專利名稱：人纖溶酶原功能性突變體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術制藥領域，具體涉及人纖溶酶原的功能性突變體及其制備方法和應用。
背景技術：
栓塞是導致心腦血管疾病死亡的重要原因之一，溶栓治療是一種有效的手段。 目前臨床使用的主要溶栓藥物，如組織纖溶酶原激活劑(Tissue-type ρ 1 asminogen activator, t_PA)、尿激酶(Urokinase-type plasminogen activator, UK)、鏈激酶 (Streptokinase, SK)等，盡管表現(xiàn)出一定的治療效果，但由于需激活血液內(nèi)的纖溶酶原 (PLG)為纖溶酶(PLM)后方能發(fā)揮溶栓作用，因此對陳舊性血栓的效率較低，導致治療時間窗短、出血并發(fā)癥較高等缺點。且由于無抗栓功能，易出現(xiàn)溶栓后再栓的情況。PLM是血液內(nèi)直接發(fā)揮纖溶及栓溶作用的蛋白酶。體內(nèi)實驗表明與目前臨床使用的溶栓劑相比，PLM 具有可直接溶栓、出血并發(fā)癥低等特點。PLM還可有效地治療黃斑變性、木質(zhì)結(jié)膜粘連等多種疾病，以及用于動靜脈插管設備的清洗。此外，PLM還參與一系列與蛋白水解相關的生理、 病理過程，如組織重構(gòu)、排卵、炎癥、腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移等。因此，PLM具備廣闊的藥用前景和研究價值。然而一直以來，PLM的應用均采用混合人血漿提取，受到血漿來源的限制，難以大規(guī)模生產(chǎn)，且存在病毒污染的風險?；蚬こ痰陌l(fā)展為大規(guī)模生產(chǎn)提供可能。人PLG是由 791個氨基酸殘基組成的糖蛋白，包含N端多肽(NTP)、五個同源的Kringle區(qū)(K1-K5)、 絲氨酸蛋白酶區(qū)(SP) 7個結(jié)構(gòu)域。PLG經(jīng)纖溶酶原激活劑(PA)特異性水解激活環(huán)上的 Arg561-Val562肽鍵后，轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚訮LM。然而，近年來通過大腸桿菌、哺乳動物細胞表達均未獲得高水平的活性蛋白。一些學者通過構(gòu)建包含SP結(jié)構(gòu)域和部分K區(qū)的小分子突變體，提高了表達水平，且保留了較好的纖溶活性，其中部分進入臨床實驗研究。盡管溶栓治療可以有效地使血管再通，但仍然不能阻止溶栓后再栓。目前尚無兼具溶栓與抗凝、防栓作用的PLG突變體報道。Arg-Gly-Asp (RGD)序列可與纖維蛋白原競爭結(jié)合與血小板聚集相關的膜受體GPIIb/IIIa，阻斷血栓形成的最后共同通路，其模擬物臨床上常用于預防再栓塞。目前已構(gòu)建了多種包含R⑶的融合蛋白，且顯示出較好的抗栓作用。Arg-Pro-Gly (RPG)是纖維蛋白原α鏈N端附近的三個氨基酸殘基，在凝血酶的作用下曝露出來成為末端三肽，參與纖維蛋白單體之間聚合，從而形成牢固的纖維蛋白栓子，而RPG三肽本身是一種纖維蛋白單體聚合抑制劑。近年來研究表明一些合成的類似 RPG多肽，如GPRP, GPR-sarcosine亦顯示出抗纖維蛋白單體聚合活性，其中以GPRP活性最高。且修飾后的多肽可耐受蛋白酶水解，具有更好的穩(wěn)定性。盡管目前已構(gòu)建出多種包含SP結(jié)構(gòu)域的PLM突變體，且顯示較好的溶栓活性， 但尚無兼具溶栓與抗凝、防栓作用的PLM突變體報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術中纖溶酶不能兼具溶栓、抗凝、防栓作用的缺點， 提供兼具纖溶與抗血小板聚集或抗纖維蛋白單體聚合作用的雙功能重組蛋白，即人纖溶酶原功能性突變體。本發(fā)明的另一個目的是提供上述人纖溶酶原功能性突變體的制備方法。本發(fā)明的又一目的是提供上述人纖溶酶原功能性突變體的應用。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)上述目的
一種人纖溶酶原功能性突變體，為人纖溶酶原蛋白的ftx)544 - Asn791多肽，去除了 5個 Kringle區(qū)，保留了酶催化活性區(qū)，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，命名為hPLG-ΔΚ ；還包括在SEQ ID NO: 1限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有如hPLG-ΔΚ活性的蛋白。上述人纖溶酶原功能性突變體hPLG-ΔΚ的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。一種人纖溶酶原功能性突變體，是將hPLG-ΔΚ的Pro559突變?yōu)锳sp559，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，命名為RGD-hPLG-ΔK;還包括在SEQ ID NO:3限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有如RGD-hPLG-ΔΚ活性的蛋白。上述人纖溶酶原功能性突變體RGD-hPLG-ΔΚ的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。一種人纖溶酶原功能性突變體，是將hPLG-ΔΚ的Gly56°突變?yōu)镠is56tl,其氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示，命名為RHP- hPLG-ΔΚ ；還包括在SEQ ID N0:5限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有如RHP- hPLG-ΔΚ活性的蛋白。上述人纖溶酶原功能性突變體RHP- hPLG-ΔΚ的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。人纖溶酶原功能性突變體hPLG-ΔΚ的制備方法，包括以下步驟
