原基因的真核表達載體被導入動物機體后為動物細胞所攝取并表達相應的抗原蛋白，從而誘導機體對該蛋白產(chǎn)生免疫反應。它以其獨特的優(yōu)點吸引著人們1)DNA免疫能夠模擬自然感染狀態(tài)，在動物體內(nèi)合成具有相應空間構(gòu)象的蛋白，通過 MHC I類和II類分子直接遞呈，能夠激發(fā)機體產(chǎn)生既針對線性表位又針對構(gòu)象表位的抗體，還能夠誘導產(chǎn)生特異性的細胞免疫反應，這是滅活疫苗和亞單位疫苗所不能比擬的；2) 免疫原的單一性和可塑性。相對于重組的病毒活載體疫苗會表達除了目的蛋白外的其他很多蛋白，核酸疫苗的載體本身沒有抗原性而且在真核細胞內(nèi)只表達相應的目的抗原。同時， 正是其以DNA為免疫原，所以可在DNA水平對密碼子進行優(yōu)化、修飾，可以進行不同基因的融合表達，構(gòu)建更高效的疫苗；3)核酸疫苗易于構(gòu)建和制備，穩(wěn)定性好，成本低廉，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。但是，用來構(gòu)建外毒素B核酸疫苗的目的基因是來自于艱難梭菌這一原核生物的，而疫苗的研究和應用對象主要為真核生物，如小鼠、獼猴、人類等高級哺乳動物。由于原核生物與真核生物在密碼子使用偏好上存在差異，導致用來構(gòu)建核酸疫苗的外源基因在哺乳動物宿主體內(nèi)不能有效表達，因此就不能有效地刺激宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生較好的免疫保護作用。這是目前核酸疫苗免疫原性較低的主要原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺陷，提供一種密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列。本發(fā)明的另一目的是提供一種由上述基因構(gòu)建的艱難梭菌外毒素核酸疫苗。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)一種密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列，序列為SEQ ID NO. 1。一種艱難梭菌外毒素B核酸疫苗，該疫苗由權(quán)利要求1所述的艱難梭菌外毒素B 氨基端基因序列與真核表達載體組成。所述的真核表達載體為PJW4303。一種核酸疫苗組合物，該組合物包括權(quán)利要求3所述的艱難梭菌外毒素B核酸疫苗pJW4303-TcdB-N以及艱難梭菌外毒素A核酸疫苗pJW4303-TcdA_C。所述的艱難梭菌外毒素A核酸疫苗pJW4303-TcdA-C是將經(jīng)密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列插入真核表達載體pJW4303的I^st I和BamH I酶切位點之間所得。所述的經(jīng)密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列為SEQ ID NO. 4。艱難梭菌外毒素A核酸疫苗pJW4303-TcdA-C的構(gòu)建方法詳見中國發(fā)明專利申請 201010130904. 8 “密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列及其核酸疫苗”。本發(fā)明提供的密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因片段及其核酸疫苗的構(gòu)建步驟如下(1)密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因片段的設計和合成首先選取艱難梭菌外毒素B基因氨基端1638bp，然后運用軟件MacVector 7. 2分析其基因序列，找出其密碼子使用偏好同時找出與哺乳動物密碼子使用偏好、與大腸桿菌密碼子使用偏好不同的密碼子位點。對于哺乳動物和大腸桿菌使用偏好相同的密碼子，用哺乳動物和大腸桿菌都偏好的密碼子替代艱難梭菌外毒素B基因中使用偏好不同的密碼子，然后設計出密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端序列，并經(jīng)過基因公司化學合成得到了密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列。密碼子優(yōu)化的序列所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與原有的氨基酸序列(SEQ ID NO. 3)保持一致。例如艱難梭菌外毒素B基因中編碼異亮氨酸Ile的三聯(lián)體密碼子主要是ATT，而在人類、小鼠等高級哺乳動物基因組中主要是ATC，在大腸桿菌中也主要是ATC，在密碼子優(yōu)化時會選用哺乳動物細胞和大腸桿菌都偏好的密碼子ATC。優(yōu)化后的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列為SEQ ID NO. 1，優(yōu)化前的序列為SEQ ID NO. 2。