專利名稱：與豬免疫性狀相關(guān)的cxcl12基因片段克隆及作為分子標(biāo)記的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于家畜基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與豬免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的克隆及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，豬的疾病大規(guī)模爆發(fā)已經(jīng)成為困擾養(yǎng)豬業(yè)的重大難題，傳統(tǒng)的治療方法無法有效地解決問題，而且藥物及其有害物質(zhì)殘留影響動(dòng)物食品安全和環(huán)境，因此動(dòng)物抗病遺傳育種越來越受到重視。利用分子抗病育種技術(shù)快速有效培育抗病新品種成為可能，也是目前有效的抗病育種技術(shù)。CXCL12 又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 I (stromal cell derivedfactor-1, SDF-1)或前B細(xì)胞刺激因子(pre-Bcell stimulatory factor，PBSF)。CXCL12最初被認(rèn)為是B系祖細(xì)胞的生長因子，是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。與其它趨化因子產(chǎn)生不同，CXCL12由基質(zhì)細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生，為持續(xù)表達(dá)性趨化因子，其它趨化因子由炎癥誘導(dǎo)產(chǎn)生的(李彩霞，SDF-1/CXCR4的研究進(jìn)展.國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè)，2003,25 ) :367-369.),無病原侵入時(shí)體內(nèi)就有穩(wěn)定表達(dá)，只是表達(dá)量較低。豬的CXCL12基因定位在第14號(hào)染色體上，DNA全長15057bp，mRNA全長446bp,有4個(gè)外顯子。趨化因子是ー類控制細(xì)胞定向遷移的細(xì)胞因子，其功能行使由趨化因子受體介導(dǎo)，趨化因子與其受體的相互作用控制著各種免疫細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)和組織器官間定向遷移，使之到達(dá)感染、創(chuàng)傷和異常増殖部位，執(zhí)行清除感染源、炎癥反應(yīng)、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和消滅異常增殖細(xì)胞、維持組織細(xì)胞平衡的功能。并且在細(xì)胞及器官的發(fā)育、腫瘤的形成及其轉(zhuǎn)移、移植免疫排斥等方面都起著重要的作用(Cascieri MA, Springer MS. The chemokine/chemokine—receptor family potential and progress for therapeutic intervention.Curr Opin Chem Bio,2000,4 (4) :420-427. ；Yoshie 0, Imai T, Nomiyama H. Chemokinesin immunity. Adv Immunol, 2001, 78 :57-110.)。如果趨化因子及其受體的表達(dá)和功能異常，將導(dǎo)致免疫細(xì)胞不能在正確的位置行使正確的功能，從而會(huì)給機(jī)體帶來損傷，造成疾病的發(fā)生，因此以趨化因子及其受體分子為控制靶點(diǎn)，通過激活或拮抗趨化因子受體的信號(hào)傳導(dǎo)來調(diào)控趨化因子系統(tǒng)的功能，可望用于控制和治療相關(guān)疾病。CXCL12基因主要有以下4個(gè)方面的功能(I)對(duì)免疫細(xì)胞的趨化作用趨化因子的基本功能就是對(duì)表達(dá)有相應(yīng)趨化因子受體的細(xì)胞的定向趨化作用。表達(dá)相應(yīng)趨化因子受體的免疫細(xì)胞在滾動(dòng)前行中由干與血管內(nèi)皮上趨化因子作用而促使免疫細(xì)胞整合素的上調(diào)，整合素與內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附分子的相互作用導(dǎo)致免疫細(xì)胞不可逆地黏附到血管內(nèi)皮表面。(2)調(diào)節(jié)血細(xì)胞發(fā)育可以調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和血細(xì)胞前體的増殖，CXCL12能促進(jìn)人外周血⑶34+前體細(xì)胞的增通(Lataillade JJ 等· Chemokine SDF-I enhances circulating CD34+cellproliferation in synergy with cytokines possible role in progenitor survival.Blood, 2000,95 (3) :756-768.)