以含人纖溶酶原全長cDNA序列的質(zhì)粒為模板，設計上游引物SEQ ID N0:7和下游引物 SEQ ID N0:8進行第一輪PCR;再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，設計上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8進行第二輪PCR;第二輪PCR產(chǎn)物連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以巴斯德畢赤酵母進行表達，表達產(chǎn)物即為人纖溶酶原功能性突變體hPLG-ΔΚ。人纖溶酶原功能性突變體RGD-hPLG-ΔΚ的制備方法，包括以下步驟
以含人纖溶酶原全長cDNA序列的質(zhì)粒為模板，以上游引物SEQ ID N0:7和下游引物 SEQ ID N0:8進行第一輪PCR;以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，以上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8進行第二輪PCR ;PCR產(chǎn)物連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建質(zhì)粒；以構(gòu)建的質(zhì)粒為模板，用上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID NO: 10進行第三輪PCR ；再以線性化質(zhì)粒為模板，以第三輪PCR產(chǎn)物為上游引物，與下游引物SEQ ID N0:8進行第四輪PCR; 最后以第四輪PCR產(chǎn)物為模板，以上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8進行第五輪PCR ；第五輪PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以巴斯德畢赤酵母GSl 15菌株進行表達，表達產(chǎn)物即為 RGD-hPLG-ΔΚ。人纖溶酶原功能性突變體RHP- hPLG-ΔΚ的制備方法，包括以下步驟
以含人纖溶酶原全長cDNA序列的質(zhì)粒為模板，以上游引物SEQ ID N0:7和下游引物SEQ ID NO:8進行第一輪PCR;以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8進行第二輪PCR ;PCR產(chǎn)物連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建質(zhì)粒；以構(gòu)建的質(zhì)粒為模板，用上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID NO: 11進行第三輪PCR ；再以線性化質(zhì)粒為模板，以第三輪PCR產(chǎn)物為上游引物，與下游引物SEQ ID N0:8進行第四輪PCR;最后以第四輪PCR產(chǎn)物為模板，以上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8進行第五輪PCR ；第五輪PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，所得產(chǎn)物以巴斯德畢赤酵母GSl 15菌株進行表達， 表達產(chǎn)物即為RHP- hPLG-ΔΚ。以上所述人纖溶酶原功能性突變體在制備預防或治療炎癥、腫瘤、血栓、阿茨海默或黃斑水腫疾病的藥物中的應用。其中，人纖溶酶原h(huán)PLG的核苷酸序列Genebank編號BC060513. 1。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明的突變體去除了人PLG的所有K區(qū)和部分SP區(qū)序列，其優(yōu)勢在于(1)進一步縮減了分子量，有利于重組蛋白質(zhì)的復性，從而增加了利用大腸桿菌獲得高水平表達的可能性；(2)由于PLG的兩個糖基化位點均位于K區(qū)，去除K區(qū)后避免了在酵母菌中表達時的過糖基化問題；(3) K區(qū)是PLG與促炎癥細胞上受體相結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)域，去除后可避免重組蛋白激活中性粒細胞、巨噬細胞、血小板、血管內(nèi)皮細胞，從而降低溶栓時可能存在的促炎癥副作用。(4) K區(qū)也是PLG與血漿中的抑制物Ci2-抗纖溶酶結(jié)合位點，因此去除K區(qū)可延長藥物在血漿中的半衰期。本發(fā)明在獲得重組人PLG突變體高水平表達的基礎上，通過定點突變激活環(huán)上部分氨基酸序列，從而構(gòu)建局部RGD、RPG及類似功能模序。激活環(huán)是由Cys558-Cys566 二硫鍵形成的環(huán)袢結(jié)構(gòu)，晶體衍射數(shù)據(jù)表明該9肽的環(huán)袢結(jié)構(gòu)曝露于分子表面，是PLG與 PA相互作用的主要界面，且位于PLM蛋白水解結(jié)構(gòu)域外。在PA特異性水解激活環(huán)上的 Arg561-Val562肽鍵后，其下游游離出來的V562V563G564G565通過二硫鍵旋轉(zhuǎn)進入到PLM的催化活性區(qū)，其中末端的Val542與Asp74tl形成氫鍵，引起結(jié)構(gòu)改變，最終形成酶活性口袋。研究顯示，激活環(huán)激活位點Arg561上游的突變對PLG的激活影響較小，且不參與活性中心的形成，因此可能是進行功能突變的較好位點。