(2)對基因公司提供的含有目標序列的重組載體pMK-RQ-TcdB-N進行I^st I和 BamH I 雙酶切，用 DNA 凝膠回收試劑盒(TaKa Ra Agarose Gel DNAPurification Kit Ver. 2. 0，大連寶生物公司)回收純化約1638bp的目的片段，該片段為在密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列(TcdB-N)兩端分別連接有I^st I和BamH I酶切位點的基因序列，以便于核酸疫苗的構(gòu)建。(3)將步驟(2)得到的基因片段克隆到真核表達載體PJW4303中，得到重組質(zhì)粒 pJW4303-TcdB-N。經(jīng)對重組質(zhì)粒抽提、酶切、測序后，確定得到了與預期相符的質(zhì)粒即為本發(fā)明所述的艱難梭菌外毒素核酸疫苗。本發(fā)明的有益效果與野生型基因相比，密碼子優(yōu)化的基因中哺乳動物細胞偏好的密碼子和大腸桿菌偏好的密碼子出現(xiàn)頻率增加，但是其編碼的艱難梭菌外毒素B氨基端氨基酸序列不變，從而使其更適于在哺乳動物細胞和大腸桿菌中的蛋白表達。由于自然界生物體存在密碼子的偏好性，從病原體來源的艱難梭菌外毒素B氨基端基因在異源宿主體內(nèi)難以有效表達，因此就不能有效的刺激宿主的免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生較好的免疫保護作用。為了提高異源基因在哺乳動物和大腸桿菌中的表達效率，往往需要對其核苷酸編碼序列進行優(yōu)化。由于目前對核苷酸序列的優(yōu)化尚沒有統(tǒng)一的標準或原則。 因此針對相同的氨基酸序列，不同的研究人員完全會設計出不同的核苷酸序列用于目標多肽的表達，相應地表達效率也可能存在差異。根據(jù)我們優(yōu)化的核苷酸編碼序列，克服了上述缺陷，提高了艱難梭菌外毒素B氨基端蛋白表達水平。并且將該優(yōu)化后的基因用于構(gòu)建核酸疫苗，在免疫哺乳動物后有效地刺激了宿主的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生了較好的體液免疫反應，并在體內(nèi)、體外的模型中顯示出了良好的保護能力。發(fā)明人將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因直接克隆入真核表達載體，構(gòu)建了艱難梭菌外毒素核酸疫苗pJW4303-TcdB-N，該疫苗能夠在真核細胞細胞中有效表達，免疫動物能刺激產(chǎn)生特異性抗體，并且體內(nèi)、體外模型顯示這些特異性抗體具有良好的保護效應。本發(fā)明疫苗組合物在充分發(fā)揮艱難梭菌外毒素A核酸疫苗pJW4303-TcdA-C作用的前提下，克服了兩種核酸疫苗單用時對動物保護作用均不強的缺陷，顯著提高了疫苗的保護作用。


圖1野生型和密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列的密碼子偏好性比較結(jié)果；A為野生型和密碼子優(yōu)化型艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列在哺乳動物細胞表
5達偏好的比較(指數(shù)> 1為哺乳動物細胞所偏好)，縱坐標表示偏好指數(shù)，橫坐標表示核苷酸序列位置。左圖為野生型艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列，右圖為密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列。B為野生型和密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列在大腸桿菌表達偏好的比較(指數(shù)> 1為大腸桿菌所偏好)，縱坐標表示偏好指數(shù)，橫坐標表示核苷酸序列位置。左圖為野生型艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列，右圖為密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列。圖2質(zhì)粒pJW4303-TcdB_N的酶切電泳圖譜；M，marker ；1、3、5、7、9泳道分別為第一、二、三、四、五號克隆未經(jīng)酶切的電泳圖； 2、4、6、8、10泳道分別為第一、二、三、四、五號克隆經(jīng)I3St I和BamH I雙酶切的電泳圖。圖3轉(zhuǎn)染pJW4303-TcdB_N的細胞目的蛋白表達的^festern blot分析結(jié)果；1 :pJW4303-TcdB-N 轉(zhuǎn)染裂解液；2 :pJW4303-TcdB_N 轉(zhuǎn)染上清；3 :pJW4303 轉(zhuǎn)染裂解液；4 :pJW4303轉(zhuǎn)染上清?？乖瓰镻JW4303空載體、ρΙ4303- ^(1Β-Ν轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)上清或者裂解液，所用抗血清為免疫兔血清，稀釋度為1 500。