，增強(qiáng)人骨髓、脊柱血及小鼠脊柱中造血干細(xì)胞的生存和抗凋亡能力，增強(qiáng)體外長期培養(yǎng)小鼠造血干細(xì)胞的植入能力(Broxmeyer HE等· Stromalcell-derived Iactor-IZCKuLlS directly enhances survival/antiapoptosis οιmyeloid progenitor cells through CXCR4 and G(alpha)i proteins and enhancesengraftment of competitive, repopulating stem cells. Leukoc Biol,2003,73 (5)630-638.);可以加強(qiáng)小鼠胚胎干細(xì)胞的存活和趨化運(yùn)動(dòng)，并可以促進(jìn)造血祖細(xì)胞的生成(Guo Y等· Stem Cells，2005，23 :1324-1332.)。(3)參與胚胎期器官的發(fā)育CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸可能參與器官發(fā)育等一系列重要的生理和病理過程，在CXCL12或CXCR4基因敲除的小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，有半數(shù)胚胎死于腹中，出生的也均在一小 時(shí)內(nèi)死亡，表現(xiàn)為造血障礙、血管形成異常、心臟膜性室間隔缺損、小腦神經(jīng)元分布異常等(Horuk R. Chemokines beyond inflammation. Nature,1998,393(6685) :524-525.)。(4)在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程的趨化作用趨化因子在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中表現(xiàn)出雙向的作用。一方面則可以通過抑制血管生成、趨化免疫活性細(xì)胞來抵抗腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移；另一方面，趨化因子能通過刺激腫瘤細(xì)胞生長，趨化腫瘤細(xì)胞以及促進(jìn)血管生長和消化細(xì)胞外基質(zhì)的間接作用促進(jìn)腫瘤的的生長和轉(zhuǎn)移。鑒于CXCL12基因在免疫調(diào)節(jié)過程中的重要作用，因此以趨化因子及其受體基因?yàn)榘谢?，調(diào)控其功能，從而達(dá)到有效控制疾病的目的。并且借助分子標(biāo)記輔助選擇，篩選CXCL12基因潛在的與免疫功能相關(guān)分子標(biāo)記，為抗病育種提供參考。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克隆與豬免疫力相關(guān)的分子標(biāo)記，利用該分子標(biāo)記作為豬標(biāo)記輔助選擇的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
申請(qǐng)人克隆得到一種與豬免疫力相關(guān)的CXCL12基因片段，它的核苷酸序列如下所示AAGGGTCATTTTCCAAGTAATCGAAGATATTTTAAAATCTCAAGGAAAATTTGAAAGCATCTTCCCCTGGAACCCATGAACCAGAGCCATTCAACCTCTTTCTCCAGTTAAATTCACAGGGCCCTAAATCTTGACCACAATTAAGGAAAGAATAATTTCTGTTTCTCCCCCTAGGGGGAAAATAGATAAAAGGA(G/C)AGACTGCAGTGAAAATGATT ;(該序列見序列表SEQ ID N0:2所述。括號(hào)內(nèi)堿基突變位置及堿基的替換，下劃線為197位引入一個(gè)錯(cuò)配的堿基G)在該序列第195bp處有I個(gè)G195-C195的堿基替換，導(dǎo)致BsmAI-RFLP多態(tài)性。申請(qǐng)人:設(shè)計(jì)了ー種檢測(cè)上述基因片段堿基突變的引物對(duì)，其核苷酸序列如下所示正向引物5’-AAGGGTCATTTTCCAAGTA-3’ (見序列表 SEQ ID NO 3)反向引物5’ -AgACTGCAGTGAAAATGATT-3’(第2位，由原A錯(cuò)配成現(xiàn)在的g，見序列表 SEQ ID NO 4)
申請(qǐng)人建立一種制備上述分子標(biāo)記和檢測(cè)上述分子標(biāo)記的方法，該方法的步驟如下從豬品種耳組織、毛囊、血液中提取總DNA，根據(jù)GenBank公布的豬CXCL12 (GeneBank登錄號(hào)AK237304. I)序列為模板設(shè)計(jì)引物(正向引物5’ -CAGTGGAAGGGTCATTTTCC-3 ’，反向弓丨物5’ -ATTAGGGGTCACCCAGCTCT-3’)，PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化和克隆測(cè)序，獲得如序列表SEQ ID N0:1和附圖2所示的核苷酸序列，應(yīng)用CRS-PGR-RFLP方法檢測(cè)豬CXCL12基因的多態(tài)性。更詳細(xì)的技術(shù)方案參見《具體實(shí)施方式
