專利名稱：單純皰疹病毒實時熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應(yīng)) 試劑盒，尤其涉及一種單純皰疹病毒實時熒光定量PCR試劑盒。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)是屬于皰疹病毒科a病毒亞科的線 性雙鏈DNA病毒。HSV能引起人類多種疾病，如齦口炎(gingivostomatitis)、角膜結(jié)膜炎 (keratoconjunctivitis)、腦炎(encephalitis)以及生殖系統(tǒng)感染和新生兒的感染。在感 染宿主后，常在神經(jīng)細胞中建立潛伏感染，激活后又會出現(xiàn)無癥狀的排毒，在人群中維持傳 播鏈，周而復始地循環(huán)。根據(jù)抗原性的差別目前把該病毒分為1型和2型。1型主要由口唇 病灶獲得，2型可從生殖器病灶分離到。人群被病毒感染發(fā)生后四個月到數(shù)年被感染的人數(shù) 可達人口總數(shù)的50-90%，是最易侵犯人的一種病毒，但在臨床僅有一部份發(fā)病。此病可分 為口唇性皰疹、皰疹性角膜炎、皰疹性皮膚炎、陰部皰疹和卡波西病等。當前，病毒的分離培養(yǎng)是當今臨床上診斷皰疹病毒感染的可靠依據(jù)?？刹杉つw、 腦脊液、角膜刮取物、唾液等標本，接種人二倍體成纖維細胞株WI38及其它傳代細胞株如 Vero、BHK等，經(jīng)M 48小時后，細胞則出現(xiàn)腫脹、變圓、細胞融合等病變。然后用HSV-I和 HSV-2的單克隆抗體作免疫熒光染色鑒定或應(yīng)用DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析來定型。常用 于抗體檢測的方法有補體結(jié)合試驗、中和試驗、免疫熒光及酶聯(lián)免疫吸附試驗等，臨床多用 于急性感染診斷和器官移植患者的檢測，以及流行性病學調(diào)查。如用于急性感染診斷，應(yīng)采 取急性期和恢復期雙份血清，同時檢測血清中的IgG和IgM。上述兩種方法對HSV的檢測在 一定程度上是有效的；但是它們也有不足的地方如病毒的分離培養(yǎng)，是需要耗費大量的 人力、物力和時間；抗原抗體檢測對一些臨床樣本缺乏足夠的靈敏度，有時不能判定出一些 正常個體中HSV的潛伏感染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，提供一種單純皰疹病毒實 時熒光定量PCR試劑盒。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的1、單純皰疹病毒實時熒光定量PCR試劑盒(簡稱試劑盒)本試劑盒是在對單純皰疹病毒核酸序列分析的基礎(chǔ)上，選取保守基因序列設(shè)計出 一對特異性引物和一條特異性的熒光探針，利用實時熒光定量PCR技術(shù)對單純皰疹病毒進 行檢測。此技術(shù)不僅縮短了操作時間，減少了污染，也降低了樣品診斷的成本，具有潛在的 應(yīng)用價值。在按下述方法設(shè)計的引物和探針存在下，在熒光定量PCR儀中，對病毒核酸進行 PCR擴增，來實現(xiàn)對單純皰疹病毒的檢測。具體地說，本試劑盒包括單純皰疹病毒的一對特異性引物(F和R)、一條特異性熒光探針(FP)、陽性對照、陰性對照、5XPCR Buffer和Enzyme Mix ；①單純皰疹病毒的一對特異性引物(F和R)F5 ’ -ACTCGAGTGCGAAAAGACGTTCT-3’ 23bpR:5， -GTATCGTCGTAAAACAGCAGGTC-3， 23bp ；②單純皰疹病毒的一條特異性熒光探針(FP)FP FAM-AAAGGGCGTGGATCTGGTGCGT-BHQ-12 2bp,熒光探針5’端標記熒光報告基團FAM，3’端標記熒光淬滅基團BHQ ；③陽性對照單純皰疹病毒標準品；④陰性對照RNase Free H2O ；⑤5 X PCR Buffer 配制
Tris · Cl20mM
KCl80mM
(NH4) 2S0480mM
DTT1. 5mM
MgCl212mM
dNTPIOmM配置混合后于冰箱-20°C保存；⑥ Enzyme Mix 配制
Tris · Cl20mMKCl80mMDTTImMEDTA0.ImMNonidet P-400.5%Tween 200.5%甘油50%iTaq 酶2,.5U/配置混合后于冰箱_20°C保存。2、本試劑盒的使用方法①病毒核酸的提取A、首先在緩沖液1、2中加入無水乙醇，分別加入25ml和30ml無水乙醇；在漂洗液 中力口入 30 μ g/ml carrier RNA ；B、取30 μ 1蛋白酶放入1. 5ml離心管中；
