專利名稱：一種幽門螺旋桿菌表位疫苗及其設(shè)計、制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及到一種幽門螺旋桿菌表位疫苗及其設(shè)計、制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是慢性胃炎、消化性潰瘍和十二指腸潰瘍的重要致病因子，與胃癌密切相關(guān)。幽門螺旋桿菌的感染率很高，世界人群Hp感染率超過50%，我國人群Hp感染率為58. 07%，呈家庭聚集性，形勢更加嚴峻。目前臨床治療Hp 感染的方法，主要基于“三聯(lián)”藥物療法(質(zhì)子泵抑制劑、抗生素、鉍劑)，存在諸多弊端如藥物存在毒副作用、Hp耐藥菌株增多、停藥反復感染等。因此，“三聯(lián)”藥物療法不宜在Hp 感染人群中大規(guī)模推廣使用。研制Hp疫苗是控制Hp感染性疾病的一種切實有效的方法， 逐漸成為國內(nèi)外學者競相研究的一個熱點。以往國內(nèi)外對Hp疫苗的研究主要集中在全菌疫苗和亞單位疫苗上。大量實驗研究證明，用Hp全菌抗原輔以霍亂毒素佐劑(CT)進行動物實驗，能夠取得非常好的免疫預(yù)防和治療效果。但是Hp培養(yǎng)條件苛刻和全菌疫苗安全性差等問題，限制了 Hp全菌疫苗的發(fā)展。隨后，學者研究Hp亞單位疫苗。Hp亞單位疫苗雖然能夠取得很好的免疫預(yù)防效果，卻難以達到良好的治療效果。究其原因幽門螺旋桿菌自然感染時，人體內(nèi)產(chǎn)生強烈的免疫應(yīng)答，但是感染依舊持續(xù)慢性化，揭示Hp可通過免疫偏差、免疫顛覆和免疫缺陷等多種機制逃避自然免疫產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，進而機體形成對天然Hp抗原的免疫耐受，所以以天然Hp抗原為免疫原無法打破機體對Hp的免疫耐受，激發(fā)有效的免疫應(yīng)答?？乖砦皇谴碳C體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的基本功能單位，表位疫苗基于抗原表位而制備，具有更高的免疫特異性和免疫針對性，是研制預(yù)防和治療感染性疾病、惡性腫瘤和自身免疫性疾病等疫苗的新方向。幽門螺旋桿菌含有豐富的尿素酶⑴rease)，約占全菌體蛋白的5% 10%，在Hp 內(nèi)部和表面廣泛表達。一般細菌難以在胃部的高酸環(huán)境中存活，但Hp尿素酶能水解尿素產(chǎn)生氨來中和胃酸，并可對胃黏膜造成病理性損傷。因此，尿素酶是Hp重要的定植因子和致病因子。Hp尿素酶由A和B兩個亞單位⑴reA和toeB)組成，其中尿素酶B亞基是尿素酶活性亞單位，在各Hp菌株中具有很好的保守性，被公認為是Hp疫苗的理想候選抗原。最新實驗研究表明，尿素酶A亞基同樣具有較強的抗原性，針對尿素酶A亞基的Hp疫苗同樣能夠取得良好的保護作用。然而，實驗研究表明天然Hp尿素酶激發(fā)的抗尿素酶抗體，不能有效抑制尿素酶活性。究其原因，Hp尿素酶的B細胞抗原表位可分為兩類，一類表位激發(fā)機體產(chǎn)生的抗尿素酶抗體，可明顯抑制尿素酶活性，為中和抗體；而另一類表位激發(fā)機體產(chǎn)生的抗尿素酶抗體，卻有助于Hp的胃部定植和病理性進程。因此，選擇可激發(fā)中和抗體的尿素酶抗原表位來構(gòu)建表位疫苗，可避免交叉反應(yīng)產(chǎn)生的免疫病理性傷害，激發(fā)有效抑制尿素酶活性的抗體，有助于Hp感染性疾病的有效治療。UreA183^203是尿素酶A亞基的一個B細胞抗原表位，具有獨特的免疫學性質(zhì)；toeA183_2(l3激發(fā)的表位特異性抗體HpU-2，不僅能與尿素酶A發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，而且能夠與尿素酶B亞基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，可有效抑制Hp尿素酶的活性?