》。


SEQ ID NO : I是本發(fā)明作為分子標(biāo)記的豬CXCL12基因片段，序列長度為387bp (該序列與附圖2的序列相同)。
SEQ ID NO :2是檢測(cè)CXCL12基因片段堿基突變的核苷酸序列，序列長度為215bp (該序列與附圖4的序列相同)。SEQ ID NO 3和4是擴(kuò)增基因片段堿基突變引物對(duì)的核苷酸序列。圖I :是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2 :本發(fā)明克隆的作為分子標(biāo)記的豬CXCL12基因部分核苷酸序列，括號(hào)為堿基的突變位點(diǎn)，即G201-C201，序列首尾的陰影區(qū)為引物。圖3 :是本發(fā)明中豬CXCL12基因部分序列擴(kuò)增的電泳圖譜，片段大小為387bp (瓊脂糖膠濃度為I. 2% )。圖中=Marker泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖4 :是本發(fā)明中豬CXCL12基因部分序列，該序列包含在圖2所不的序列中，括號(hào)內(nèi)堿基的突變位點(diǎn)G195-C195即圖2的G201-C201，首尾的陰影區(qū)為設(shè)計(jì)的引入酶切位點(diǎn)引物對(duì)，特別說明的是在該序列的下游引物中方框表示了 G將替代原堿基A(在原堿基A的位置引入錯(cuò)配的堿基G)，創(chuàng)造ー個(gè)酶切位點(diǎn)，導(dǎo)致該突變位點(diǎn)可被BsmAI (5’ GTCTCN/3’，3’ CAGAG (N) 5/5’ )識(shí)別。圖5 :是本發(fā)明中豬CXCL12基因部分序列擴(kuò)增的電泳圖譜，片段大小為215bp(瓊脂糖膠濃度為I. 2% )。圖中=Marker泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖6 :是豬CXCL12基因測(cè)序后發(fā)現(xiàn)的G201-C201突變位點(diǎn)(測(cè)序圖為反向測(cè)序)。圖7 :是本發(fā)明中豬CXCL12基因PCR-BsmAI-RFLP的三種基因型(CC，CG和GG)電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :一、CXCL12基因部分片段的克隆和突變位點(diǎn)的篩選I.引物設(shè)計(jì)利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0,以豬CXCL12基因(GeneBank登錄號(hào)AK237304. I)為模板設(shè)計(jì)出包含部分序列的擴(kuò)增引物，用來擴(kuò)增“杜長大”(由國外品種“杜洛克”，“長白”和“大白”三個(gè)品種雜交得到，是ー種中國普遍推廣應(yīng)用的商用豬)CXCL12基因的部分序列。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物對(duì)的DNA序列如下正向引物5’ -CAGTGGAAGGGTCATTTTCC-3 ’，
反向引物5’ -ATTAGGGGTCACCCAGCTCT-3 ’。2. PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序(I) PCR 擴(kuò)增PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系 20ul，包括 500ng 的 DNA，2. Oul 10XPCR buffer，O. 6ul IOmMdNTP, O. 8ul of each primer (IOuM) and IU Ampli Taq DNA polymerase (上海生エ生物工程技術(shù)公司)。PCR反應(yīng)條件為PCR的反應(yīng)程序?yàn)?5°C 5min ；94°C 40s, 56. 3°C 30s，72°C 30s，34個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物用I. 2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)(見圖3)。(2) PCR產(chǎn)物的純化及測(cè)序以5個(gè)豬品種(長白，大白，清平，金華，小梅山)的DNA為模板，每個(gè)品種內(nèi)隨機(jī) 挑選3個(gè)個(gè)體用于PCR擴(kuò)增，回收豬5個(gè)品種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，混合測(cè)序。利用北京天根生物技術(shù)公司生產(chǎn)的小量DNA片段純化試劑盒進(jìn)行純化回收，具體方法參考該試劑盒的操作說明書。序列測(cè)定由上海生ェ生物工程技術(shù)公司完成。