專利名稱：流感病毒一步rt-pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域中的PCR試劑盒，尤其涉及一種流感病毒一步 RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction，反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反 應)檢測試劑盒。
背景技術：
流感病毒屬于正粘病毒科，分節(jié)段單股負鏈RNA病毒。根據其核蛋白和基質蛋白 抗原性不同，流感病毒主要分為A、B和C型或者稱為甲、乙和丙三種類型。其中A型流感 病毒可以感染人類、禽類和其他一些哺乳動物，如豬等。而B型和C型流感病毒主要是感 染人類。據流行病學調查顯示，目前引起人群流行性感冒流感的主要是流感病毒A型和B 型。2009年4月在墨西哥暴發(fā)并導致全球廣泛傳播和數(shù)百人死亡的流感病毒被命名為甲型 HlNl流感病毒，該病毒屬于A型流感病毒的Hmi亞型，它是豬流感病毒，人流感病毒和禽流 感病毒通過基因片段重組后產生的一種新型混合型病毒株。針對流感病毒建立快速高效的 實驗室檢測技術，對于疑似病人的及時診斷和治療以及衛(wèi)生檢疫部門和國家疾控部門開展 有效的傳染病監(jiān)控和流行病學調查研究等都具有非常重要的意義。根據防控甲流的實際需 要，建立了在一個反應管內能同時篩查A型B型和新型甲型Hmi流感病毒的RT-PCR技術， PCR技術的優(yōu)點有高靈敏度、高特異性、高精確性，為快速檢測工作中發(fā)揮了重要作用。目前在感染的早期及時采用抗病毒類藥物治療流感患者效果顯著治愈率高因此 為了早診斷早治療針對疑似患者的流感病毒實驗室快速篩查技術顯得非常重要且意義重 大實時熒光定量RT-PCR技術是一項快速準確和特異的流感病毒核酸檢測技術。但是該技 術的主要缺點是由于熒光標記探針的使用造成檢測成本很高。此外當采用熒光RT-PCR技 術同時檢測A型B型和甲型Hmi等多種流感病毒型別時實驗操作將變得非常繁瑣成本也 會成倍增長。臨床醫(yī)院等在應對全球性流感大流行的疫情監(jiān)控工作中建立低成本，能同時 檢測流感病毒多種型別的普通多重RT-PCR技術顯得更具實用價值，多重RT-PCR技術是在 單一 RT-PCR技術的基礎上發(fā)展起來的新技術通過多對引物組合，可以實現(xiàn)在一個PCR反應 體系中同時擴增多個靶序列這樣即節(jié)約時間和精力又節(jié)約了試劑，并且其擴增的特異性和 效率與單一 PCR相當。因此該技術非常適合于實驗室用于應對長時期大樣本的臨床篩檢任 務。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就在于于克服現(xiàn)有技術存在的缺點和不足，提供一種流感病毒一步 RT-PCR檢測試劑盒。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的1、流感病毒一步RT-PCR檢測試劑盒(簡稱試劑盒)本試劑盒是在對流感病毒核酸序列分析的基礎上，選取保守基因序列設計出三對 特異性引物，利用PCR技術對流感病毒進行檢測。此技術不僅縮短了操作時間，減少了污染，也降低了樣品診斷的成本，具有潛在的應用價值。在按下述方法設計的引物存在下，在PCR儀中，對病毒核酸進行PCR擴增，來實現(xiàn) 對流感病毒的檢測。具體地說，本試劑盒包括一步hRT-PCR Buffer、陽性對照、陰性對照、三對特異性 引物和 Enzyme Mix ；①依據流感病毒A型的M基因設計特異性引物AF 5 ’ -ATTCTAACCGAGGTCGAAACGT-3’ 22bp，AR :5，-GACAAAGCGTCTACGCTGCAGTC-3，23bp ；依據流感病毒B型的NS基因設計特異性引物BF :5，-AGGGACATGAACAACAAAGATT-3，22bp,BR :5’ -GATGTCAGCTATTATGGAGCTC-3’ 22bp ；依據流感病毒甲型Hmi型的HA基因設計特異性引物HlNlF 5，-AAATAACATTMGAAGCAACTGGT-3，23bp，HlNlR :5，-GAGGCTGGTGTTTATRGCACCC-3，22bp ；②陽性對照分別連接有設計流感病毒A、B型、甲型Hmi型引物的基因保守序列的pGBKT-7克 隆載體；③陰性對照RNase Free H2O ；④5 X RT-PCR Buffer 配制
Tris-HCl250mMKCl375mMMgCl215mMDTT50mMdNTPIOmM配置混合后于冰箱-20 V保存；⑤ Enzyme Mix 配制Tris · Cl KCl DTT EDTA