本發(fā)明從多個突變體中篩選出具有溶栓與抗血小板聚集或抗纖維蛋白單體聚合作用的重組人PLG。所構(gòu)建的三個突變體cDNA序列經(jīng)分泌型表達載體整合入巴斯德畢赤酵母染色體中，甲醇誘導后獲得高水平表達，表達產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和層析后純度達90%以上。將純化后的蛋白hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ和RHP- hPLG-ΔΚ，經(jīng)UK激活后，再經(jīng)Ni-NTA親和層析獲得可穩(wěn)定保存的hPLM-AK、RGD-hPLM-AK和RHP- hPLM-ΔΚ。體外活性測定顯示盡管突變體RGD-hPLG-ΔΚ和RHP- hPLG-ΔΚ被UK激活的速率低于PLG、hPLG_AK，但24h時的激活比例無明顯差別，且激活后產(chǎn)生的RGD-hPLM-ΔΚ和RHP-hPLM _ΔΚ纖溶活性與PLM及 hPLM-ΔΚ相近。所構(gòu)建的RGD-hPLG-ΔΚ能顯著地抑制ADP誘導的血小板聚集，盡管激活后RGD的環(huán)袢結(jié)構(gòu)被破壞，抑制活性有所下降，但與hPLM-ΔΚ相比，其抑制活性仍然提高了約10倍，表明激活后RGD三肽依然位于分子表面，可與血小板充分作用；而構(gòu)建的RHP-hPLG-ΔΚ使纖維蛋白單體聚合時間延長約1倍?？傊?，本研究成功構(gòu)建了可替代人PLG而用于臨床治療的突變體hPLG-ΔΚ，在此基礎上構(gòu)建了 RGD-hPLG-ΔΚ和RHP- hPLG-ΔΚ，分別顯示出抗血小板聚集和抗纖維蛋白單體聚合作用，并且詳述了其制備過程和穩(wěn)定保存方法。為進一步應用于炎癥、腫瘤、血栓、阿茨海默、黃斑水腫等疾病的預防、治療及相關病理研究提供了基礎。


圖1 實施例1中hPLG-ΔΚ的cDNA序列構(gòu)建電泳圖，M為DNA marker, 1為第一輪 PCR產(chǎn)物，2為第二輪PCR產(chǎn)物。圖2 實施例2中RGD-hPLG-ΔΚ的cDNA序列構(gòu)建電泳圖，M為DNA maker, 1為第一輪PCR產(chǎn)物，2為第二輪PCR產(chǎn)物，3為第三輪PCR產(chǎn)物。圖3 實施例3中RHP-hPLG-ΔΚ的cDNA序列構(gòu)建電泳圖，M為DNA maker, 1為第一輪PCR產(chǎn)物，2為第二輪PCR產(chǎn)物。圖4 :hPLG-AK核苷酸序列的測序圖。圖5 RGD-hPLG-ΔΚ核苷酸序列的測序圖。圖6 RHP-hPLG-ΔΚ核苷酸序列的測序圖。圖7 構(gòu)建的pGME載體質(zhì)粒經(jīng)損a I和損ο I酶切鑒定電泳圖，其中M為DNA marker, 1 為 pGEM-T-hPLG-ΔΚ，2 為 pGEM-T-RGD-hPLG-ΔΚ，3 為 pGEM-T-RHP-hPLG-ΔΚ，4 為 pPICZa A。圖8:實施例1中hPLG-ΔΚ在巴斯德畢赤酵母中的表達檢測電泳圖，M為蛋白 Marker，1 5分別為hPLG-ΔΚ工程菌甲醇誘導0，24，48，72，96h。圖9 實施例2中RGD-hPLG-ΔΚ在巴斯德畢赤酵母中的表達檢測電泳圖，M為蛋白 Marker，1 5 分別為 RGD-hPLG-ΔΚ 工程菌甲醇誘導 0，24，48，72，％h。圖10 實施例3中RHP-hPLG-ΔΚ在巴斯德畢赤酵母中的表達檢測電泳圖，M為蛋白Marker，1 5分別為RHP-hPLG-ΔΚ工程菌甲醇誘導0，24，48，72，96h。圖 11 :hPLG-AK ,RGD-hPLG-ΔΚ 和 RHP-hPLG-ΔΚ 的純化、鑒定圖，其中 A 為 Ni-NTA 親合層析圖，組分IV含目的蛋白；B是還原性SDS-PAGE分析純化過程電泳圖，M為蛋白 Marker，1為發(fā)酵液上清，2為組分I (上升峰)，3為組分I (下降峰)，4為組分II，5為組分 III，6 為組分 IV ；C 是 Wfeston bloting 鑒定電泳圖，1 為 hPLG-ΔΚ, 2 % RGD-hPLG-ΔΚ, 3 % RHP-hPLG-ΔΚ。圖 12 =UK 激活 hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ 和 RHP-hPLG-ΔΚ 的動力學分析圖。圖13 hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ和RHP-hPLG-ΔΚ的纖溶活性檢測圖，A是纖維蛋白板法測定纖溶活性圖，1為0.02 mol/L PBS，2 6為5、2. 5、1. 25、0. 62、0. 32 U/mL牛血清 PLG，7 10 為 0. 1、0. 2、0. 4、0. 8 mg/mL hPLG-ΔΚ，11 13 為 0. 1、0. 2、0. 4 mg/mL RGD-hPLG-ΔΚ, 14 17 為 0. 1、0· 2、0· 4、0· 8 mg/mL RHP-hPLG-ΔΚ ；B 是纖溶活性對應于溶圈直徑平方的標準曲線。圖14 RGD-hPLG-ΔΚ抑制ADP誘導的血小板聚集活性* P=O. 0001, n=5。
具體實施例方式以下實施例中所用材料、試劑及儀器為
大腸桿菌T0P10由本實驗室保存，pDNR-LIB-hPLG質(zhì)粒購自南京恩晶生物科技有限公司，pPICZ α A質(zhì)粒、巴斯德畢赤酵母GS115 Jeocin購自美國hvitrogen公司，牛血清PLG、PLM購自美國Sigma公司，pGM-T質(zhì)粒購自上海Generay生物技術有限公司，損a I,Xho I、 Sac I、T4 DNA ligase、Premix Taq、DNA Marker、蛋白 Marker 購自大連寶生物工程有限公司，引物合成由上海生工生物工程公司提供，測序由深圳華大測序公司完成，質(zhì)粒抽提、 DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，Ni-NTA親和介質(zhì)為北京瑞達恒輝公司產(chǎn)品； LBY-NJ血液凝聚儀購自北京普利生公司，冷凍干燥儀ZMD-MS為Waters公司產(chǎn)品。實施例1 hPLG-ΔΚ的制備