(3) DNA序列同源性檢索鑒定通過NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，將測(cè)序后獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的參考序列(登錄號(hào)AK237304. I)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示成功克隆得到豬CXCL12基因部分序列387bp的片段(見圖2和序列表SEQ ID NO :1)。(4) DNA序列中突變位點(diǎn)的篩選通過NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，將測(cè)序后獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的序列(登錄號(hào)AK237304. I)進(jìn)行比對(duì)，將5個(gè)豬品種的混合測(cè)序峰圖導(dǎo)入SeqMan軟件進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示在豬CXCL12基因部分序列I個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)明顯的雙峰，這說明該基因在這個(gè)位點(diǎn)處發(fā)生了堿基突變(見圖6)。這個(gè)突變位點(diǎn)是G201-C201 (見序列表 SEQ ID NO :1 和圖 2)。ニ、CRS-PCR-RFLP基因型檢測(cè)方法的建立I.引物設(shè)計(jì)針對(duì)多態(tài)位點(diǎn)G201-C201引入酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)了ー對(duì)引物，用于基因型檢測(cè)，其核苷酸序列序列分別如下所示(與序列表SEQ ID NO :3和4所示的序列相同)正向引物5’-AAGGGTCATTTTCCAAGTA-3’ (見序列表 SEQ ID NO 3)反向引物5’ -AgACTGCAGTGAAAATGATT-3” (將該引物序列的第2位的原堿基A錯(cuò)配成g，見序列表SEQ ID NO 4)2. PCR 擴(kuò)增20uL 的反應(yīng)體系中加入 DNA模板 I μ L，雙蒸水 14.3 μ L，10 X PCR buffer 2. O μ L,IOmMdNTP 0. 6 μ L, IOuM 引物各 0. 8 μ L，Taq 酶 1U。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min 后，94°C變性 40s、56. 3°C退火 30s、72°C延伸 308，34個(gè)循環(huán)，最后72で延伸 lOmin。3μ L PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(見圖5)，陽性樣品用于下ー步酶切檢測(cè)。3. RFLP 檢測(cè)BsmAI-RFLP 檢測(cè)分子標(biāo)記 G201-C201將PCR產(chǎn)物8 μ L，10XBuffer I μ L，限制性內(nèi)切酶BsmAI為4U，加雙蒸水補(bǔ)至10μ L，將樣品混勻后離心，37°C培養(yǎng)箱放置12h，酶切產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)分型，銀染并拍照。分子標(biāo)記基因型分析如圖7所示，分別代表G201-C201處單核苷酸多態(tài)性(SNP) 3種不同的基因型(基因型用其突變堿基表示)GG、CC、GC，電泳結(jié)果顯示CC基因型(只有一條帶，長度為215bp)、GG基因型(有兩條帶，長度為190bp和26bp)和CG基因型(有 3 條帶，長度為 215bp/190bp/26bp)。聚丙烯酰胺凝膠的制備及RFLP的電泳檢測(cè)a. 8 %聚丙烯酰胺凝膠的制備
表I 8%聚丙烯酰胺凝膠的制備
_雙蒸水—__ — 18.5 ml
30%丙烯酰胺(29: I)9. 3 ml5XTBE 緩沖液7 ml
10%AP 溶液 0.23 ml _ TEMED _O. 02 ml __,B體積 _35 ml_b.灌膠沿著玻璃板邊緣緩慢灌入丙烯酰胺膠液，注意避免氣泡產(chǎn)生，當(dāng)灌至離玻璃板上沿O. Icm時(shí)停止灌膠，插入梳子，傾斜膠板與平面成30度夾角，于室溫聚合I小吋。c.上樣、電泳凝膠聚合后拔掉梳子，用注射器吸取IXTBE緩沖液沖洗加樣孔。組裝好電泳設(shè)備，用O. 8%的瓊脂糖膠封閉好玻璃板與電泳槽之間的縫隙，防止電泳緩沖液滲漏。向上下緩沖槽中倒入足量的IXTBE電泳緩沖液。用50 μ I的微量進(jìn)樣器將酶切產(chǎn)物緩緩注入梳孔。上樣完畢后開啟電泳儀電源，在100V恒壓下電泳4小時(shí)。d.凝膠染色①電泳完畢，取下玻璃板，小心地將凝膠從玻璃板上剝離下來，放入雙蒸水中漂洗一次;②浸入10%こ醇溶液固定lOmin。固定完畢，用雙蒸水短暫洗滌凝膠(換水兩次， 次 30s)；③用I %硝酸脫色3min，然后用雙蒸水迅速漂洗一次；④浸入O. 2%硝酸銀，避光，放在搖床上染15 25min ；⑤去離子水洗膠三遍，姆次Imin,加入3% Na2CO3M色,當(dāng)顯色合適時(shí)倒掉Na2CO3,迅速加入3%冰醋酸停止顯色；⑥將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)暗箱內(nèi)，進(jìn)行掃描并保存電泳圖譜。