；魜y毒素是由1個A亞基(CTA)和5個完全相同的B亞單位(CTB)所構(gòu)成的多亞單位大分子?；魜y毒素A亞基(CTA)具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，具有很強的生物學毒性； 大量的動物實驗表明霍亂毒素B亞基(CTB)是一種很好的黏膜免疫佐劑，可增強弱免疫原的免疫原性。CTB形成五聚體與神經(jīng)節(jié)苷脂GMl的結(jié)合活性對其行使黏膜免疫佐劑的功能十分重要，有助于(1)促進抗原通過黏膜屏障；(2)加強抗原被DC和其他抗原提呈細胞的提呈作用；(3)增強抑制性T細胞分泌TGF-b，發(fā)揮正常的免疫佐劑功能。本發(fā)明的思路如下通過生物信息學軟件對霍亂毒素B亞基(CTB)和Hp尿素酶 A亞基抗原表位(UreA183.)的連接順序和間隔序列，加以分析和確定，設(shè)計一個具有科學合理結(jié)構(gòu)的幽門螺旋桿菌表位疫苗CTB-UA。利用基因克隆、表達和蛋白純化等分子生物學技術(shù)獲得了高純度的Hp表位疫苗CTB-UA，經(jīng)免疫學實驗證明Hp表位疫苗CTB-UA具有較好的免疫特異性和免疫針對性，能夠激發(fā)機體產(chǎn)生針對尿素酶A、B雙亞基的表位特異性抗體，并可有效抑制Hp尿素酶活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個方面是提供了一種Hp表位疫苗本發(fā)明的第二個方面是提供了該Hp表位疫苗的制備方法。本發(fā)明的第三個方面是公布了該Hp表位疫苗的用途。本發(fā)明的第一個方面是提供了一種Hp表位疫苗CTB-UA。該Hp表位疫苗主要由來自尿素酶A亞基的B細胞抗原表位^reA183.)和霍亂毒素B亞基構(gòu)成，具有以下優(yōu)點 (1) Hp表位疫苗CTB-UA含有來自尿素酶A亞基的B細胞抗原表位(UreA183_2C13)，能夠激發(fā)針對尿素酶A、B雙亞基兩者的表位特異性抗體。( 天然Hp尿素酶激發(fā)的抗尿素酶抗體，不能有效抑制尿素酶活性，本發(fā)明的Hp表位疫苗CTB-UA由可激發(fā)有效抑制尿素酶活性的表位特異性抗體。( 選擇“尿素酶抗原表位toeA183_2(l3”來代替Hp尿素酶大分子抗原研制表位疫苗，可有效避免Hp尿素酶的生物學毒性和一些免疫交叉性病理性傷害。本發(fā)明的第二個方面是提供了 Hp表位疫苗CTB-UA的制備方法，其技術(shù)路線簡述如下(I)Hp表位疫苗CTB-UA抗原分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計通過生物信息學軟件對霍亂毒素B亞基(CTB)和Hp尿素酶A亞基抗原表位 (UreA183^203)的連接順序和間隔序列，加以分析和確定，設(shè)計一個具有科學合理結(jié)構(gòu)的幽門螺旋桿菌表位疫苗CTB-UA。(2)重組表達質(zhì)粒pETCUA (含有融合基因CTB-UA)的構(gòu)建設(shè)計一對互補引物，利用PCR技術(shù)合成尿素酶A亞基抗原表位^reA183.)的核苷酸序列，將其插入含有霍亂毒素B亞基(CTB)基因的重組表達載體pETC中，構(gòu)建重組表達載體 pETCUA。(3)融合蛋白CTB-UA的原核表達及純化將重組表達載體pETCUA轉(zhuǎn)化進大腸桿菌BL21(DE3)中，構(gòu)建重組基因工程菌株BL21 (DE3) /pETCUA。利用IPTG誘導表達，并通過Ni-NTP鎳離子親和層析和DEAE SepharoseFF陰離子交換層析能夠獲得高純度融合蛋白CTB-UA，即為Hp表位疫苗。