圖4pJW4303、pJW4303-TcdB_N免疫BALB/c小鼠后IgG抗體應答時間曲線；A為pJW4303免疫BALB/c小鼠后的IgG抗體應答時間曲線，共7只小鼠(M1-M7)；B為ρΙ4303- ^(1Β-Ν免疫BALB/c小鼠后的IgG抗體應答時間曲線，共6只小鼠 (M8-M13)。圖5pJW4303-TcdB_N免疫新西蘭白兔后的^festern blot分析結(jié)果；1 :pJW4303-TcdB-N 轉(zhuǎn)染裂解液；2 :pJW4303-TcdB_N 轉(zhuǎn)染上清；3 :pJW4303 轉(zhuǎn)染裂解液；4 :pJW4303轉(zhuǎn)染上清?？乖瓰镻JW4303空載體、ρΙ4303- ^(1Β-Ν轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)上清或者裂解液，所用一抗為免疫兔血清，稀釋度為1 500。圖6pJW4303、pJW4303-TcdB-N免疫新西蘭白兔后特異性IgG抗體最高滴度PJW4303表示空載體免疫新西蘭白兔后的特異性IgG抗體最高滴度，共5只新西蘭白兔；pJW4303-TcdB-N表示pJW4303-TcdB_N DNA疫苗免疫新西蘭白兔后的特異性IgG 抗體最高滴度，共4只新西蘭白兔。圖7pJW4303-TcdB_N免疫兔血清在Vero細胞系上的毒素中和試驗；A圖細胞形態(tài)圖，其中1，細胞孔內(nèi)未加4CTU艱難梭菌VPI 10463培養(yǎng)液超濾物(正常細胞對照)；2，細胞孔內(nèi)只加入4CTU艱難梭菌VPI 10463培養(yǎng)液超濾物(毒素對照)；3，細胞孔內(nèi)加入的攻毒內(nèi)容物為4CTU艱難梭菌VPI 10463培養(yǎng)液超濾物與1 200 稀釋的Ρ 4303- ^(1Β-Ν免疫兔血清預混物；4，細胞孔內(nèi)加入的攻毒內(nèi)容物為4CTU艱難梭菌VPI10463培養(yǎng)液超濾物與1 100稀釋的pJW4303免疫兔血清預混物。B圖pJW4303-TcdB-N免疫兔血清的中和抗體滴度。圖8pJW4303-TcdB_N免疫兔血清在CHO細胞系上的毒素中和試驗；A圖細胞形態(tài)圖，其中1，細胞孔內(nèi)未加4CTU艱難梭菌VPI 10463培養(yǎng)液超濾物(正常細胞對照)；2，細胞孔內(nèi)只加入4CTU艱難梭菌VPI 10463培養(yǎng)液超濾物(毒素對照)；3，細胞孔內(nèi)加入的攻毒內(nèi)容物為4CTU艱難梭菌VPI 10463培養(yǎng)液超濾物與1 200稀釋的Ρ 4303- ^(1Β-Ν免疫兔血清預混物；4，細胞孔內(nèi)加入的攻毒內(nèi)容物為4CTU艱難梭菌VPI10463培養(yǎng)液超濾物與1 100稀釋的pJW4303免疫兔血清預混物。B圖pJW4303-TcdB-N免疫兔血清的中和抗體滴度。圖9pJW4303-TcdB_N免疫兔血清在BALB/c小鼠上的被動保護試驗；BALB/c小鼠腹腔注射攻毒內(nèi)容物，"None"為艱難梭菌VPI 10463培養(yǎng)液超濾物1 200 100 μ 1 ；"TcdB-N“為艱難梭菌VPI 10463培養(yǎng)液超濾物
I 200100 μ l+pJW4303-TcdB-N 免疫后兔血清 11 μ 1 ；"TcdA-C“為艱難梭菌 VPI 10463 培養(yǎng)液超濾物 1 200 100μ 1+ρΙ\ν4303- ^(1Α-(免疫后兔血清 11 μ 1 ^I^cdB-N+I^cdA-C” 為艱難梭菌VPI 10463培養(yǎng)液超濾物1 200 100 μ l+pJW4303-TcdA_C免疫后兔血清
IIμ l+pJW4303-TcdB-N 免疫后兔血清 11 μ 1 ；"Pre-bleed"為艱難梭菌 VPI 10463 培養(yǎng)液超濾物 1 200 100 μ l+pJW4303-TcdA-C 免疫前兔血清 5. 5 μ l+pJW4303-TcdB-N 免疫前兔血清5. 5 μ 1 ο注PJW4303-TcdA-C為由艱難梭菌外毒素A羧基端經(jīng)密碼子優(yōu)化后的基因序列與真核表達載體PJW4303構(gòu)建而成的艱難梭菌外毒素核酸疫苗，其制備方法見中國專利申請 201010130904. 8。
具體實施例方式實施例1密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列的設計與合成首先用軟件MacVector 7. 2分析編碼艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列SEQ ID NO. 2，找出其密碼子使用偏好以及與哺乳動物、大腸桿菌密碼子使用偏好不同的位點。對于使用偏好不同的密碼子位點，用哺乳動物細胞和大腸桿菌都偏好的密碼子替代，設計出密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列SEQ ID NO. 1。上述密碼子優(yōu)化的基因序列所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與其原有的氨基酸序列(SEQ ID N0. 3) 一致。