專利名稱：檢測(cè)油藏中古菌種群的檢測(cè)型基因芯片及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因芯片領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)油藏中古菌種群的檢測(cè)型基因芯片及其用途。
背景技術(shù)：
隨著微生物技術(shù)在石油天然氣勘探開發(fā)和環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，相關(guān)微生物的檢測(cè)鑒定及群落分析也成為重要的研究?jī)?nèi)容。在油藏極端環(huán)境下，有豐富的微生物種群，其中，古菌廣泛存在并發(fā)揮重要代謝作用，但古菌種類繁多、豐度較低，且難以利用實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)法進(jìn)行分類檢測(cè)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLPs)、AFLPs及變性梯度凝膠電泳(DGGE)等分子生物學(xué)技術(shù)推動(dòng)了石油微生物研究的發(fā)展。然而，目前常用的分子多態(tài)性技術(shù)存在許多不足(1)操作較復(fù)雜，人為干預(yù)環(huán)節(jié)多，準(zhǔn)確性差；( 檢測(cè)通量低， 提供信息少，且耗時(shí)費(fèi)力。這給在及時(shí)有效地對(duì)古菌群落進(jìn)行調(diào)控帶來(lái)了不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種檢測(cè)油藏中古菌種群的檢測(cè)型基因芯片及其用途，可以在分子水平下對(duì)微生物群落進(jìn)行研究，認(rèn)識(shí)不同環(huán)境條件下古菌種群信息，確定優(yōu)勢(shì)種群，為微生物技術(shù)研究水平和現(xiàn)場(chǎng)實(shí)施效果提高提供方法 ■石出。本發(fā)明所提供的用于油藏中古菌種群的檢測(cè)型基因芯片及使用方法，是分析試劑油藏中存在的古菌種類，針對(duì)其16S核糖體RNA設(shè)計(jì)屬特異性探針，以待檢測(cè)樣品的基因組 DNA為模板，用標(biāo)記的引物組進(jìn)行擴(kuò)增，然后將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與生物芯片上的探針進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果確定油藏古菌的種類。一種檢測(cè)油藏中古菌種群的檢測(cè)型基因芯片，其制備方法是(一 )設(shè)計(jì)油藏古菌特異性探針(1)油藏樣品采集；(2)油藏古菌16S核糖體RNA序列收集以通用引物，對(duì)古菌16S核糖體RNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，并測(cè)序；(3)古菌特異性探針依據(jù)上述測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)油藏古菌屬特異性探針，芯片上的條碼序列探針序列結(jié)構(gòu)通式為NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-條碼序列，即探針的5'端氨基修飾，氨基旁邊連接poly-T15 ；(二)制備基因芯片使用點(diǎn)樣儀將探針以設(shè)定的順序固定到醛基化修飾的玻片上，基因芯片是由針對(duì) 18個(gè)古菌屬的83條探針、點(diǎn)樣的陽(yáng)性質(zhì)控QC、點(diǎn)樣的陰性質(zhì)控BC、雜交的陰性質(zhì)控NC和雜交的陽(yáng)性質(zhì)控PC組成的陣列；探針序列如下表
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)油藏中古菌種群的檢測(cè)型基因芯片，其特征是其制備方法是(一)設(shè)計(jì)油藏古菌特異性探針(1)油藏樣品采集；(2)油藏古菌16S核糖體RNA序列收集以通用引物，對(duì)古菌16S核糖體RNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，并測(cè)序；(3)古菌特異性探針依據(jù)上述測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)油藏古菌屬特異性探針，芯片上的條碼序列探針序列結(jié)構(gòu)通式為NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-條碼序列，即探針的5 ‘端氨基修飾，氨基旁邊連接poly-T15 ；(二)制備基因芯片使用點(diǎn)樣儀將探針以設(shè)定的順序固定到醛基化修飾的玻片上，基因芯片是由針對(duì)18 個(gè)古菌屬的83條探針、點(diǎn)樣的陽(yáng)性質(zhì)控QC、點(diǎn)樣的陰性質(zhì)控BC、雜交的陰性質(zhì)控NC和雜交的陽(yáng)性質(zhì)控PC組成的陣列；QC是一端帶有Hex標(biāo)記，另一端氨基修飾的寡核苷酸探針，用于觀察芯片點(diǎn)樣和固定的效率，其序列為 NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGAGTGCTTGGTGCCATAAC-HEX ；BC 為 50 % 的二甲亞砜DMS0，用于質(zhì)控點(diǎn)樣過(guò)程中有無(wú)樣品殘留污染；NC是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，與雜交液中的所有待檢測(cè)序列不會(huì)雜交，用于觀察有無(wú)非特異雜交，其序列為NH2-TTTTTTTTT TTTTTTGCAACCACCACCGGAGG ；PC是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，可以與雜交液中添加的熒光標(biāo)記的互補(bǔ)序列雜交，用于雜交過(guò)程的質(zhì)控，其序列為NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGGTATCGCGA CCGCATCCCAATCT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)油藏中古菌種群的檢測(cè)型基因芯片，其特征是其使用方法是(a)核酸擴(kuò)增分別以油藏樣品基因組DNA為模板，用上游引物和下游引物PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增體系如下，包括0. 2mM dNTPs, IXQiagen PCR buffer，添加 MgC12 至 2mM，pH 8.7， 1單位HotStarTaq DNA Polymerase和0. Ing模版DNA,上下游引物；25 μ 1擴(kuò)增體系中，引物的濃度為0. 02μΜ；擴(kuò)增參數(shù)為先95°C 15分鐘；然后94°C 30秒，55 °C 1分鐘，72 °C 90秒，35個(gè)循環(huán)；最后72°C 10分鐘；4°C保存；(b)基因芯片雜交取10 μ 1 PCR產(chǎn)物加到20 μ 1雜交緩沖液中，98°C變性5分鐘，冰浴，雜交混合物加入到點(diǎn)陣中反應(yīng)。然后將芯片放置42°C水浴中雜交1小時(shí)；取出玻片分別在兩種洗液中42°C 各洗2min，洗液I 0. 3XSSC/0. 1% SDS，洗液II :0. 06XSSC ；最后，玻片稍離心甩干；(c)數(shù)據(jù)分析使用芯片掃描儀掃描芯片，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度及掃描圖像分析目的油藏古菌群落結(jié)構(gòu)。
3.—種檢測(cè)油藏中古菌種群的檢測(cè)型基因芯片，其特征是其用途是基因芯片是用于檢測(cè) Archaeoglobus、Geoglobus、Methanobacterium、MethanocalcuiusΛ Methanococco ides λ Methanoculleus、Methanoplanus、Methanothermococcus、Methanothrix/Methanosaeta> Pyrodictium、Thermococcus> Thermofilum> Ferroglobus> Methanocella、Methanosarcina、Methanothermobacter、Methermicoccus 或者 Picrophilus的寡核苷酸陣列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)油藏中古菌群落的檢測(cè)型基因芯片及其用途。該基因芯片是在載體材料上設(shè)置包括鑒定油藏古菌屬的探針，還包括由此衍生的探針以及每個(gè)探針的互補(bǔ)探針及其延伸探針。特異性探針可以鑒定18個(gè)屬的油藏古菌；該方法是以待檢測(cè)樣品的基因組DNA為模板，用標(biāo)記的引物組進(jìn)行擴(kuò)增，然后將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與生物芯片上的探針進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果確定油藏古菌的種類。本發(fā)明將為研究油藏環(huán)境古菌群落組成、結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)等提供一種快速、準(zhǔn)確、高通量的工具。同時(shí)還可以在基因水平上了解微生物提高采收率的機(jī)理，為提高微生物采油技術(shù)的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)施效果提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102329855SQ20111007142
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者安申法, 宋智勇, 宋永亭, 汪衛(wèi)東, 趙鳳敏, 郭遼原, 高光軍 申請(qǐng)人:中國(guó)石油化工股份有限公司, 中國(guó)石油化工股份有限公司勝利油田分公司采油工藝研究院