實(shí)施例2 CXCL12分子標(biāo)記分型方法在免疫性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用試驗(yàn)共檢測(cè)了 437頭“杜長大”豬個(gè)體的多態(tài)性，包括健康豬177頭，康復(fù)豬131頭，嚴(yán)重發(fā)病豬113頭，死亡豬16頭。用CRS-PCR-RFLP方法確定其基因型，并進(jìn)行基因突變位點(diǎn)與豬繁殖與呼吸綜合征的關(guān)聯(lián)分析。應(yīng)用SAS軟件的Logistic回歸模型分析方法，設(shè)定ー個(gè)基因型的OR值(0R值的全稱是odd ratio，又稱比值比，對(duì)于發(fā)病率很低的疾病來說，它的OR值即是相對(duì)危險(xiǎn)度的精確估計(jì)值)為參考值(OR= 1)，計(jì)算另外2種基因型的OR值，如果OR值大于1，且P值小于O. 05，則此基因型可能是ー個(gè)危險(xiǎn)因子，即豬群中攜帶此基因型的個(gè)體容易感染豬繁殖與呼吸綜合征；反之，如果OR值小于1，且P值小于O. 05，則此基因型可能是保護(hù)因子，即豬群中攜帶此基因型的個(gè)體對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征有抵抗力。95% Cl表示OR值的95%置信區(qū)間(Andrew M. Smith MDΦ, Environmental Tobacco Smoke and Interleukin 4 Polymorphism(C-589T)Gene Environment Interaction Increases Risk of Wheezing in African-American Infants.The Journal of Pediatrics,2008,152(5) :709-715 ;Yen-Li Lo 等，ATM polymorphismsand risk of lung cancer among never smokers. Lung Cancer,2010,69(148-154))。(一)基因型檢測(cè)結(jié)果表明在437個(gè)個(gè)體中GG基因型有183個(gè)個(gè)體，GC基因型有200個(gè)個(gè)體，CC基因型有54個(gè)個(gè)體。等位基因G與等位基因C在各個(gè)群體中的分布情況見表2，通過觀察可以看出在“杜長大”中，G等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。表2 CXCL12基因的SNP在群體中基因型頻率和基因頻率分布 群體樣本含量基因型頻率(頻率/樣本數(shù))基因頻率
權(quán)利要求
1.一種與豬免疫力相關(guān)的CXCL12基因片段，它的核苷酸序列如下所示 AAGGGTCATTTTCCAAGTAATCGAAGATATTTTAAAATCTCAAGGAAAATTTGAAAGCATCTTCCCCTGGAACCCATGAACCAGAGCCATTCAACCTCTTTCTCCAGTTAAATTCACAGGGCCCTAAATCTTGACCACAATTAAGGAAAGAATAATTTCTGTTTCTCCCCCTAGGGGGAAAATAGATAAAAGGA (G/C)AGACTGCAGTGAAAATGATT ； 在該序列第195bp處有I個(gè)G195-C195的堿基替換，導(dǎo)致BsmAI-RFLP多態(tài)性。
2.擴(kuò)增權(quán)利要求I所述基因片段的引物對(duì)，其核苷酸序列如序列表SEQID N0:3和4所示。
3.權(quán)利要求I所述的基因片段在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的引物對(duì)在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與豬免疫力相關(guān)的分子標(biāo)記的制備與應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記由豬CXCL12基因克隆得到，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所示，在該序列第195bp處有1個(gè)G195-C195的堿基替換，導(dǎo)致BsmAI-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明為豬的標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)新的分子標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102690828SQ201110067529
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者任鈺為, 劉文舉, 劉耘, 宋利軍, 張淑君, 張瀅寅, 李翔, 楊利國, 梁愛心, 江一波, 童勤, 賈啟濤 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)