將設計好的序列交美國GENEART公司合成，裝入載體pMK-RQ，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pMK-RQ-TcdB-N。經(jīng)測序證實合成的序列正確。上述密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列與野生型比較密碼子偏好性發(fā)生了改變。從圖1中由軟件MacVector 7. 2模擬出的結(jié)果可以看出，與野生型基因(未經(jīng)密碼子優(yōu)化)相比，密碼子優(yōu)化的基因中哺乳動物細胞偏好的密碼子和大腸桿菌偏好的密碼子出現(xiàn)頻率增加，但是它們所編碼的氨基酸序列不變，從而使其更適于在哺乳動物細胞和大腸桿菌中的蛋白表達。實施例2真核表達載體pJW4303-TcdB_N的構(gòu)建DTcdB-N片段、質(zhì)粒PJW4303線性大片段的獲得分別用I^st I和BamH I雙酶切質(zhì)粒ρJW4303和pMK-RQ-TcdB-N (由美國GENEART公司合成)。酶切反應體系為 lOXBufferTango 4 μ 1，質(zhì)粒(pJW4303、pMK-RQ-^TcdB-N) 10 μ 1，Pst I 1. 5μ 1, BamH I 1. 5μ 1，補水至 40 μ l，37°C，2h。2)酶切產(chǎn)物純化上述酶切產(chǎn)物經(jīng)10g/L的瓊脂糖凝膠電泳后，置于紫外檢測儀下，按照凝膠回收試劑盒(Agarose Gel DNAPurification Kit Ver. 2. 0，大連寶生物公司) 說明書，切下含目的片段的凝膠，分析天平稱膠塊的質(zhì)量，按Img = 1μ 1計算膠塊的體積。 加入4倍體積的DR-I Buffer，置于75°C水浴中加熱融化膠塊，間斷振蕩混合，直至膠塊完
7全融化，加入DR-I Buffer 體積的DR-II Buffer，充分混勻溶液。將離心吸附柱安置在收集管上，轉(zhuǎn)移混合溶液至吸附柱中，12000印111，離心11^11。棄上清液，加入50(^1 Rinse A 液，12000rpm，離心30s。棄上清液，加入700μ1 Rinse B液，12000rpm，離心30s，重復洗滌一次。將吸附柱安置在新的Ep管上，在吸附柱的膜中央滴加25 μ 1滅菌蒸餾水，靜置60s。 12000rpm，離心lmin，此時Ep管中的洗脫液即為目的DNA溶液。測定DNA溶液的濃度，用 10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析割膠純化效果，洗脫液保存在-20°C冰箱中備用。3)連接反應用T4DNA連接酶將TcdB-N目的片段與質(zhì)粒pJW4303線性大片段連接，得到pJW4303-TcdB-N重組表達質(zhì)粒，即為本發(fā)明所提供的艱難梭菌外毒素B氨基端的核酸疫苗。連接反應體系為10XT4DNA Ligase Buffer 1 μ 1，線性化的pJW4303 Ιμ ，純化的TcdB-N目的片段7μ l，T4DNALigase 1 μ 1，混勻，15°C放置16h。連接物轉(zhuǎn)化HBlOl感受態(tài)細胞。實施例3重組質(zhì)粒pJW4303-TcdB_N的鑒定3. lpJW4303-TcdB_N轉(zhuǎn)化大腸桿菌HBlOl感受態(tài)細胞(美國標準生物品收藏中心， 美國)1)將10 μ 1連接物加入到裝有100 μ 1 HBlOl感受態(tài)細胞的Ep管中，輕輕拍動管壁數(shù)次，充分混勻，冰浴30min。2)將Ep管置于42°C水浴中90s。3)向Ep管中緩慢加入LB培養(yǎng)基0. 5mL, 37°C，80rpm,振搖45min。4)將菌液涂布在含氨芐青霉素(0. lg/L)的LB平板上，37°C，培養(yǎng)過夜。3. 2篩選陽性克隆隨機挑取5個單菌落，分別接種于5只培養(yǎng)試管(含0. lg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基)中，37°C，200rpm振搖，培養(yǎng)過夜。3. 3小量提取重組質(zhì)粒pJW4303-TcdB_N(質(zhì)粒小量提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0, TaKaRa 公司)1)將3. 2中搖過夜的細菌在無菌超凈臺中緩慢吸到1. 5ml離心管中，培養(yǎng)試管中剩下少量菌液保存于4°C。2)離心管中菌液，常溫下12000rpm離心2min，棄上清。3)加入250 μ 1 Solution I充分懸浮細菌沉淀。4)加入250 μ 1 Solution II，溫和顛倒5-6次，形成透明溶液。5)加入400 μ 1 4°C預冷的Solution III，溫和顛倒5-6次，然后室溫靜置2min。6)室溫 12000rpm，離心 lOmin。7) Spin Column 安置于 Collection Tube 上，將 6)中上清液加入到 Spin Column 中，12000rpm離心lmin，棄上清。8)將 500 μ 1 Rinse A 加入 Spin Column 中，12000rpm 離心 30s，棄上清。9)將 700 μ 1 Rinse B 加入 Spin Column 中，12000rpm 離心 30s，棄上清。10)重復步驟9。11)將Spin Column安置在1. 5ml Ep上，在膜中央滴加60 μ 1的滅菌蒸餾水，室溫靜置Imin12) 12000rpm離心lmin，洗脫液即為含有質(zhì)粒的溶液。
