專利名稱：與豬免疫性狀相關(guān)的ehmt2基因片段克隆及作為分子標記的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于家畜基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種作為豬標記輔助選擇應(yīng)用的與豬免疫性狀相關(guān)的分子標記的克隆及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，由于各種動物疾病在世界范圍內(nèi)嚴重暴發(fā)，藥物及其有害物質(zhì)殘留影響動物食品安全和環(huán)境，動物抗病遺傳育種越來越受到重視，已成為動物育種的重要目標。而且隨著分子生物學和生物信息學的發(fā)展，使利用分子抗病育種技術(shù)快速有效培育抗病新品種成為可能，為提高動物抗病力開辟了一條新的途徑。分子標記輔助選擇是目前有效的抗 病育種技術(shù)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗病新品種將具有廣泛的應(yīng)用前景。組蛋白是染色質(zhì)的核心，具有重要生物學功能。EHMT2屬于組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶Suv39家族成員，該家族成員含有高度保守的SET同源結(jié)構(gòu)域，是一段由130個氨基酸殘基組成的肽鏈，其N端和C端各自盤曲回旋成不向鄰近的空間構(gòu)象3-4個短的β折疊、ー個短螺旋及幾個環(huán)將這些結(jié)構(gòu)連接起來。絕大多數(shù)SET的C端局部形成一個拓撲學上不尋常的“假結(jié)”樣結(jié)構(gòu)。SET結(jié)構(gòu)域?qū)τ诰S持組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶活性是必需的。ΕΗΜΤ2主要作用與Η3Κ9位賴氨酸的甲基化，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。ΕΗΜΤ2基因由23個外顯子和22內(nèi)含子組成，定位在第7號染色體。組蛋白的尾部こ?；?、磷酸化、甲基化、泛素化等共價修飾組成組蛋白密碼，調(diào)節(jié)許多生物學事件。近年來研究表明組蛋白賴氨酸甲基化在基因表達調(diào)控、X染色體失活、基因組印跡、DNA修補中起到重要作用。Lee(2010)研究敲除EHMT2基因的小鼠，發(fā)現(xiàn)胚胎在發(fā)育早期階段死亡，由于組蛋白H3-K9不能發(fā)生甲基化，從而使小鼠胚胎在發(fā)育早期階段死亡，表明EHMT2在早期胚胎發(fā)育是必需的。目前對EHMT2的研究主要集中與人和鼠類的研究，而在豬上的研究尚未發(fā)現(xiàn)(Lee JS等,Negative regulation ofhypoxic responses via induced Reptin metnylation. Mol Cell,2010,39(I) :71-85)?，F(xiàn)有研究表明性狀相關(guān)SNP標記絕大多數(shù)處在功能基因DNA序列中，陸續(xù)ー些研究篩選出更多與豬遺傳基礎(chǔ)相關(guān)的抗病カ有較好關(guān)聯(lián)的候選基因來，有助于篩選新的分子標記和培育抗病品種。但是目前國內(nèi)外對EHMT2基因的研究主要集中在人和小鼠的生物學功能，對豬EHMT2基因多態(tài)性還沒有報道，迄今為止沒有研究豬EHMT2基因與豬免疫力相關(guān)的分子標記。因此，申請人克隆了與豬免疫カ相關(guān)EHMT2基因的第27內(nèi)含子部分序列，利用該序列進行了多態(tài)性和關(guān)聯(lián)分析，以期得到新的作為豬免疫力相關(guān)的分子標記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克隆與豬免疫力相關(guān)的分子標記，利用該分子標記作為豬標記輔助選擇的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
申請人克隆得到一種作為分子標記應(yīng)用的與豬免疫力相關(guān)的EHMT2基因片段，它的孩 Ρ酸序夕1J如 h 所不ccaagagtcctcattcctaacaagctcctgggcagcgctggggctgtaggtgcagagagcataggagggctcagagccc (a/c) gctgaagatggggacagatg ；(該序列見序列表 SEQ ID NO 2所述。括號內(nèi)堿基突變位置及堿基的替換，下劃線為83位引入一個錯配的堿基t)在所述序列的80bp處有ー個80A-80C的堿基替換，在該序列的第83位引入ー個錯配的堿基k導致PvuII-RFLP多態(tài)性。