Nonidet P-40 Tween 20 甘油 iTaq 酶 M-MLV 酶配置混合后于冰箱-20 V保存。2、試劑盒的使用方法①病毒核酸的提取A、首先在緩沖液1、2中加入無水乙醇，分別加入25ml和30ml無水乙醇；在漂洗液 中力口入 30 μ g/ml carrier RNA ；B、取30 μ 1蛋白酶放入1. 5ml離心管中；C、將標本(如咽拭子、痰液等)取200 μ 1加入此管中，充分混勻；D、再在每管分別加入200 μ 1漂洗液(含30 μ g/ml carrier RNA)，混勻振蕩30s， 70°C溫育 IOmin ；E、加入250 μ 1無水乙醇，充分混勻振蕩30s，室溫裂解5min ；F、將上述裂解液加入離心柱中，SOOOrpm，離心lmin，棄收集管中的離心液。濾柱仍 放回收集管上，將步驟③剩余的混合液全部吸入濾柱中，離心后棄離心液；G、濾柱中加入500 μ 1緩沖液1，12000rpm，離心lmin，棄收集管中的離心液；H、另取一支干凈的2ml收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于濾柱中加 Λ 500 μ 1緩沖液2，12000rpm,離心lmin,重復步驟⑧一次；I、將濾柱移到一個干凈的收集管中，12000rpm,離心!Bmin，后將濾柱放在 370C 15min以干燥濾膜；J、將濾柱放在1. 5ml Eppendorf管上，向濾柱中加入50ulRNase_free H2O,室溫靜 置anin。12000rpm，離心2min，收集離心液即為提取的核酸。 ②一步RT-PCR擴增(每份25ul體系)取5ul病毒核酸作為模板，同時加入20ul —步RT-PCR反應液至PCR管中進行PCR擴增。A、一步RT-PCR反應液(mix)的配制
20mM 80mM ImM 0. ImM 0. 5% 0. 5% 50% 2. 5U/ul 2. 5U/ul一步 5 X RT-PCR buffer6ul
Enzyme Mix5ul三對特異性引物F/R各Iul
Rnase Free H2O_3ul_
反應液體積20ulB、一步RT-PCR反應程序
a、50 °C30min
b、95°C5min
c、94°C30s
d、60°C30s
e、72°CImin
f> Go toc，45個循環(huán)；
C、檢測儀器本發(fā)明使用ABI Veriti Thermal Cycler PCR 儀進行檢測。D、結果判斷所得到的DNA產物，使用2%的瓊脂糖凝膠跑電泳，使用照膠儀來分析檢測。如泳道中無條帶顯示則為陰性，有條帶顯示為陽性；如泳道只有一條帶顯示為230bp為流感病毒A型；如泳道只有一條帶顯示為5(^bp為流感病毒B型；如泳道有兩條帶顯示為230bp和155bp為流感病毒甲型Hmi型。本發(fā)明具有下列優(yōu)點和積極效果①測時間周期短、檢測效率高；②檢測病毒特異性高，準確率高；③能進行病毒定性分析；④檢測靈敏度比免疫學檢測方法靈敏度高；⑤操作簡單、易于推廣；⑥實驗結果重復性好。
具體實施例方式一、實施例1-—流感病毒一步RT-PCR檢測試劑盒檢測疑似流感病毒感染患者咽拭子標本12份，各取標本液200 μ 1進行病毒核酸 提取。1、試劑盒的組成本試劑盒包括一步^cRT-PCR Buffer、陽性對照、陰性對照、三對特異性引物和 EnzymeMix ；2、依據流感病毒A型的M基因設計特異性引物為AF :5’ -ATTCTAACCGAGGTCGAAACGT-3，22bp,AR :5，-GACAAAGCGTCTACGCTGCAGTC-3，23bp ；
依據流感病毒B型的NS基因設計特異性引物為BF :5，-AGGGACATGAACAACAAAGATT-3，22bp,BR :5’ -GATGTCAGCTATTATGGAGCTC-3’ 22bp ；依據流感病毒甲型Hmi型的HA基因設計特異性引物為
HlNlF :5’ -AAATAACATTMGAAGCAACTGGT-3’ 23bp, HlNlR :5，-GAGGCTGGTGTTTATRGCACCC-3，22bp。 3,5XRT-PCR Buffer 配制
Tris-HCl
KCl
MgCl2
DTT
dNTP
配置混合后于冰箱-20°C保存； 4、Enzyme Mix 配制
Tris · Cl KCl DTT EDTA
Nonidet P-40 Tween 20 甘油 iTaq 酶 M-MLV 酶
250mM 375mM 15mM 50mM IOmM
20mM 80mM ImM 0. ImM 0. 5% 0. 5% 50% 2. 5U/ul 2. 5U/ul配置混合后于冰箱-20 °C保存。5、病毒核酸的提?、偈紫仍诰彌_液1、2中加入無水乙醇，分別加入25ml和30ml無水乙醇；在漂洗液 中力口入 30yg/ml carrier RNA0②取30 μ 1蛋白酶放入1. 5ml離心管中。③將標本(如鼻/咽拭子、液化的痰液、胸水、灌洗液等)取200 μ 1加入此管中， 充分混勻。④再在每管分別加入200 μ 1漂洗液(含30 μ g/ml carrier RNA)，混勻振蕩30s， 70°C溫育 lOmin。⑤加入250 μ 1無水乙醇，充分混勻振蕩30s，室溫裂解5min。⑥將上述裂解液加入離心柱中，SOOOrpm,離心lmin，棄收集管中的離心液。濾柱仍