3. 4 酶切鑒定質(zhì)粒 ρΙ4303- ^(1Β-Ν質(zhì)粒ρΙ4303- ^(1Β-Ν用Pst I和BamH I雙酶切。雙酶切反應體系(10 μ 1) lOXBufferTango 1 μ 1，質(zhì)粒(0. 22mg/mL) 2 μ 1，I3St I 0· 25 μ 1，BamH I 0. 25 μ 1，補水至 10 μ 1。37°C孵育濁。加入Ιμ IOXLoading buffer終止酶切反應。10g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，酶切后電泳圖譜見圖2。圖2顯示5個克隆均構(gòu)建正確。將酶切鑒定正確的細菌送上海英駿公司測序，測序正確細菌劃三次平板，任選其中兩個單克隆細菌保存。實施例4質(zhì)粒pJW4303-TcdB_N的大量制備(質(zhì)粒大提試劑盒為QIAGEN Plasmid Mega Kit (5)，Qiagen ^w])1)吸取鑒定正確的細菌保存液5 μ 1接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中， 37°C，200rpm，過夜生長?；冒? 500將1)中培養(yǎng)菌液接種于IOOOml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C， 200rpm，過夜生長。3)第二天將細菌移到250ml離心瓶中，4°C，6000g離心15min，棄上清，收集細菌。4)加入50ml緩沖液P1，反復振搖，使細菌全部重懸于溶液中。5)加入50ml緩沖液P2，溫和顛倒5_6次，溶液呈均勻藍色，靜置5min。6)加入50ml緩沖液P3，溫和顛倒5_6次，藍色溶液消失，溶液分層，上層為結(jié)實的乳白色團塊，下層為清亮液體，冰上放置30min。7)4°C，21000g，離心 30min，8)將上清轉(zhuǎn)移至另一離心瓶，4"C，21000g,離心15min。9)在吸附柱中加入QBT緩沖液35ml平衡吸附柱。10)將步驟8中得到的上清加到吸附柱內(nèi)，濾過，棄濾液。11)加入洗滌緩沖液QC 200ml，過柱，棄濾液。12)加入洗脫緩沖液QF 35ml，過柱，收集濾液。13)向收集液體中加入5ml異丙醇，4°C，16000g，離心30min，棄上清。14)加7ml 70%乙醇，常溫16000g離心lOmin，棄上清。15)將有沉淀的離心管于超凈臺自然晾干，然后用Iml生理鹽水溶解質(zhì)粒團塊。16)紫外分光光度法測定抽提所得溶液中的質(zhì)粒濃度及沈0/觀0比值。實施例5細胞轉(zhuǎn)染293T細胞用含100U/ml青霉素、0. lmg/ml鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37°C，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用2. 5g/L胰酶消化后，以 5. OX IO6個細胞(6mL)接種于IOcm培養(yǎng)皿中，待生長至80%融合時，依據(jù)PEI轉(zhuǎn)染法進行細胞轉(zhuǎn)染。取 PEI 75μ l,pJW4303-TcdB-N 15 μ g，加含 100U/ml 青霉素、0. lmg/ml 鏈霉素的 DMEM高糖培養(yǎng)基至825 μ 1，充分混勻，室溫孵育15min，然后將上述混合液加到培養(yǎng)皿中并輕輕搖動使混合均勻，同時以PJW4303空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞作為陰性對照。他后更換不含血清含100U/ml青霉素、0. lmg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)4 后收獲培養(yǎng)上清及細胞裂解液，進行W^estern blot分析。分析結(jié)果如圖3所示。圖3中顯示pJW4303-TcdB_N 轉(zhuǎn)染細胞后可在上清及細胞裂解液中檢出特異性蛋白的表達，其表觀分子量約為 63. 4kDa。陰性對照空載體PJW4303轉(zhuǎn)染細胞的上清及裂解液沒有檢出特異性蛋白的存在。Western blot分析表明，pJW4303-TcdB_N核酸疫苗可以在細胞內(nèi)表達相應的蛋白并分泌出來。說明經(jīng)密碼子優(yōu)化后的核酸疫苗能在宿主細胞中表達蛋白。其中，轉(zhuǎn)染細胞收獲步驟為吸取細胞上清液，2500rpm，室溫，離心lOmin，吸取上清-20°C凍存。用PBS (濃度10mM，pH7. 2)將細胞從培養(yǎng)皿中洗脫，收集細胞懸液，2500rpm， 室溫，離心 lOmin，棄上清，加入裂解液(50mM Tris-HCl PH7. 6,150mM NaCl，1 % Triton，臨用前加入2% IOOmM PMSF(苯甲基磺酰氟))，冰上孵育15min，12000rpm，4°C，離心60min， 收集上清液，-20°C凍存。實施例6密碼子優(yōu)化pJW4303-TcdB-N核酸疫苗免疫原性的研究在核酸疫苗構(gòu)建和表達成功后，對實驗動物進行免疫，通過ELISA和Wfestern blot方法檢測密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端核酸疫苗的免疫原性和誘導產(chǎn)生的抗體的特異性。6. lpJW4303-TcdB-N免疫BALB/c小鼠和新西蘭白兔，實驗設計如下表lpJW4303-TcdB-N 免疫 BALB/c 小鼠