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本發(fā)明的第三個方面是提供了 Hp表位疫苗CTB-UA的用途。Hp表位疫苗CTB-UA 可用于預(yù)防和治療幽門螺旋桿菌感染相關(guān)性疾病。


圖1 :Hp表位疫苗CTB-UA的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計特點。圖2 重組表達載體pETCUA的雙酶切鑒定。泳道1 =DNAMarker III ；泳道2 =DNAMarker DL2000 ；泳道3 重組表達載體pETCUA 經(jīng)Nco I/Xho I雙酶切；圖3 重組表達載體pETCUA的質(zhì)粒圖譜。Nco I和Xho I之間為插入的融合基因CTB-UA圖4 =Hp表位融合蛋白CTB-UA (即Hp表位疫苗CTB-UA)的原核表達。泳道1 蛋白質(zhì)Marker ；泳道2_6 =CTB-UE融合蛋白(一個對照蛋白)；泳道 7 :CTB-UA全菌蛋白；泳道8 :CTB-UA包涵體蛋白；泳道9 :CTB_UA可溶蛋白；泳道10 BL21 (DE3) /pET22b 全菌蛋白。圖5 =Hp表位融合蛋白CTB-UA的Ni-NTA親和層析純化。1 蛋白質(zhì)Marker ；2 未純化前CTB-UA可溶性蛋白；3 IOmM咪洗脫下的雜蛋白和部分目的蛋白；4 :50mM咪唑洗脫的雜蛋白和部分目的蛋白；5-7 :500mM咪唑洗脫下的目的蛋白(CTB-UA) ；8:蛋白樣品上樣穿透峰;圖6 =Hp表位融合蛋白CTB-UA的kpharose FF陰離子交換層析純化。1 蛋白質(zhì)Marker ；2 蛋白樣品上樣穿透峰；3 含0. IM NaCl的磷酸鹽緩沖液洗脫下的雜蛋白；4-5 含0.5M NaCl的磷酸鹽緩沖液洗脫下的目的蛋白(CTB-UA)；圖7 =Hp表位疫苗CTB-UA誘發(fā)抗尿素酶抗體的檢測。 Hp表位疫苗CTB-UA和重組尿素酶B亞基(rtoeB)都能誘發(fā)較高滴度抗尿素酶抗體。圖8 =Hp表位疫苗CTB-UA誘發(fā)抗尿素酶A亞基抗體的檢測。Hp表位疫苗CTB-UA能誘發(fā)較高滴度的抗尿素酶A亞基抗體。圖9 =Hp表位疫苗CTB-UA誘發(fā)抗尿素酶B亞基抗體的檢測。Hp表位疫苗CTB-UA和重組尿素酶B亞基(rtoeB)都能誘發(fā)較高滴度的抗尿素酶 B亞基抗體。圖10 =Hp表位疫苗CTB-UA誘發(fā)toeA183_2(13表位特異性抗體的檢測。Hp表位疫苗CTB-UA能夠產(chǎn)生較高滴度的toeA183_2(13表位特異性抗體。圖11 :Hp表位疫苗CTB-UA免疫特異性的免疫印跡(Western Blot)鑒定。(A)鼠抗CTB-UE抗血清與各個蛋白抗原的反應(yīng)；(B)鼠抗rCTB抗血清與各個蛋白抗原的反應(yīng)；(C)正常鼠血清與各個蛋白抗原的反應(yīng)；圖12 :Hp表位融合蛋白CTB-UA與神經(jīng)節(jié)苷脂GMl的結(jié)合活性檢測。Hp表位融合蛋白CTB-UA和重組霍亂毒素B亞基(CTB)按照一定比例稀釋 (100 μ g/ml到0. 78 μ g/ml)與神經(jīng)節(jié)苷脂GMl反應(yīng)。圖13 :Hp表位融合蛋白CTB-UA與神經(jīng)節(jié)苷脂GMl的結(jié)合活性檢測。
Hp表位融合蛋白CTB-UA和重組霍亂毒素B亞基按照一定比例稀釋(100 μ g/ml、 50 μ g/ml和25 μ g/ml)與神經(jīng)節(jié)苷脂GMl反應(yīng)。圖14 =Hp表位疫苗CTB-UA多克隆抗體抑制尿素酶活性的檢測。鼠抗CTB-UA多克隆抗體和重組尿素酶B亞基(rtoeB)多克隆抗體均能有效抑制 Hp尿素酶活性，而鼠抗CTB-UA多克隆抗體對Hp尿素酶活性的抑制效果更加顯著，