1. hPLG-ΔΚ基因的亞克隆以含人PLG全長cDNA序列的pDNR_LIB_hPLG質(zhì)粒作為模板，以上游引物SEQ ID N0:7和下游引物SEQ ID N0:8進行第一輪PCR，其中上游引物SEQ ID NO: 7中引入6個組氨酸殘基的編碼序列標簽，下游引物SEQ ID N0:8中加上損a I的酶切位點，反應條件94°C 5 min ； 94 °C 30 s,40°C 30 s，72°C 30 s，30 個循環(huán)；72°C 延伸 7 min，PCR產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、濃度測定。再以該產(chǎn)物為模板，以上游引物 SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8進行第二輪PCR，其中引物SEQ ID N0:9中含損ο I 酶切位點和^fer 2酶識別位點的編碼序列，PCR反應條件94°C 5 min ；94°C 30 s,40°C 30 s，72V 30 8，30個循環(huán)；721延伸7 min，PCR產(chǎn)物1. 0%瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、濃度測定。2. pGME-T-hPLG-ΔΚ質(zhì)粒的構(gòu)建將上述濃度測定后的hPLG-ΔΚ片段連接pGME_T 載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌T0P10，Amp-LB培養(yǎng)板篩選白斑，菌落PCR和測序鑒定突變體 pGME-T-hPLG-ΔΚ質(zhì)粒構(gòu)建成功。3. pPICZ α A- hPLG-ΔΚ質(zhì)粒的構(gòu)建將鑒定正確的pGME-T-hPLG-ΔΚ 以煬ο !,Xba I酶切，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、濃度測定后連接pPICZ α A載體，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌T0P10，涂布于含有25 Pg/mL Zeocin的LB固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，菌落PCR鑒定重組子。構(gòu)建結(jié)果以含全長人PLG基因cDNA序列的質(zhì)粒pDNR_LIB_hPLG為模板，經(jīng)第一輪、第二輪PCR在800 bp附近均顯示單一條帶，分別與理論計算的778 bp,792 bp相符(見圖1)。經(jīng)測序證實在指定位置進行了突變(見圖4，下劃線為定點突變的位置)。4.巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化與篩選將構(gòu)建的pPICZ α A- hPLG-ΔΚ質(zhì)粒以fee I 線性化，酚氯仿抽提進行純化濃縮，電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)巴斯德畢赤酵母GS115菌株后，涂布含 100 Pg/mL Zeocin YPDS培養(yǎng)板，待長出菌落后再用無菌芽簽挑單菌落，接種至含200 μδ/ mL、800 Pg/mL Zeocin的YPD培養(yǎng)板，篩選高拷貝重組子。同理進行pPICZ α A-hPLG-ΔΚ的轉(zhuǎn)化與篩選。5. hPLG-ΔΚ基因的表達從含800 Pg/mL Zeocin的YPD酵母培養(yǎng)板上挑選2個單克隆菌落，接種到30 mL的BMGY液體培養(yǎng)基中，250 RPM，30°C培養(yǎng)16-18 h，直到0D600達到3.0左右。等體積預冷的滅菌水洗滌，1500 rpm，4°C離心5 min，棄上清，重復洗滌一次。 菌體以15 mL的BMMY重懸，30°C搖床，250 rpm培養(yǎng)，每隔12 h取樣300 μ ，樣品12 000 rpm離心5 min，上清-20°C保存，直至培養(yǎng)72 h，其間每隔24 h補加甲醇(終濃度1%)。樣品以還原性12% SDS-PAGE檢測目的蛋白表達；纖維蛋白板法鑒定發(fā)酵液活性。表達結(jié)果SDS-PAGE檢測顯示各重組菌經(jīng)甲醇誘導表達24 h，在31 kDa處均出現(xiàn)單一條帶，與理論計算的分子量接近，誘導72 h時即達到峰值(見圖8)。6. hPLG-ΔΚ的純化與鑒定采用m-NTA親和介質(zhì)進行純化，層析柱(2.5 cm X 15cm)先以 A 液(0.05 mol/L KH2PO4 — Na2HPO4 緩沖液(pH 7. 4),0. 5 mol/L NaCl )平衡 5 個柱床體積，流速為2 mL/min;發(fā)酵液12 000 rpm離心5 min后，上清取35 mL上樣(流速 1 mL/min)，再以A液沖洗至A280近基線(流速2 mL/min)。依次以含5、10、500 mmol/L 咪唑的A液進行階段洗脫(流速2 mL/min)，收集各階段洗脫峰，15%還原性SDS-PAGE和纖維蛋白板法鑒定目的蛋白組份。合并活性組分，透析除鹽(透析液0. 02 mol/L KH2PO4 -Nei2HPO4 緩沖液(pH 7. 4),0. 15 mol/L NaCl )和 PEG 20 000 濃縮，冷凍抽干，_20°C保存?zhèn)溆?。取純化、透析后的hPLG-ΔΚ，以摩爾比100 1加入UK，37°C分別反應20min、40min、 60min,80min,6hU2hU8h,24 h，還原性SDS-PAGE分析最適激活時間。激活后反應液通過 Ni-NTA親和色譜去除UK，純化方法同上，洗脫液以0.02 mol/L KH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 3.0,0. 15 mol/L NaCl )透析、濃縮后冷凍干燥保存。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以(i 士 s)表