C、將標本(如痰液等)取200 μ 1加入此管中，充分混勻；D、再在每管分別加入200 μ 1漂洗液(含30 μ g/ml carrier RNA)，混勻振蕩30s， 70°C溫育 IOmin ；E、加入250 μ 1無水乙醇，充分混勻振蕩30s，室溫裂解5min ；F、將上述裂解液加入離心柱中，SOOOrpm，離心lmin，棄收集管中的離心液。濾柱仍 放回收集管上，將步驟③剩余的混合液全部吸入濾柱中，離心后棄離心液；G、濾柱中加入500 μ 1緩沖液1，12000rpm，離心lmin，棄收集管中的離心液；H、另取一支干凈的2ml收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于濾柱中加 Λ 500 μ 1緩沖液2，12000rpm,離心lmin,重復步驟⑧一次；I、將濾柱移到一個干凈的收集管中，12000rpm,離心!Bmin，后將濾柱放在 370C 15min以干燥濾膜；J、將濾柱放在1. 5ml Eppendorf管上，向濾柱中加入50ulRNase_free H2O,室溫靜 置anin。12000rpm，離心2min，收集離心液即為提取的核酸。②實時熒光定量PCR擴增(每份25ul體系)取5ul病毒核酸作為模板，同時加入20ul實時熒光定量PCR反應(yīng)液至八聯(lián)管中進 行熒光定量PCR擴增。A、實時熒光定量PCR反應(yīng)液(mix)的配制
5xPCR buffer8ul
Enzyme Mix5ul
特異性引物F/R各Iul
特異性熒光探針FP 2ul Rnase Free H2O_3ul_
反應(yīng)液體積20ulB、一步實時熒光定量PCR反應(yīng)程序①95°C2min(2) 95°C15s(3) 65°C30s(4) 58 °Clmin⑤ Go to ②，45cycles步驟③從65 °C開始開始熒光檢測。C、檢測儀器本發(fā)明使用LightCycle 480II熒光定量PCR儀，在FAM通道進行檢測。D、結(jié)果判斷在熒光定量PCR儀運轉(zhuǎn)正常，陰性對照和陽性對照均正常的情況下，(1)當Ct彡35時，判斷樣品為HSV陽性；(2)當35 < Ct <40時，重復一次實驗，如果Ct還是在此范圍之內(nèi)或小于35就判 斷樣品為HSV陽性，否則判斷樣品為HSV陰性。(3)當Ct > 40時，判斷樣品為HSV陰性。
本發(fā)明具有下列優(yōu)點和積極效果①檢測時間周期短、檢測效率高；②檢測病毒特異性高，準確率高；③在進行病毒定性分析的同時還能進行病毒定量分析；
④檢測靈敏度比普通PCR和免疫學檢測方法靈敏度高；⑤操作簡單、易于推廣；⑥實驗結(jié)果重復性好。


圖1是HSV病毒標準品擴增曲線；圖2是HSV病毒標準品濃度標準曲線；圖3是4例HSV陽性標本擴增曲線；圖4是5例HSV陽性標本擴增曲線。
具體實施例方式1、實施例1-—單純皰疹病毒實時熒光定量PCR試劑盒取已知道濃度的HSV-I病毒標準品進行濃度梯度稀釋，得到6 X 107，6 X 106， 6 X IO5,6 X IO4,6 X IO3,6 X IO2,6 X IO1Copies/μ 1 這 7 個濃度梯度的標準品，各取 200 μ 1 提取病毒核酸；同時檢測疑似單純皰疹病毒感染病人皰疹液標本15份，將標本液用PBS進 行前處理后取200 μ 1進行病毒核酸提取，提取的HSV-I標準品與標本同時進行病熒光定量 PCR檢測。1)試劑盒的組成一對特異性引物F/R、一條特異性熒光探針FP、HSV型陽性對照、RNase FreeH2O陰 性對照、5XPCR Buffer, Enzyme Mix。2)HSV的特異性擴增基因序列設(shè)計引物為一對特異性引物為F:5， -ACTCGAGTGCGAAAAGACGTTCT-3， 2 3bpR :5，-GTATCGTCGTAAAACAGCAGGTC-3，2 3bp一條特異性探針為
FP FAM-AAAGGGCGTGGATCTGGTGCGT-BHQ-1 22bp。3) 5 X PCR Buffer 配制
Tris · Cl20mM
KCl80mM
(NH4) 2S0480mM
DTT1. 5mM
MgCl212mM
dNTPIOmM
配置混合后于冰箱-20 V保存。4) Enzyme Mix 配制