檢測上述基因片段堿基突變的引物對，其核苷酸序列如下所示正向引物5’-ccaagagtcctcattcctaaca-3’ (見序列表 SEQ ID NO 3)反向引物5' -gcTgaagatggggacagatg-3'(原序列第3位的a錯配成T,以大寫 字母表示，見序列表SEQ ID N0:4所示)申請人:建立一種制備上述分子標記和檢測上述分子標記的方法，該方法的步驟如下從豬品種的耳組織，毛囊，血液中提取總DNA，根據(jù)GenBank公布的豬EHMT2 (GeneBank登錄號EU709015. I)序列為模板設(shè)計引物正向引物5，-gccttcttcagttcacgagac-3>,反冋弓I 物5 ' -tctgggacatcaaaagcaaatat-3>, PCR 擴増，PCR產(chǎn)物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列(序列長度為413bp)，應(yīng)用CRS-PCR-RFLP方法檢測豬EHMT2基因的多態(tài)性，并初步進行該位點與豬繁殖與呼吸綜合征的關(guān)聯(lián)分析。更詳細的技術(shù)方案參見《具體實施方式
》。


序列表SEQ ID N0:1是豬EHMT2基因第27內(nèi)含子的原始序列(序列長度為413bp)，顯示在302bp處存在ー個A 302-C302的等位基因突變。序列表SEQ ID NO 2是利用堿基錯配方法獲得的豬EHMT2基因第27內(nèi)含子的部分核苷酸序列，在80bp處存在ー個A 80-C80的等位基因突變，在該序列的第83位的t為引物中錯配后的堿基。序列表SEQ ID NO 3和4是檢測豬EHMT2基因片段突變的引物對的核苷酸序列。圖I :是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2 :本發(fā)明克隆的豬EHMT2基因第27內(nèi)含子的序列，括號為堿基的突變位點，即A302-C302，序列首尾的陰影區(qū)為引物對。圖3 :本發(fā)明克隆的豬EHMT2基因用于PCR-RFLP檢測A302-C302突變位點的序列，該序列包含在圖2所示的序列中，括號內(nèi)堿基的突變位點A80-C80即圖2中的A302-C302，首尾的陰影區(qū)為設(shè)計的引入酶切位點引物對，下游引物中下劃線T替代原堿基A，創(chuàng)造ー個酶切位點 PvuII (5，CAG/CTG 3，，3，GTC/GAC5，)。圖4 :是本發(fā)明中豬EHMT2基因第27內(nèi)含子序列部分序列擴增的電泳圖譜，片段大小為413bp (瓊脂糖膠濃度為I. 2% )。圖中=Marker泳道為DNA分子量標準。圖5 :是本發(fā)明中豬EHMT2基因用于PCR-RFLP檢測的DNA片段，擴增含有A302-C302突變位點的序列的電泳圖譜，片段大小為IOObp (瓊脂糖膠濃度為I. 2% )。圖中Marker泳道為DNA分子量標準。
圖6 :是豬EHMT2基因測序后發(fā)現(xiàn)的I個突變位點，即A302-C302 (測序圖為反向測序)。圖7 :是本發(fā)明中豬EHMT2基因PCR-PvuII-RFLP的三種基因型(AA，AC和CC)電泳圖譜。
具體實施例方式實施例I :制備實施例一、EHMT2基因部分片段的克隆和突變位點的篩選I.引物設(shè)計利用引物設(shè)計軟件Primer 5.0,以豬EHMT2基因序列(GeneBank登錄號 EU709015. I)為模板設(shè)計出包含第27內(nèi)含子序列的引物，用來擴增“杜長大”(由國外品種“杜洛克”，“長白”和“大白”三個品種雜交得到，是ー種中國普遍推廣應(yīng)用的商用豬)EHMT2基因的第27內(nèi)含子部分序列。引物對的合成由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，該引物對的DNA序列如下正向引物5' -gccttcttcagttcacgagac-3!，反向引物5' -tctgggacatcaaaagcaaatat-31 02. PCR產(chǎn)物的純化和測序(I) PCR 擴增PCR 擴增反應(yīng)體系 20ul，包括 500ng 的 DNA，2. Oul 10XPCR buffer，O. 6ul IOmMdNTP, O. 8ul of each primer (IOuM) and IU Ampli Taq DNA polymerase (上海生エ生物工程技術(shù)公司)。PCR反應(yīng)條件為PCR的反應(yīng)程序為95°C 5min ；94°C 40s, 56. 3°C 30s， 72°C 30s，34個循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴增產(chǎn)物用I. 2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測(見圖4)。(2) PCR產(chǎn)物的純化及測序以5個豬品種(長白，大白，清平，金華，小梅山)的DNA為模板，每個豬品種內(nèi)隨機挑選3個個體用于PCR擴增，回收上述5個豬品種PCR擴增產(chǎn)物，混合測序。利用北京天根生物技術(shù)公司生產(chǎn)的小量DNA片段純化試劑盒進行純化回收，具體方法參照該試劑盒的操作說明書。序列測定由上海生ェ生物工程技術(shù)公司完成。