示，采用SPSS 12. 0軟件進行處理，兩均數(shù)間的比較采用t檢驗，P<0. 05為有統(tǒng)計學意義。純化和UK激活結(jié)果發(fā)酵液經(jīng)Ni-NTA親和層析純化，可見位于97 kDa的雜帶以及大部分的色素不能結(jié)合而流出，通過咪唑洗脫可得到純度90%以上的hPLG-ΔΚ。將 hPLG-ΔΚ經(jīng)UK激活12h后，再通過Ni-NTA親和層析去除UK，得到具有直接纖溶活性的 hPLM-ΔΚ。免疫印跡實驗表明hPLG-ΔΚ可與兔抗人PLG抗血清反應，證實為預期構(gòu)建的蛋白 (見圖11)。UK激活動力學通過還原性SDS-PAGE分析可見未激活hPLG-ΔΚ顯示單一條帶，而被UK激活為hPLm-ΔΚ后，由于蛋白水解作用失去一段小肽，顯示為分子量稍小的條帶(見圖 12)。實施例2 RGD-hPLG-ΔΚ的制備
1. pGME-T- RGD-hPLG-ΔΚ質(zhì)粒的構(gòu)建通過三輪PCR反應，第一輪以實施例1中構(gòu)建好 WpGME-T -hPLG-ΔΚ質(zhì)粒為模板，用上游引物SEQ ID N0:9和下游突變引物SEQ ID NO: 10 進行PCR ；第二輪以線性化的pGME-T -hPLG-ΔΚ質(zhì)粒為模板，用第一輪PCR片段為上游引物，與下游引物SEQ ID N0:8進行PCR;第三輪用第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以上游引物 SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8。PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖電泳、膠回收、濃度測定后連接pGME-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌T0P10，Amp-LB培養(yǎng)板篩選白斑，菌落PCR和測序鑒定pGME-T- RGD-hPLG-ΔΚ質(zhì)粒構(gòu)建成功。2. pPICZ α A-RGD-hPLG-ΔΚ 質(zhì)粒的構(gòu)建將鑒定正確的 pGME_T_ RGD-hPLG-ΔΚ 以 Xho I、Xba I酶切，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、濃度測定后連接pPICZ α A載體，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌riFlO，涂布于含有25 Pg/mL kocin的LB固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，菌落 PCR鑒定重組子。構(gòu)建結(jié)果以實施例1的pGME-T -hPLG-ΔΚ質(zhì)粒為模板，通過三輪PCR構(gòu)建了突變體RGD-hPLG-ΔΚ的cDNA片段(見圖2)；經(jīng)測序證實在指定位置進行了突變(見圖5，下劃線為定點突變的位置)。3.巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化與篩選將構(gòu)建的pPICZ α A- RGD- hPLG-ΔΚ質(zhì)粒以 Sac I線性化，酚氯仿抽提進行純化濃縮，電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)巴斯德畢赤酵母GS115菌株后， 涂布含100 Pg/mL Zeocin YPDS培養(yǎng)板，待長出菌落后再用無菌芽簽挑單菌落，接種至含200 Pg/mL、800 Pg/mL Zeocin的YPD培養(yǎng)板，篩選高拷貝重組子。按實施例1方法進行 pPICZ α A- RGD- hPLG-ΔΚ質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與篩選。4. RGD- hPLG-ΔΚ基因的表達從含800 Pg/mL Zeocin的YPD培養(yǎng)板上挑選2個單克隆菌落，接種到30 mL的BMGY液體培養(yǎng)基中，250 RPM，30°C培養(yǎng)16-18 h，直到0D600 達到3.0左右。等體積預冷的滅菌水洗滌，1500 rpm，4°C離心5 min，棄上清，重復洗滌一次。菌體以15 mL的BMMY重懸，30°C搖床，250 rpm培養(yǎng)，每隔12 h取樣300 μ ，樣品12 000 rpm離心5 min，上清_20°C保存，直至培養(yǎng)72 h，其間每隔24 h補加甲醇(終濃度1%)。 樣品以還原性12% SDS-PAGE檢測目的蛋白表達；纖維蛋白板法鑒定發(fā)酵液活性。表達結(jié)果SDS-PAGE檢測顯示各重組菌經(jīng)甲醇誘導表達24 h，在31 kDa處均出現(xiàn)單一條帶，與理論計算的分子量接近，誘導72 h時即達到峰值(見圖9)。5. RGD- hPLG-ΔΚ的純化與鑒定采用m-NTA親和介質(zhì)進行純化，層析柱(2.5 cm X15 cm)先以A液(0.05 mol/L KH2PO4 — Na2HPO4緩沖液(ρΗ 7·4)，0·5 mol/L NaCl )平衡 5個柱床體積，流速為2 mL/min;發(fā)酵液12 000 rpm離心5 min后，上清取35 mL上樣(流速1 mL/min)，再以A液沖洗至A280近基線(流速2 mL/min)。