組別數(shù)量(只)核酸疫苗劑量A7空載體PJW4303100 μ gB6PJW4303-TcdB-N100 μ g如表1，用空載體pJW4303和pJW4303-TcdB-N各免疫一組BALB/c小鼠。肌肉注射 100 μ g相應質(zhì)粒，注射后立即于注射部位用WJ-2002活體基因?qū)雰x進行體內(nèi)電轉(zhuǎn)染(針頭插入深度至少2mm，電轉(zhuǎn)染參數(shù)電壓50V，脈沖次數(shù)正反各3次，波寬30ms，頻率30Hz)， 以小鼠腿部肌肉發(fā)生抖動視為電轉(zhuǎn)染有效。于第0、2、4、8周進行DNA免疫，于每次免疫前、 第6周、末次免疫后兩周采血。表2pJW4303-TcdB_N免疫新西蘭白兔
組別數(shù)量(只)核酸疫苗劑量A5空載體PJW4303200 μ gB4PJW4303-TcdB-N200 μ g如表2，用空載體pJW4303和ρΙ4303- ^(1Β-Ν各免疫一組新西蘭白兔。肌肉注射 200 μ g相應質(zhì)粒，注射后立即于注射部位用WJ-2002活體基因?qū)雰x進行體內(nèi)電轉(zhuǎn)染(針頭插入深度至少2mm，電轉(zhuǎn)染參數(shù)電壓100V，脈沖次數(shù)正反各6次，波寬60ms，頻率60Hz)， 以兔子腿部肌肉發(fā)生抖動視為電轉(zhuǎn)染有效。于第0、2、4、8周進行DNA免疫，于每次免疫前、 第6周、末次免疫后兩周采血。6. 2ELISA檢測血清中iTcdB-N特異性IgG用ELISA方法檢測血清中特異的IgG抗體反應，評價pJW4303-TcdB-N核酸疫苗在 BALB/c小鼠、新西蘭白兔模型中誘導產(chǎn)生體液免疫的能力。l)pJW4303-TcdB-N轉(zhuǎn)染產(chǎn)物作為抗原包被ELISA板(使用PBS pH7. 2-7. 4作為包
10被液，轉(zhuǎn)染上清1 5稀釋，轉(zhuǎn)染裂解1 10稀釋)，每孔100μ1，4 ，過夜。2)棄包被液，用 IXPBST 洗板 5 次(PBST 構(gòu)成為 IOmMPBS 和 0. 05% Tween-20)。3)5% 脫脂奶粉(PBS ,0. 05% Tween-20，5 % 脫脂奶粉)37 °C，封閉 Ih，每孔 200 μ L·4)棄封閉液，用IXPBST洗板5次。5) 一抗為待檢測血清，稀釋度為1 200。每孔加入100μ 1，37°C，孵育Ih (—抗稀釋液乳清蛋白，0. 5% Tween-20, PBS)。6)棄一抗，用IXPBST洗板5次。7) 二抗為HRP標記的羊抗鼠或羊抗兔IgG，稀釋度為1 5000，每孔加入100 μ 1， 37°C，孵育 Ih (二抗稀釋液乳清蛋白，0.5% Tween-20, PBS) 08)棄二抗，用IXPBST洗板5次。9)TMB顯色(TMB溶液配方TMB片劑1片，0. IM磷酸枸櫞酸緩沖液(pH值為 5. 0) 5ml，雙蒸水5ml，30%雙氧水2 μ 1)，每孔加入100 μ 1，室溫，3. 5min，每孔加入50 μ 1 IM的H2SO4終止顯色。10)酶標儀測定并記錄各孔Α450值，計算復孔平均值，以免疫前血清OD值的2. 1 倍作為cut-off值，而且免疫后孔OD值小于0. 05也去除。BALB/c小鼠血清TcdB-N特異性IgG抗體應答時間曲線如圖4所示。在 pJW4303-TcdB-NDNA疫苗免疫后，所有(6只小鼠)免疫血清中均可檢測到TcdB-N特異性 IgG，且隨著免疫次數(shù)的增加，免疫應答強度提高。和預期的一樣，所有7只pJW4303空載體免疫BALB/c小鼠的血清未檢測到TcdB-N特異的抗體應答。新西蘭白兔血清TcdB-N特異性IgG抗體最高滴度如圖6所示。圖中顯示第四次免疫后2周的兔血清中，TcdB-N免疫組有較高滴度的特異性抗體，而PJW4303空載體免疫組則未檢測到抗體應答，兩組相比具有統(tǒng)計學差異(P < 0. 05)。6. 3ffestern blot 檢測血清中 iTcdB-N 特異性 IgGl)pJW4303-TcdB-N轉(zhuǎn)染細胞裂解及上清、pJW4303轉(zhuǎn)染細胞裂解及上清各20μ 1，加入5χ上樣緩沖液5μ 1，100°C，煮沸IOmin。2)制備 15% 的分離膠(7. 5ml 30 % 丙烯酰胺溶液，3. 7ml lMTris/Cl pH8. 8， 150 μ 1 10% SDS,150y 1 10%過硫酸氨，6μ1 TEMED)，灌膠，液面頂端加水，室溫下聚合 20 30min。3)倒棄水，再制備5%的積層膠(960 μ 1 30%丙烯酰胺溶液，740 μ 1 lMTris/Cl PH6. 