具體實施例方式材料1. IPTG溶液稱取1. 2g IPTG置于50ml離心管中，加入40ml無菌水，充分混勻溶解后，定容至50ml。用0. 22 μ m濾器過濾除菌，小份分裝，_20°C保存。2.氨芐青霉素(Amp)貯液(100mg/mL)稱取IOOmg氨芐青霉素(Amp)溶于ImL 無菌水，制得濃度為lOOmg/mL的貯存液，通過0. 22 μ m細菌濾器過濾除菌，溶液分裝保存于-20°C冰箱中。3.培養(yǎng)基(I)LB液體培養(yǎng)基稱取IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl，加蒸餾水至1000ml，調(diào)整pH至7. 4，高壓蒸氣滅菌。(2) LB固體培養(yǎng)基1. 5g瓊脂粉/IOOml LB 培養(yǎng)液，高壓滅菌后，傾倒平板。4. DNA 電泳緩沖液(50x TAE)稱取 242g Tris,37. 2g Na2EDTA ·2Η20 禾口 57. Iml 冰乙酸，加水至1000ml，使用時稀釋50倍。5. SDS-PAGE 電泳緩沖液(5X)稱取 Tris 粉末 15. lg、甘氨酸 94g、SDS 5. Og ；加入約800ml的去離子水，攪拌溶解；加去離子水定容至1L，室溫保存；注意加水時應(yīng)讓水延著壁緩緩流下，以避免由于SDS的原因產(chǎn)生很多泡沫。6.考馬斯亮藍蛋白染色試劑(1)考馬斯亮藍G-250染液(蛋白質(zhì)定量用)考馬斯亮藍G-250IOOmg溶解在50ml 95%乙醇中，然后加入86%磷酸100ml，用蒸餾水稀釋至 IOOOml。(2)考馬斯亮藍R-250染液0. 29g考馬斯亮藍R-250溶解在250ml脫色液中。(3) 固定液500ml乙醇、IOOml冰醋酸用蒸餾水稀釋至1000ml。(4)脫色液250ml乙醇、80ml 冰醋酸用蒸餾水稀釋至1000ml。( 保存液25ml 87%甘油溶于225ml脫色液中。7. RNase A 溶液(10mg/ml) IOmg RNase A 溶解于 987 μ 1/K中，力口入 10 μ 1 IM Tris-HCl (ρΗ7. 5)禾口 3 μ 1 5Μ NaCl，沸水浴15min后，緩慢冷卻至室溫，分成小份存于-20°C8. Lysozyme 溶液(10mg/ml) :10mg Lysozyme 溶于 Iml IOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)。9.實驗動物:BALB/c小鼠，為SPF級，雄性，8 10周齡，購自揚州大學比較醫(yī)學中心，許可證號SCXK(蘇)2007-0001。10. Western blot 試劑(1)電轉(zhuǎn)緩沖液2. 9g 甘氨酸，5. 8g Tirs, 0. 37g SDS, 200ml甲醇，加雙蒸水稀釋至1L。(2) 10X麗春紅貯液2g麗春紅，30g三氯乙酸，30g磺基水楊酸，加水至 IL ； (3) 5x PBS 緩沖液2. 9g Na2HPO4 · 12H20,0. 24g KH2PO4,8g NaCl，0. 2g KCl 溶于200ml ddH20中，用NaOH調(diào)PH值到7. 4。(4)PBST緩沖液=PBS緩沖液中加入0. 05% Tween-20。(5)封閉液10%脫脂奶粉溶于PBST緩沖液，用前現(xiàn)配。(6)底物液反應(yīng)液增強型DAB顯色試劑盒(天根)。11. ELISA 試劑(1)包被液1. 6gNa2C03,2. 9gNaHC03,0. 2gNaN3，加雙蒸水至 1L，調(diào)pH 值至 9. 6。(2)洗滌液分別稱取 0. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12H20，8. Og NaCl，0. 