依次以含5、10、500 mmol/ L咪唑的A液進行階段洗脫(流速2 mL/min)，收集各階段洗脫峰，15%還原性SDS-PAGE和纖維蛋白板法鑒定目的蛋白組份。合并活性組分，透析除鹽(透析液0. 02 mol/L KH2PO4 -Na2HPO4 緩沖液(ρΗ 7. 4)，0. 15 mol/L NaCl )和 PEG 20 000 濃縮，冷凍抽干，_20°C保存?zhèn)溆?。取純化、透析后的RGD- hPLG-ΔΚ蛋白，以摩爾比100 1加入UK，37°C分別反應 20min、40min、60min、80min、6h、12h、18h、24 h，還原性 SDS-PAGE 分析最適激活時間。激活后反應液通過Ni-NTA親和色譜去除UK，純化方法同5所述，洗脫液以0.02 mol/L KH2PO4 -Na2HPO4緩沖液(ρΗ 3.0,0. 15 mol/L NaCl )透析、濃縮后冷凍干燥保存。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以G 士 S)表示，采用SPSS 12.0軟件進行處理，兩均數(shù)間的比較采用t 檢驗，P<0. 05為有統(tǒng)計學意義。純化和UK激活結(jié)果發(fā)酵液經(jīng)Ni-NTA親和層析純化，可見位于97 kDa的雜帶以及大部分的色素不能結(jié)合而流出，通過咪唑洗脫可得到純度90%以上的R⑶-hPLG-ΔΚ蛋白。將R⑶-hPLG-ΔΚ蛋白經(jīng)M激活12h后，再通過Ni-NTA親和層析去除UK，得到具有直接纖溶活性的RGD- hPLm-ΔΚ蛋白。免疫印跡實驗表明RGD- hPLG-ΔΚ蛋白可與兔抗人PLG 抗血清反應，證實為預期構(gòu)建的蛋白(見圖11)。UK激活動力學通過還原性SDS-PAGE分析可見未激活RGD-hPLG-ΔΚ蛋白顯示單一條帶，而被UK激活為RGD- hPLm-ΔΚ蛋白后，由于蛋白水解作用失去一段小肽，顯示為分子量稍小的條帶，經(jīng)光密度掃描分析顯示激活RGD-hPLG-Δ K顯著的速率比hPLG-ΔΚ要慢，兩者在24 h時的激活百分比無顯著差別(見圖12)。實施例3 RHP-hPLG-ΔΚ的制備
1. pGME-T-RHP-hPLG-ΔΚ質(zhì)粒的構(gòu)建通過三輪PCR反應，第一輪以實施例1中構(gòu)建好 WpGME-T -hPLG-ΔΚ質(zhì)粒為模板，用上游引物SEQ ID N0:9和下游突變引物SEQ ID NO: 11 進行PCR ；第二輪以線性化的pGME-T -hPLG-ΔΚ質(zhì)粒為模板，用第一輪PCR片段為上游引物，與下游引物SEQ ID N0:8進行PCR;第三輪用第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以上游引物 SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8。PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖電泳、膠回收、濃度測定后連接pGME-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌T0P10，Amp-LB培養(yǎng)板篩選白斑，菌落PCROXo I和 Xba I酶切測序鑒定pGME-T-RHP-hPLG-ΔΚ質(zhì)粒構(gòu)建成功。2. pPICZ α A-RHP-hPLG-ΔΚ質(zhì)粒的構(gòu)建將鑒定正確的 pGME-T- RHP -hPLG-ΔΚ 以 Xho I、Xba I酶切，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、濃度測定后連接pPICZ α A載體，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌T0P10，涂布于含有25 Pg/mL kocin的LB固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，菌落 PCR鑒定重組子。構(gòu)建結(jié)果以實施例1的pGME-T -hPLG-ΔΚ質(zhì)粒為模板，通過二輪PCR構(gòu)建了突變體RHP -hPLG-ΔΚ的cDNA片段(見圖3);經(jīng)測序證實在指定位置進行了突變(見圖6，下劃線為定點突變的位置)。3.巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化與篩選將構(gòu)建的pPICZ α A- RHP - hPLG-ΔΚ質(zhì)粒以 Sac I線性化，酚氯仿抽提進行純化濃縮，電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)巴斯德畢赤酵母GS115菌株后， 涂布含100 Pg/mL Zeocin YPDS培養(yǎng)板，待長出菌落后再用無菌芽簽挑單菌落，接種至含 200 Pg/mL、800 Pg/mL kocin的YPD培養(yǎng)板，篩選高拷貝重組子。按實施例1方法進行 pPICZ α A- RHP - hPLG-ΔΚ 的轉(zhuǎn)化與篩選。4. RHP - hPLG-ΔΚ基因的表達從含800 Pg/mL kocin的YPD培養(yǎng)板上挑選2個單克隆菌落，接種到30 mL的BMGY液體培養(yǎng)基中，250 RPM，30°C培養(yǎng)16-18 h，直到0D600 達到3.0左右。等體積預冷的滅菌水洗滌，1500 rpm，4°C離心5 min，棄上清，重復洗滌一次。菌體以15 mL的BMMY重懸，30°C搖床，250 rpm培養(yǎng)，每隔12 h取樣300 μ ，樣品12 000 rpm離心5 min，上清_20°C保存，直至培養(yǎng)72 h，其間每隔24 h補加甲醇(終濃度1%)。 