(3) DNA序列同源性檢索鑒定通過NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，將測序后獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的參考序列(登錄號EU709015. I)進行比對，結(jié)果顯示成功克隆得到豬EHMT2基因含第27內(nèi)含子部分序列413bp的片段(見圖2和序列表SEQ ID NO:I)。(4) DNA序列中突變位點的篩選通過NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，將測序后獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的序列(登錄號EU709015. I)進行比對，將5個豬品種的混合測序峰圖導入SeqMan軟件進行比對分析，結(jié)果顯示在豬EHMT2基因第27內(nèi)含子部分序列有I個位點出現(xiàn)明顯的雙峰，這說明該基因在這個位點處發(fā)生了堿基突變(見圖6)。這個位點是A302-C302
ニ、CRS-PCR-RFLP基因型檢測方法的建立I.引入酶切位點引物設(shè)計針對多態(tài)位點A302-C302設(shè)計引入酶切位點引物，用于基因型檢測，其DNA序列分別如下正向引物5，-ccaagagtcctcattcctaaca-3’(見序列表 SEQ ID NO 3)反向引物5' -gcTgaagatggggacagatg-3'(原序列的第3位的堿基a錯配成堿基T，突變位置見下劃線所示，見序列表SEQ ID NO 4)2. PCR 擴增20uL 的反應(yīng)體系中加入 DNA模板 I μ L，雙蒸水 14.3 μ L，10 X PCR buffer 2. O μ L,
Taq酶1U。PCR反應(yīng)條件為94°C預變性5min后，94で變性408、56.3で退火308、72で延伸308，34個循環(huán)，最后72で延伸lOmin。3μ L PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖5)，陽性樣品用于下ー步酶切檢測。3. RFLP 檢測(I)PvuII-RFLP 檢測分子標記 A302_C302將PCR產(chǎn)物8 μ L，10XBuffer I μ L，限制性內(nèi)切酶PvuII為4U，加雙蒸水補至10μ L，將樣品混勻后離心，37°C培養(yǎng)箱放置12h，酶切產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分型，銀染并拍照。分子標記基因型分析如圖7所示，分別代表A302-C302處SNP 3種不同的基因型(基因型用其突變堿基表示)AA、AC、CC，電泳結(jié)果顯示CC基因型(只有一條帯，長度為IOObp)、AA基因型(一條帶，長度為81bp)和AC基因型(2條帶，長度為100bp/81bp)。(2)聚丙烯酰胺凝膠的制備及RFLP的電泳檢測a. 8%聚丙烯酰胺凝膠的制備(見表I)表I聚丙烯酰胺凝膠的成分
權(quán)利要求
1.一種與豬免疫力相關(guān)的EHMT2基因片段，它的核苷酸序列如下所示 ccaagagtcctcattcctaacaagctcctgggcagcgctggggctgtaggtgcagagagcataggagggctcagagccc (a/c)gctgaagatggggacagatg ； 在所述序列的80bp處有一個80A-80C的堿基替換，導致PvuII-RFLP多態(tài)性。
2.擴增權(quán)利要求I所述基因片段的引物對，其核苷酸序列如序列表SEQID N0:3和4所示。
3.權(quán)利要求I所述的基因片段在豬分子標記輔助選擇中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的引物對在豬分子標記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于家畜分子標記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作為豬標記輔助選擇應(yīng)用的與豬免疫力相關(guān)的分子標記的制備與應(yīng)用。所述的分子標記由豬EHMT2基因克隆得到，它的基因序列如序列表SEQ ID NO1所示。序列表SEQ ID NO1的第302bp處有一個A302-C302的堿基突變。本發(fā)明還公開了擴增EHMT2基因第27內(nèi)含子序列所用的引物以及用于A302-C302分子標記的檢測方法。本發(fā)明為豬的標記輔助選擇提供了1個新的分子標記。
文檔編號C12Q1/68GK102690827SQ20111006752
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者任鈺為, 劉向東, 劉文舉, 周傲, 宋利軍, 張楊, 張淑君, 楊利國, 江一波, 滑國華, 熊家軍, 童勤, 趙書紅 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學