2gKCl， 0. 5ml Tween-20,加入 ddH20 定容至 1000ml (PBST)。(3)封閉液稱取 3. Og BSA 溶解于 IOOml洗滌緩沖液中，過濾除菌后4°C保存。(4)底物液可溶性單組份TMB底物溶液。(5) 終止液量取蒸餾水178. :3ml，逐滴加入濃硫酸21. 7ml (1M H2SO4)。12.快速尿素酶檢測試劑2% 尿素，0.04% 酚紅，0.04 ^NaH2PO4. H20,0.1% Na2HPO4, pH為6. 0，臨用前配制。實例1 幽門螺旋桿菌表位疫苗CTB-UA的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計CTB形成五聚體結(jié)構(gòu)并與神經(jīng)節(jié)苷脂GMl相結(jié)合，對CTB行使黏膜免疫佐劑的功能十分重要。實驗研究表明將外源蛋白偶聯(lián)于CTB的C端，融合蛋白能夠最大限度地形成五聚體結(jié)構(gòu)，與神經(jīng)節(jié)苷脂GMl的結(jié)合活性最強。因此，在新型Hp多表位疫苗的設(shè)計中，將尿素酶多表位肽(UE)融合在CTB的C端，最大程度保持CTB的黏膜免疫佐劑活性。因此，在 Hp表位疫苗CTB-UA的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計中，將尿素酶A亞基抗原表位⑴reA183_2J融合在CTB 的C端。在對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)疫苗LTB-ST的設(shè)計和研究中表明二者之間插入 7個氨基酸(DPRVPSS)時，ST的抗原性最高；當插入3個氨基酸時(IPG)時，ST的抗原性次之；當不插入氨基酸時，用ELISA方法檢測不到ST的抗原性。成熟的大腸桿菌耐熱性腸毒素(ST)僅有18個氨基酸，類似于一個抗原表位肽，對尿素酶A亞基抗原表位(UreA183.) 與CTB的偶聯(lián)提供了很好的借鑒。因此，在Hp表位疫苗CTB-UA的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計中，選擇7 個氨基酸的間隔序列(DPRVPSS)來間隔CTB和尿素酶A亞基抗原表位⑴reA183_2(13)。經(jīng)過生物信息學軟件DNAstar分析，間隔序列(DPRVPSS)易形成轉(zhuǎn)角和β-折疊，不易形成α-螺旋，為柔性結(jié)構(gòu)，能有效間隔開CTB和尿素酶A亞基抗原表位(UreA183J3)，有利于尿素酶抗原表位的有效呈遞。結(jié)果幽門螺旋桿菌表位疫苗CTB-UA的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計特點和思路如(圖1)所示。實例2 重組表達載體pETCUA (含有融合基因CTB-UA)的構(gòu)建(1)尿素酶A亞基抗原表位UreAB183_2Q3B基因序列的PCR合成利用Primer Premier V5. 0 設(shè)計引物 Pl-UreAB183_203B 和 P2_UreAB183_203B。弓丨物 Pl-UreAB183^203B 和 P2-UreABW3_2(13B 的序列及特點如下弓 I 物 P2-UreAB183_2(13B: 引物Pl-UreABW3_2(13前端帶有Kpn I酶切位點的粘性末端(C)，后端帶有Bio I 酶切位點的粘性末端(C)，均用黑色加粗字體標示；引物P2-UreAB183_2(l3前端帶有Bio I酶切位點的粘性末端(TCGAG)，后端帶有Kpn I酶切位點的粘性末端(GGTAC)，均用黑色加粗字體標示；引物Pl-UreAB183.和P2-UreAB183_2(13中間部分為互補的尿素酶A亞基抗原表位toeAB183_2(13和部分Linker的核苷酸序列，均用陰影標示。引物序列送交南京金思瑞生物科技公司合成。利用引物Pl-UreAB183.和P2-UreAB183_2(13擴增尿素酶A亞基抗原表位 UreAB183^203基因序列的PCR反應(yīng)體系如下