樣品以還原性12% SDS-PAGE檢測目的蛋白表達；纖維蛋白板法鑒定發(fā)酵液活性。表達結(jié)果SDS-PAGE檢測顯示各重組菌經(jīng)甲醇誘導表達M h，在31 kDa處均出現(xiàn)單一條帶，與理論計算的分子量接近，誘導72 h時即達到峰值(見圖10)。5. RHP - hPLG-ΔΚ的純化與鑒定采用Ni-NTA親和介質(zhì)進行純化，層析柱(2. 5 cm X 15 cm)先以 A 液(0.05 mol/L Iffl2PO4 — Nei2HPO4 緩沖液(pH 7. 4),0. 5 mol/L NaCl )平衡5個柱床體積，流速為2 mL/min;發(fā)酵液12 000 rpm離心5 min后，上清取35 mL 上樣(流速1 mL/min)，再以A液沖洗至A^O近基線(流速2 mL/min)。依次以含5、10、 500 mmol/L咪唑的A液進行階段洗脫(流速2 mL/min)，收集各階段洗脫峰，15%還原性 SDS-PAGE和纖維蛋白板法鑒定目的蛋白組份。合并活性組分，透析除鹽(透析液0. 02 mol/L Iffl2PO4 — Nei2HPO4 緩沖液(pH 7. 4),0. 15 mol/L NaCl )和 PEG 20 000 濃縮，冷凍抽干，-20°C保存?zhèn)溆?。取純化、透析后的RHP - hPLG-ΔΚ，以摩爾比100 1加入UK，37°C分別反應20min、 40min,60min,80min,6h, 12h, 18h,24 h，還原性SDS-PAGE分析最適激活時間。激活后反應液通過Ni-NTA親和色譜去除UK，純化方法同5所述，洗脫液以0. 02 mol/L KH2PO4 一 Na2HPO4 緩沖液(pH 3.0,0. 15 mol/L NaCl )透析、濃縮后冷凍干燥保存。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以(i 士 s)表示，采用SPSS 12.0軟件進行處理，兩均數(shù)間的比較采用t 檢驗，P<0. 05為有統(tǒng)計學意義。純化和UK激活結(jié)果發(fā)酵液經(jīng)Ni-NTA親和層析純化，可見位于97 kDa的雜帶以及大部分的色素不能結(jié)合而流出，通過咪唑洗脫可得到純度90%以上的RHP - hPLG-ΔΚ。將 RHP - hPLG-ΔΚ經(jīng)UK激活1 后，再通過Ni-NTA親和層析去除UK，得到具有直接纖溶活性的R⑶-hPLm-ΔΚ (未顯示)。免疫印跡實驗表明RHP - hPLG-ΔΚ可與兔抗人PLG抗血清反應，證實為預期構(gòu)建的蛋白(見圖11)。UK激活動力學通過還原性SDS-PAGE分析可見被UK激活為RHP - hPLm-ΔΚ后，由于蛋白水解作用失去一段小肽，顯示為分子量稍小的條帶，經(jīng)光密度掃描分析顯示UK激活RGD-hPLG-Δ K顯著的速率比hPLG-ΔΚ要慢，而RHP-hPLM-ΔΚ與hPLG-ΔΚ無顯著差別，且三者在24 h時的激活百分比無顯著差別(見圖12)。實施例4 hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ、RHP-hPLG-ΔΚ 的活性測定
分別取hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ和RHP-hPLG-ΔΚ凍干品，以0. 5 mL雙蒸水復溶，BCA法測定蛋白濃度后，再以0. 02 mol/L PBS分別調(diào)整hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ至相同濃度0. 2 mg/mL,0. 4 mg/mL。1. hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ 和 RHP-hPLG-ΔΚ 的纖溶活性
1 %瓊脂糖凝膠板中含有0.05 mol/L PBS CpH 7. 4)、1.5%纖維蛋白、800 U/mL UK、 0. 02% NaN3。凝膠打孔后，各孔中加等體積的樣品液或PLG標準品，37°C濕盒保溫過夜。游標卡尺測定各孔溶圈直徑，以溶圈直徑的平方與標準品活性作標準曲線，計算樣品的比活性。2. RGD-hPLG-ΔΚ的抗血小板聚集活性
兔心臟取血18 mL加入2 mL 0.109 mol/L的枸椽酸鈉溶液充分混勻，800 rpm離心
10 min，取上清為富血小板血漿(PRP);剩余血液再以2500 rpm離心20 min，取上清即為貧
血小板血漿(PPP)。血細胞計數(shù)板計數(shù)，PPP調(diào)節(jié)PRP使血小板濃度為2. 5-4. OX 108/mL。
將PRP、PPP轉(zhuǎn)移至硅化的三角瓶中室溫保存，1 h內(nèi)用血小板聚集儀分別測定hPLG-ΔΚ、
RGD-hPLG-ΔΚ及其激活產(chǎn)物的血小板聚集抑制率(Ri)。測定時，將200 μ PRP加入攪拌
子后調(diào)零，加入5 μ ADP (終濃度lOumol/L)，反應5 min，記錄最大聚集率(PAGm)，以此為
空白對照(PAGm. blank)；樣品測定時，200 μ PRP 分別加入 5 μ 0.4 mg/mL PLG, PLM R
hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ、hPLM-ΔΚ、RGD-hPLM-ΔΚ 制備液，室溫反應 15min 后檢測樣品 PAGm
(PAGm. sample) ；hPLG-ΔΚ的測定方法同上。血小板聚集抑制率的計算公式為
權(quán)利要求
1.一種人纖溶酶原功能性突變體，為人纖溶酶原蛋白的ftX)544 - Asn791多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2.權(quán)利要求1所述人纖溶酶原功能性突變體的編碼基因，其核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