Tris · Cl20mMKCl80mMDTTImMEDTA0. ImMNonidet P-400. 5%Tween 200. 5%甘油50%iTaq 酶2. 5U/ul配置混合后于冰箱-20 V保存。5)病毒核酸的提?、偈紫仍诰彌_液1、2中加入無水乙醇，分別加入25ml和30ml無水乙醇；在漂洗液 中力口入 30 μ g/ml carrier RNA ；②取30 μ 1蛋白酶放入1. 5ml離心管中；③將標本(如鼻/咽拭子、液化的痰液、胸水、灌洗液等)取200 μ 1加入此管中， 充分混勻；④再在每管分別加入200 μ 1漂洗液(含30 μ g/ml carrier RNA)，混勻振蕩30s， 70°C溫育 IOmin ；⑤加入250 μ 1無水乙醇，充分混勻振蕩30s，室溫裂解5min ；⑥將上述裂解液加入離心柱中，8000rpm，離心lmin，棄收集管中的離心液；濾柱 仍放回收集管上，將步驟③剩余的混合液全部吸入濾柱中，離心后棄離心液；⑦濾柱中加入500 μ 1緩沖液1，12000rpm，離心lmin，棄收集管中的離心液；⑧另取一支干凈的2ml收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于濾柱中加 入500 μ 1緩沖液2，12000rpm,離心lmin。重復步驟⑧一次；⑨將濾柱移到一個干凈的收集管中，12000rpm,離心!Bmin，后將濾柱放在 370C 15min以干燥濾膜；⑩將濾柱放在1. 5ml Eppendorf管上，向濾柱中加入50ulRNase_free H2O,室溫靜 置aiiin ； 12000rpm，離心2min，收集離心液即為提取的核酸；6)實時熒光定量PCR擴增(每份25ul體系)取5ul DNA作為模板，同時加入20ul PCR反應(yīng)液至八聯(lián)管中進行熒光定量PCR擴
+曰Oa)熒光定量PCR反應(yīng)液的配制
權(quán)利要求
1. 一種單純皰疹病毒實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于 本試劑盒包括單純皰疹病毒的一對特異性引物、一條特異性熒光探針、陽性對照、陰性 對照、5XPCR Buffer 禾口 Enzyme Mix ；①單純皰疹病毒的一對特異性引物F :5’ -ACTCGAGTGCGAAAAGACGTTCT-3’， R :5’ -GTATCGTCGTAAAACAGCAGGTC-3’ ；②單純皰疹病毒的一條特異性熒光探針 FP FAM-AAAGGGCGTGGATCTGGTGCGT-BHQ-1，熒光探針5’端標記熒光報告基團FAM，3’端標記熒光淬滅基團BHQ ；③陽性對照單純皰疹病毒標準品；④陰性對照 RNase Free H2O ；⑤5XPCR Buffer 配制Tris · Cl20mMKCl80mM(NH4) 2S0480mMDTT1. 5mMMgCl212mMdNTPIOmM 配置混合后于冰箱-20°C保存；⑥Enzyme Mix 配制Tris · Cl20mMKCl80mMDTTImMEDTA0. ImMNonidet P-400. 5%Tween 200. 5%甘油50%Taq 酶2.5U/ul配置混合后于冰箱-20°C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單純皰疹病毒實時熒光定量PCR試劑盒，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的PCR試劑盒。本試劑盒包括單純皰疹病毒的一對特異性引物、一條特異性熒光探針、陽性對照、陰性對照、5xPCRBuffer和EnzymeMix；設(shè)計特異性引物F5'-ACTCGAGTGCGAAAAGACGTTCT-3'；R5'-GTATCGTCGTAAAACAGCAGGTC-3'；設(shè)計探針FPFAM-AAAGGGCGTGGATCTGGTGCGT-BHQ-1。本發(fā)明檢測時間周期短、檢測效率高；檢測病毒特異性高，準確率高；在進行病毒定性分析的同時還能進行病毒定量分析；檢測靈敏度比普通PCR和免疫學檢測方法靈敏度高；操作簡單、易于推廣；實驗結(jié)果重復性好。
文檔編號C12Q1/68GK102140548SQ201110067829
公開日2011年8月3日 申請日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者劉為勇, 劉映樂, 吳建國, 李彤亞, 楊操, 熊鷹, 王珊, 石康, 石清, 程議鋒, 章琪, 艾洪武, 鄒夢月, 陳莎, 項榮 申請人:武漢大學