Pl-UreAB183-203 ( 0.1 μξ ^L)20 μΙ>
Ρ2- UreAB183-203 ( 0.1 pg ^L)20 μ
ddHB2B010 μ
Total50μΙΓPCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，94°C變性45sec，52°C退火5min，冷卻至室溫。(2)尿素酶A亞基抗原表位UreAB183_2(13B基因序列的回收和純化尿素酶A亞基抗原表位^eA183.基因擴增產(chǎn)物的回收純化主要通過凝膠DNA 回收純化試劑盒(天根生化科技有限公司)進行操作向吸附柱中加入500ul平衡液， 12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；用干凈的手術(shù)刀片將單一目的DNA條帶從低熔點瓊脂糖凝膠中切下，放入干凈的1. 5ml EP管中，稱其重量； 按照比例加入溶膠液，IOOmg凝膠加入IOOul溶膠液；在50 65°C的水浴中孵育10分鐘左右，孵育期間不斷的上下輕輕顛倒EP管，直至凝膠全部溶化；將溶膠液加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘；再加入600ul漂洗液于吸附柱中，12000rpm離心30秒， 棄廢液；再次加入300ul漂洗液于吸附柱中，12000rpm離心30秒，棄廢液。再以12000rpm 離心1分鐘；取出吸附柱，放入一個干凈的1. 5ml Ep管中，加入30 60ul的洗脫液，室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘；純化的DNA放置在_20°C保存；最后，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。(3)尿素酶A亞基抗原表位UreAB183_2(13B基因與重組表達載體pETC的連接重組表達載體pETC為本實驗室前期所構(gòu)建，其中含有霍亂毒素B亞基(CTB)基因，CTB基因的兩端為Nco I和KpnI酶切位點；提取重組表達載體pETC，用Kpn I/Xho I進
行雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系如下
pETC15 μ IOxM Buffer5 μ Kpnl (15υ/μ )2 ^hXhol (15υ/μ )2\xLddHB2B026 μ Total50 μL37°C酶切反應(yīng)池，然后用瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結(jié)果。利用凝膠DNA回收純化試劑盒(天根生化科技有限公司)回收純化重組表達載體PETC雙酶切產(chǎn)物。將回收的pETC線性化載體和尿素酶A亞基抗原表位toeA183_2(l3基因混合，通過互補的粘性末端， 在T4DNA連接酶的作用下過夜)連接成閉合環(huán)狀的DNA分子，即形成重組表達質(zhì)粒 pETCUA。T4DNA連接酶連接體系如下pETC線性化載體1.5 μL
UreAB183-203B基因4.5 μL
10 X T4 DNA 連接酶 Buffer1 pL
T4-DNA 連接酶(3U/pL)1 μL
ddHB2B02 μL