3.一種人纖溶酶原功能性突變體，是將權(quán)利要求1所述人纖溶酶原功能性突變體中的 Pro559突變?yōu)锳sp559，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.權(quán)利要求3所述人纖溶酶原功能性突變體的編碼基因，其核苷酸序列如SEQID NO:4所示。
5.一種人纖溶酶原功能性突變體，是將權(quán)利要求1所述人纖溶酶原功能性突變體中的 Gly56tl突變?yōu)镠is56°，其氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。
6.權(quán)利要求5所述人纖溶酶原功能性突變體的編碼基因，其核苷酸序列如SEQID N0:6所示。
7.權(quán)利要求1所述人纖溶酶原功能性突變體的制備方法，其特征在于包括以下步驟 以含人纖溶酶原全長cDNA序列的質(zhì)粒為模板，設計上游引物SEQ ID N0:7和下游引物SEQ ID N0:8進行第一輪PCR;再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，設計上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8進行第二輪PCR;第二輪PCR產(chǎn)物連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以巴斯德畢赤酵母進行表達，表達產(chǎn)物即為權(quán)利要求1所述人纖溶酶原功能性突變體。
8.權(quán)利要求3所述人纖溶酶原功能性突變體的制備方法，其特征在于包括以下步驟 以含人纖溶酶原全長cDNA序列的質(zhì)粒為模板，以上游引物SEQ ID N0:7和下游引物SEQ ID NO:8進行第一輪PCR;以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，以上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8進行第二輪PCR ;PCR產(chǎn)物連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建質(zhì)粒；以構(gòu)建的質(zhì)粒為模板，用上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID NO: 10進行第三輪PCR ；再以線性化的質(zhì)粒為模板，以第三輪PCR產(chǎn)物為上游引物，與下游引物SEQ ID N0:8進行第四輪PCR;最后以第四輪PCR產(chǎn)物為模板，以上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8進行第五輪 PCR ；第五輪PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以巴斯德畢赤酵母GS115菌株進行表達，表達產(chǎn)物即為權(quán)利要求3所述人纖溶酶原功能性突變體。
9.權(quán)利要求5所述人纖溶酶原功能性突變體的制備方法，其特征在于包括以下步驟 以含人纖溶酶原全長cDNA序列的質(zhì)粒為模板，以上游引物SEQ ID N0:7和下游引物SEQ ID N0:8進行第一輪PCR;以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID NO:8進行第二輪PCR ；PCR產(chǎn)物連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建質(zhì)粒；以構(gòu)建的質(zhì)粒為模板， 用上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID NO: 11進行第三輪PCR ；再以線性化質(zhì)粒為模板，以第三輪PCR產(chǎn)物為上游引物，與下游引物SEQ ID N0:8進行第四輪PCR;最后以第四輪PCR產(chǎn)物為模板，以上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID NO:8進行第五輪PCR ；第五輪PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，所得產(chǎn)物以巴斯德畢赤酵母GSl 15菌株進行表達，表達產(chǎn)物即為權(quán)利要求5所述人纖溶酶原功能性突變體。
10.權(quán)利要求1、3或5所述人纖溶酶原功能性突變體在制備預防或治療炎癥、腫瘤、血栓、阿茨海默或黃斑水腫疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了人纖溶酶原功能性突變體，分別為hPLG- K人纖溶酶原蛋白的Pro544-Asn791多肽；RGD-hPLG- KhPLG- K中的Pro559突變?yōu)锳sp559；和RHP-hPLG- KhPLG- K多肽的Gly560突變?yōu)镠is560。本發(fā)明還公開了上述功能性突變體的制備方法，是以含人纖溶酶原全長cDNA序列的質(zhì)粒為模板進行PCR后構(gòu)建質(zhì)粒，用巴斯德畢赤酵母進行表達，獲得產(chǎn)物。本發(fā)明的功能性突變體兼具纖溶與抗血小板聚集或抗纖維蛋白單體聚合作用的雙重功能。
文檔編號C12N15/81GK102199587SQ20111007113
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者吳敬源, 吳茂材, 張鑫涌, 楊健忠, 陳振林, 陳武, 黃智慧 申請人:廣東藥學院