7放回收集管上，將步驟③剩余的混合液全部吸入濾柱中，離心后棄離心液。⑦濾柱中加入500 μ 1緩沖液1，12000rpm，離心lmin，棄收集管中的離心液。⑧另取一支干凈的2ml收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于濾柱中加 入500 μ 1緩沖液2，12000rpm,離心lmin。重復步驟⑧一次。⑨將濾柱移到一個干凈的收集管中，12000rpm,離心;3min，后將濾柱放在 370C 15min以干燥濾膜。⑩將濾柱放在1. 5ml Eppendorf管上，向濾柱中加入50ulRNase_free H2O,室溫靜 置anin。12000rpm，離心2min，收集離心液即為提取的核酸。6、一步RT-PCR擴增(每份25ul體系)取5ul病毒核酸作為模板，同時加入20ul —步RT-PCR反應液至PCR管中進行PCR擴增。A、一步RT-PCR反應液(mix)的配制
一步 5 X RT-PCR buffer6ul
Enzyme Mix5ul三對特異性引物F/R各Iul
Rnase Free H2O_3ul
反應液體積20ulB、一步 RT-PCR 反應程序a、50°C 30minb、95°C 5minc、94°C 30sd、60°C 30se、72°C lminf、Go to c，45 個循環(huán)；C、檢測儀器本發(fā)明使用ABI Veriti Thermal Cycler PCR 儀進行檢測。D、結果判斷所得到的DNA產物，使用2 %的瓊脂糖凝膠跑電泳，使用照膠儀來分析檢測。膠塊有1個泳道只有一條帶顯示為230bp，則判斷為流感病毒A型；膠塊有3個泳道有兩條帶顯示，其中一條顯示為230bp，另外一條為15^ρ，則判斷 為甲型Hmi流感病毒；膠塊有2個泳道只有一條帶顯示為5(^bp，則判斷為流感病毒B型。最終，12份疑似流感病毒感染患者咽拭子標本中檢出流感病毒A型陽性1例，流感 病毒B型陽性2例，流感病毒甲型Hmi型陽性3例，檢出率為100%。二、實施例2用上述方法對另外20份疑似流感病毒感染患者痰液標本進行檢測，檢出流感病 毒A型陽性2例，流感病毒B型陽性4例，流感病毒甲型Hmi型陽性5例，檢出率為100 %。
權利要求
1. 一種流感病毒一步RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于本試劑盒包括一步hRT-PCR Buffer、陽性對照、陰性對照、三對特異性引物和EnzymeMix ；①依據流感病毒A型的M基因設計特異性引物 AF :5’ -ATTCTAACCGAGGTCGAAACGT-3，22bp, AR :5’ -GACAAAGCGTCTACGCTGCAGTC-3’ 23bp ； 依據流感病毒B型的NS基因設計特異性引物 BF :5’ -AGGGACATGAACAACAAAGATT-3’ 22bp,BR :5’ -GATGTCAGCTATTATGGAGCTC-3’ 22bp ； 依據流感病毒甲型Hmi型的HA基因設計特異性引物 HlNlF :5’ -AAATAACATTMGAAGCAACTGGT-3’ 23bp, HlNlR :5’ -GAGGCTGGTGTTTATRGCACCC-3’ 22bp ；②陽性對照分別連接有設計流感病毒A、B型、甲型Hmi型引物的基因保守序列的pGBKT-7克隆載體；③陰性對照 RNase Free H2O ；④5 X RT-PCR Buffer 配制Tris-HCl250mMKCl375mMMgCl215mMDTT50mMdNTPIOmM配置混合后于冰箱-20°C保存；⑤EnzymeMix配制Tris · Cl20mMKCl80mMDTTImMEDTA0. ImMNonidet P-400. 5%Tween 200. 5%甘油50%Taq 酶2.5U/ulM-MLV 酶2.5U/ul配置混合后于冰箱-20°C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種流感病毒一步RT-PCR檢測試劑盒，涉及生物技術領域中的PCR試劑盒。本試劑盒包括一步5xRT-PCR Buffer、陽性對照、陰性對照、三對特異性引物和Enzyme Mix；依據流感病毒A型的M基因設計特異性引物，AF5'-ATTCTAACCGAGGTCGAAACGT-3'，AR5'-GACAAAGCGTCTACGCTGCAGTC-3'；依據流感病毒B型的NS基因設計特異性引物；依據流感病毒甲型H1N1型的HA基因設計特異性引物。本發(fā)明測時間周期短、檢測效率高；檢測病毒特異性高，準確率高；能進行病毒定性分析；檢測靈敏度比免疫學檢測方法靈敏度高；操作簡單、易于推廣；實驗結果重復性好。
文檔編號C12Q1/68GK102146485SQ20111007131
公開日2011年8月10日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權日2011年3月24日
發(fā)明者劉為勇, 劉映樂, 吳建國, 李彤亞, 湯行春, 熊鷹, 王妍, 石康, 程議鋒, 章琪, 胡曉靜, 艾洪武, 項榮 申請人:武漢大學