Total Ομ 結(jié)果利用Nco I/Xho I雙酶切待檢重組質(zhì)粒pETCUA，37°C反應(yīng)2h，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)雙酶切的DNA片段為4(^bp，與融合基因CTB-UA的理論大小一致。 再將pETCUA送交南京金思瑞生物科技公司，采用T7啟動子和終止子通用引物進行基因測序，證明pETCUA中融合基因CTB-UA的核苷酸序列完全正確，且無移碼突變。重組表達載體 pETCUA的質(zhì)粒圖譜如(圖3)所示。
實例3 =Hp表位肽融合蛋白CTB-UA的原核表達將驗證正確的重組表達質(zhì)粒pETCUA轉(zhuǎn)化進E. coli BL21 (DE3)菌株中。在預(yù)先制備好的含50 μ g/mLAmp的LB平板上，接種環(huán)劃線基因工程菌株BL21 (DE3) /pETCUA,倒置于 37°C培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)12 IMi后，挑取單個菌落，接種于含50 μ g/mLAmp的LB培養(yǎng)基中， 370C，180rpm,培養(yǎng)12 16h。以2%接種量分別接種重組菌于含50 μ g/mLAmp LB培養(yǎng)基中，37°C，ISOrpm振蕩過夜，次日晨再將該菌液以1 %接種量接種于含50 μ g/mL Amp的LB 液體培養(yǎng)基中，370C，180rpm搖瓶汕后，加入IPTG使終濃度達到lmmol/L，37°C，180rpm誘導表達，以空載體菌BL21 (DE3)/pET22b作為陰性對照。結(jié)果將基因工程重組菌株BL21 (DE3) /pETCUA在PH值為7、IPTG濃度為lmmol/ L、誘導溫度37°C、誘導時間為他的情況下進行誘導表達。與對照菌株對比，基因工程重組菌株BL21 (DE3)/pETCUA在約16KD處出現(xiàn)目的蛋白條帶，與Hp表位肽融合蛋白CTB-UA的理論大小相符合(圖4)。Hp表位肽融合蛋白CTB-UA在可溶性蛋白和包涵體蛋白中都有存在。實例4 =Hp表位肽融合蛋白CTB-UA的純化(1) Ni-NTA鎳離子親和層析柱的純化將Ni-NTA填料充分混勻后加入層析柱中，溶液可通過重力作用緩慢流出，待完全加入后，將上層篩板平放入柱中。向裝填好的柱中加入適量的去離子水將乙醇沖洗干凈后， 加入8倍柱體積的Binding buffer平衡，平衡結(jié)束后即可上樣。收集菌體后，每IOOmg菌體加入l-5ml Binding Buffer，超聲裂解菌體。將菌體裂解液負載上柱，流速為10倍柱體積/ 小時；使用15倍柱體積的Wash buffer沖洗柱子，收集流穿峰；使用5倍柱體積的Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰；依次使用3倍柱體積的Binding Buffer和5倍柱體積的去離子水洗滌后，用3倍柱體積的20%乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒)，4°C保存。結(jié)果經(jīng)Ni-NTA鎳離子親和層析柱的純化后，收集的各個蛋白峰進行SDS-PAGE分析，可以發(fā)現(xiàn)Hp表位肽融合蛋白CTB-UA集中在500mM咪唑洗脫產(chǎn)生的蛋白峰。通過凝膠成像檢測儀分析在500mM咪唑洗脫的Hp表位肽融合蛋白CTB-UA純度均在85%以上(圖 5)。(2)陰離子交換層析(kpharose FF)的純化
Sepharose FF陰離子交換層析方法用離子交換層析緩沖液A平衡DEAE Sepharose FF離子交換層析柱。將經(jīng)過Ni-NTA親和層析一級純化后的蛋白樣品以IOml/ min流速上樣DEAEkpharose FF陰離子交換層析柱；用離子交換層析緩沖液B洗脫蛋白； 洗脫方式連續(xù)梯度洗脫40min，收集目的蛋白峰。結(jié)果d^kpharose FF陰離子交換層析純化，收集的各個蛋白峰進行SDS-PAGE分析，Hp表位肽融合蛋白CTB-UA主要集中在用0. 5M NaCl的磷酸鹽緩沖溶液洗脫下的蛋白峰中。經(jīng)凝膠成像檢測儀軟件，Hp表位肽融合蛋白CTB-UA的純度在90%以上(圖6)。