8,60μ 110% SDS,60y 1 10%過硫酸氨，5 μ 1 TEMED)，在積層膠上插入梳齒，待膠完全凝聚后，拔下梳齒。4)將上述處理好的樣品加入膠孔中進行電泳，先20mA，lh，然后40mA，2h。5) 100V, lh，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。6)轉(zhuǎn)好的膜用5%脫脂奶粉封閉，37°C，lh。7)用IxPBST洗膜兩次。8)將膜浸在1 500稀釋的兔血清(一抗)中，4°C，過夜。9)棄掉血清，用IxPBST洗膜6次，每次間隔lOmin。10)棄掉洗液，加入1 5000稀釋HPR標記的羊抗兔IgG(二抗)，37°C，lh。11)棄掉二抗，用IxPBST洗膜6次，每次間隔lOmin。
12)發(fā)光劑加到膜上，暗室顯影。結(jié)果見圖5 可以在pJW4303-TcdB-N DNA疫苗免疫新西蘭白兔后獲得的血清中檢出特異性抗體，其表觀分子量約為63. 4kDa，而且這些抗體與pJW4303轉(zhuǎn)染的上清、裂解均
無反應。實施例7細胞毒性試驗7. 1從培養(yǎng)上清部分純化毒素1)將艱難梭菌VPI 10463(美國標準生物品收藏中心，ATCC 編號43255TM，下同)接種于bioM6rieux公司的BacT/ ALERT SN 259790培養(yǎng)瓶中(胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，40ml)，37°C，過夜培養(yǎng)。2)取 1)中菌液 Iml 接種于 BacT/ALERT SN 259790 培養(yǎng)瓶，37°C，72h。3)收獲菌液，4°C，6000g，離心 15min。4)取上清，0. 45um濾器過濾。5)以Amicon Mltra-15 Centrifugal Filter Unit with Mltracel-IOOmembrane 對上述過濾液進行超濾濃縮，離心條件為4°C，5000g，30min。濃縮液置于_70°C保存。7. 2細胞毒性試驗DVero, CHO細胞(中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，中國)用含100U/ml青霉素、0. lmg/ml鏈霉素、10%熱滅活胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37°C，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)生長期。2)用2. 5g/L胰酶消化后，以1 X IO4/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37°C ,5% CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)Mh。3)棄去培養(yǎng)基，加入200 μ 1 37°C預熱的PBS洗滌一遍。4)以含100U/ml青霉素、0. lmg/ml鏈霉素、10%熱滅活胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基連續(xù)2倍稀釋7. 1中所獲艱難梭菌培養(yǎng)液超濾濃縮物，每個濃度稀釋液按照100 μ 1/孔、 3個復孔的規(guī)律加入到96孔細胞培養(yǎng)皿中；對照孔加不含毒素的培養(yǎng)基。37°C，5%C02，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)Mh。5)24h后在Nikon ECLIPSE TE2000-S顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。將導致孔內(nèi)細胞全部圓縮化的毒素最低劑量定義為ICTU(cytotoxic unit)。7. 3毒素中和試驗1)準備 Vero、CHO 細胞，步驟同 7. 2 的 1)、2)、3)。2)1 100為起始稀釋度，以含100U/ml青霉素、0. lmg/ml鏈霉素、10%熱滅活胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基連續(xù)兩倍稀釋pJW4303-TcdB-N免疫的兔血清，每個稀釋度的血清100 μ 1與含4CTU毒素量的體積為100 μ 1的艱難梭菌培養(yǎng)液超濾濃縮物稀釋液混合， 37 °C 孵育 Ih。3)將上述混合物加3個復孔內(nèi)，37°C,5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)Mh。4)24h后在Nikon ECLIPSE TE2000-S顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。將3個復孔內(nèi)細胞均無圓縮化的血清最大稀釋度的倒數(shù)定義為中和抗體滴度。結(jié)果見圖7、8。