實施例5 =Hp表位疫苗CTB-UA的免疫原性和免疫特異性研究(l)BALB/c小鼠的免疫實驗分組將SPF級BALB/c小鼠隨機分為4組，分別為Hp表位融合蛋白CTB-UA 免疫組、重組尿素酶B亞基(rtoeB)免疫組、重組霍亂毒素B亞基(rCTB)免疫組和PBS免疫組。每組6只BALB/c小鼠，共M只，詳細分組如下圖所示表1 :SPF級BALB/c小鼠分組及免疫方案
實驗組~~Wi免疫方式免疫次數(shù)免疫劑量免疫佐劑
權(quán)利要求
1.一種幽門螺旋桿菌表位疫苗，其活性成分是一條多肽，主要由霍亂毒素B亞基(CTB) 和一個來源于尿素酶A亞基的B細胞抗原表位構(gòu)成，其氨基酸序列如序列1所示。
2.如權(quán)利要求1所述，一種幽門螺旋桿菌表位疫苗，其核苷酸序列如序列2所示。
3.包含權(quán)利要求2中所述的核苷酸序列的表達載體，轉(zhuǎn)基因細胞系及宿主菌。
4.如權(quán)利要求1所述，該來源于尿素酶A亞基的B細胞抗原表位的氨基酸序列為 SVELIDIGGNRRIFGFNALVD。
5.如權(quán)利要求1所述，一種幽門螺旋桿菌表位疫苗，其特征為在霍亂毒素B亞基(CTB) 和尿素酶A亞基B細胞抗原表位之間的間隔序列為DPRVPSS。
6.如權(quán)利要求1和5所述，一種幽門螺旋桿菌表位疫苗，其特征為霍亂毒素 B亞基(CTB)在間隔序列(DPRVPSS)的上游，而尿素酶A亞基的B細胞抗原表位 (SVELIDIGGNRRIFGFNALVD)在間隔序列(DPRVPSS)的下游。
7.—種幽門螺旋桿菌表位疫苗的制備方法，通過PCR技術(shù)合成尿素酶A亞基B細胞抗原表位的核苷酸序列，將其與霍亂毒素B亞基的基因序列相偶聯(lián)，形成一個融合基因 CTB-UA，并構(gòu)建含有該融合基因的重組表達載體pETCUA及其重組基因工程菌。重組基因工程菌株發(fā)酵后，利用蛋白質(zhì)純化技術(shù)獲得該疫苗的融合蛋白CTB-UA。
8.按照權(quán)利要求1和7所述的幽門螺旋桿菌表位疫苗，其特征在于能夠激發(fā)機體產(chǎn)生有效抑制Hp尿素酶活性的高滴度表位特異性抗體。
9.按照權(quán)利要求1和8所述的幽門螺旋桿菌表位疫苗，其特征是可以用作預(yù)防和治療幽門螺旋桿菌感染的藥物組合。
全文摘要
本發(fā)明提供一種幽門螺旋桿菌表位疫苗。本發(fā)明的幽門螺旋桿菌表位疫苗，其活性成分是一條多肽，主要是由霍亂毒素B亞基和一個來自于尿素酶A亞基的B細胞抗原表位構(gòu)成。該表位疫苗是通過PCR技術(shù)合成上述尿素酶A亞基的B細胞抗原表位的核苷酸序列，并將其與霍亂毒素B亞基的基因序列相偶聯(lián)，形成一個融合基因，并利用表達載體在大腸桿菌中表達該融合基因，經(jīng)蛋白純化后，得到該表位疫苗的融合蛋白。本發(fā)明的幽門螺旋桿菌表位疫苗能夠誘發(fā)機體產(chǎn)生針對尿素酶的較高滴度表位特異性抗體。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)，該表位疫苗可用于預(yù)防和治療幽門螺旋桿菌感染相關(guān)性疾病，帶來巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。
文檔編號C12N15/62GK102151332SQ20111006804
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月22日
發(fā)明者何赟綿, 奚濤, 王學全, 邢瑩瑩, 郭樂 申請人:中國藥科大學