圖7的A圖顯示，在4CTU的毒素劑量下，pJW4303-TcdB-N免疫的兔血清能夠保護Vero細胞而不發(fā)生諸如圓縮化的細胞形態(tài)改變；圖7的B圖顯示， pJW4303-TcdB-N免疫的兔血清在近200倍稀釋時仍能夠中和4CTU劑量的毒素而使Vero細胞不發(fā)生圓縮化。類似的，圖8的A圖顯示，在4CTU的毒素劑量下，pJW4303-TcdB-N免疫的兔血清能夠保護CHO細胞而不發(fā)生諸如圓縮化的細胞形態(tài)改變；圖8的B圖顯示， pJW4303-TcdB-N免疫的兔血清在近150倍稀釋時仍能夠中和4CTU劑量的毒素而使CHO細胞不發(fā)生圓縮化。實施例SBALB/c小鼠被動保護試驗1)取BALB/c小鼠12只，隨機分為4組，按表3劑量腹腔注射艱難梭菌VPI 10463 培養(yǎng)液超濾物稀釋液，組間稀釋之比為10 1，記錄攻毒后14天內(nèi)各組死亡率，找出0%和 100%死亡率的稀釋范圍。表3
組別小鼠(只)稀釋倍數(shù)給藥容量(ml/只)A31 100. 1B31 1000. 1C31 10000. 1D31 100000. 1第14天觀察終點時A、B組小鼠全部死亡，C、D組小鼠未見死亡2)取BALB/c小鼠25只，隨機分為5組，按表4劑量腹腔注射艱難梭菌VPI 10463 培養(yǎng)液超濾物稀釋液，組間稀釋之比為2 1，記錄攻毒后14天內(nèi)各組死亡率，找出0%和 100%死亡率的稀釋范圍。表 4
組別小鼠(只)稀釋倍數(shù)給藥容量(ml/只)A51 1000. 1B51 2000. 1C51 4000. 1D51 8000. 1E51 16000. 1第14天觀察終點時A、B組小鼠全部死亡，余組小鼠未全部死亡。所以，以“艱難梭菌VPI 10463培養(yǎng)液超濾物1 200稀釋溶液0. Iml/只”為攻毒量進行BALB/c小鼠保護試驗。3)取BALB/c小鼠125只，隨機分為5組，按表5腹腔注射艱難梭菌VPI 10463培養(yǎng)液超濾物稀釋溶液(所有“給藥內(nèi)容物”混合后均在37°C孵育Ih)。每天間隔12小時觀察一次，連續(xù)14天，記錄小鼠的死亡情況。艱難梭菌外毒素A核酸疫苗pJW4303-TcdA-C的構(gòu)建方法詳見中國發(fā)明專利申請 201010130904. 8 “密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列及其核酸疫苗”。表 權(quán)利要求
1.一種密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列，序列為SEQ ID NO. 1。
2.—種艱難梭菌外毒素B核酸疫苗，其特征在于該疫苗由權(quán)利要求1所述的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列與真核表達載體組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的艱難梭菌外毒素核酸疫苗，其特征在于所述的真核表達載體為 pJW4303。
4.一種核酸疫苗組合物，其特征在于該組合物包括權(quán)利要求3所述的艱難梭菌外毒素 B核酸疫苗ρΙ4303- ^(1Β-Ν以及艱難梭菌外毒素A核酸疫苗ρΙ4303- ^(1Α-(。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸疫苗組合物，其特征在于所述的艱難梭菌外毒素A核酸疫苗pJW4303-TcdA-C是將經(jīng)密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列插入真核表達載體PJW4303的I3St I和BamHI酶切位點之間所得。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸疫苗組合物，其特征在于所述的經(jīng)密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列為SEQ ID NO. 4。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領域，涉及密碼子優(yōu)化的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列及其核酸疫苗。該密碼子優(yōu)化基因序列兼顧了哺乳動物細胞和大腸桿菌密碼子使用偏好，所涉及的艱難梭菌疫苗由密碼子優(yōu)化的外毒素B氨基端基因序列和真核表達載體pJW4303組成。經(jīng)密碼子優(yōu)化后的艱難梭菌外毒素B氨基端基因序列，不但可以用于構(gòu)建核酸疫苗，在免疫哺乳動物后有效地刺激了宿主的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生了特異的體液免疫反應，而且體內(nèi)、體外模型顯示這些特異性抗體具有良好的保護效應；而且也適用于在大腸桿菌中對其進行蛋白的原核表達，為以后該蛋白的大量獲取奠定了基礎。
文檔編號C12N15/31GK102181457SQ201110067499
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者盧山, 王世霞, 金柯, 黃祖瑚 申請人:盧山, 王世霞, 金柯, 黃祖瑚