專利名稱：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 一種抗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體及其制備，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
用雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體(Monoclonal Antibody, McAb)是近些年來在免疫學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中顯著成就之一。單克隆抗體純度高、專一性強(qiáng)，較常規(guī)的免疫學(xué)方法優(yōu)越，為標(biāo)準(zhǔn)化提供了機(jī)會(huì)。單克隆抗體以其嚴(yán)格的識(shí)別特異性已滲透到科學(xué)研究的各個(gè)方面，在病原體的抗原分析、結(jié)構(gòu)蛋白功能及其作用機(jī)理、疾病診斷的研究等方面得到了廣泛的應(yīng)用。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome,PRRS)是由PRRS病毒變異株引起的，該病以來勢(shì)兇猛、發(fā)病突然、傳播迅速、死亡率高、治愈率低為主要特點(diǎn)，尤其以保育豬、育肥豬的發(fā)病率較高，母豬發(fā)生流產(chǎn)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的危害和重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征的檢測(cè)技術(shù)主要有病毒分離、免疫過氧化物單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)、間接免疫熒光(IFA)、RT-PCR等方法，但檢測(cè)所需時(shí)間長，成本昂貴。建立一種敏感、特異、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)手段勢(shì)在必行，而獲得特異性單克隆抗體為其提供了物質(zhì)保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以生物技術(shù)手段純化谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-GP5 (GST-GP5) 融合蛋白，制備抗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白的雜交瘤細(xì)胞株及其單克隆抗體，本發(fā)明的單克隆抗體敏感、特異性強(qiáng)，只對(duì)GP5蛋白有抗性，而對(duì)GST蛋白無抗性，為進(jìn)一步建立特異、敏感、快速的PRRS病毒檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一株抗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為CGMCC No. 4651。本發(fā)明還提供了由保藏號(hào)為CGMCC No. 4651的雜交瘤細(xì)胞株制備的單克隆抗體， 抗體亞型為IgA型。本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)GST-GP5融合蛋白有反應(yīng)性，對(duì)GST沒有反應(yīng)性，對(duì)PRRS 病毒GP5蛋白具有特異性反應(yīng)。本發(fā)明還提供了該單克隆抗體的制備方法，其制備過程如下根據(jù)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白中第32-65個(gè)氨基酸和第 127-200個(gè)氨基酸設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，并在引物中引入12個(gè)氨基酸，S卩SGGRGGSGGRGG作為連接橋段，采用PCR的方法分別擴(kuò)增高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白中第32-65個(gè)氨基酸基因序列及第127-200個(gè)氨基酸基因序列，這兩段序列利用上述12個(gè)氨基酸作為連接橋段，連接成一個(gè)大片段；將上述連接片段產(chǎn)物酶切處理，克隆于攜帶GST的原核表達(dá)載體pGEX-6p-l中；測(cè)序鑒定，用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得GST-GP5 融合蛋白；用純化的GST-GP5融合蛋白免疫Balb/c雌性小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合，用間接ELISA方法進(jìn)行篩選，用含GST標(biāo)簽的其它抗原篩選GST抗原，篩選出能夠分泌對(duì)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白有反應(yīng)性而對(duì)GST沒有反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞上清液中或從注射雜交瘤細(xì)胞后的動(dòng)物腹水中獲取單克隆抗體。其中，所述的兩對(duì)引物序列為，第32-65個(gè)氨基酸的上游引物 TTCGAATTCAGCAACAACAACAGCTCTCAT,下游引物GCCGCCGCGGCCGCCGCTGCCGCCGCGGCCGCCGCTC TCCACTGCCCAGTCAAA ；第 127-200 個(gè)氨基酸上游引物AGCGGCGGCCGCGGCGGCAGCGGCGGCCGCGG CGGCCTTGCGAAGAACTGC，下游引物TCGCTCGAG GAGACGACCCCATTG。本發(fā)明的單克隆抗體可用于制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的單克隆抗體可用于快速檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒。本發(fā)明的單克隆抗體也可用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白。本發(fā)明的抗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株為申請(qǐng)人篩選得到，細(xì)胞株穩(wěn)定，分類命名為抗PRRSV GP5蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，已于2011年3月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱 CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)， 保藏編號(hào)為CGMCC No. 4651。本發(fā)明篩選得到的抗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定，體外連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月以上或液氮凍存6個(gè)月后，該細(xì)胞株仍能穩(wěn)定分泌抗PRRSV GP5的單克隆抗體；制備的單克隆抗體敏感、特異性強(qiáng)，只對(duì)GP5蛋白有抗性，而對(duì) GST蛋白無抗性。以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒全病毒為抗原對(duì)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水進(jìn)行Western-Blot及間接免疫熒光分析，結(jié)果均為陽性，這為建立診斷PRRS病毒抗原的檢測(cè)方法奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。


圖1純化后的融合蛋白純度。圖2利用Western-Blot方法分析單克隆抗體的抗原位點(diǎn)識(shí)別情況。圖3利用間接免疫熒光方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液與PRRS病毒GP5蛋白的特異性反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1雜交瘤細(xì)胞篩選及單克隆抗體的制備一、pGEX-GP5原核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)PRRS病毒GP5蛋白中第32_65個(gè)氨基酸和第127-200個(gè)氨基酸設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。第32-65個(gè)氨基酸上游引物TTCGAATTCAGCAACAACAACAGCTCTCAT下游引物GCCGCCGCGGCCGCCGCTGCCGCCGCGGCCGCCGCTCTCCACTGCCCAGTCAAA
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第127-200個(gè)氨基酸上游弓丨物AGCGGCGGCCGCGGCGGCAGCGGCGGCCGCGGCGGCCTTGCGAAGAACTGC下游引物TCGCTCGAGGAGACGACCCCATTG分別擴(kuò)增PRRS病毒GP5蛋白中第32_65個(gè)氨基酸基因序列及第127-200個(gè)氨基酸基因序列，這兩段序列利用12個(gè)氨基酸(SGGRGGSGGRGG)作為連接橋段，采用PCR的方法連接成一個(gè)大片段(具體片段序列如下:AGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTA ACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGAGCGGCGGCCGCGGCGG CAGCGGCGGCCGCGGCGGCCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTC TGGACACTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGT CACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATG GGGTCGTCTC)，并在其5'端和3'端分別引入EcoRI和Xho I酶切位點(diǎn)。將PCR連接片段產(chǎn)物經(jīng)酶切處理后，克隆于經(jīng)過同樣酶切處理的攜帶GST的原核表達(dá)載體pGEX-6p-l中，命名為PGEX-GP5。經(jīng)測(cè)序鑒定正確的表達(dá)載體，用IPTG對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。二、GST-GP5融合蛋白的表達(dá)及純化1.重組蛋白的誘導(dǎo)(1)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E. coli BL-21中；(2)在含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上挑取含重組質(zhì)粒的單個(gè)菌落，接種于含相應(yīng)抗生素的3mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜活化；(3)按1 100的體積比將活化菌接種于含氨芐青霉素的5mL LB培養(yǎng)基中，37°C 培養(yǎng)約2h至對(duì)數(shù)生長期(OD600值達(dá)0. 5 0. 6)，加入終濃度為0. lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑， 37 °C誘導(dǎo)表達(dá)4h ；(4)用12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳觀察。2.融合蛋白的大量表達(dá)及純化(1)接種已表達(dá)融合蛋白的大腸桿菌DH5 α菌株于IOmL LB/氨芐青霉素液體培養(yǎng)基，于37°C搖蕩培養(yǎng)過夜；(2)轉(zhuǎn)接IOmL過夜培養(yǎng)物于500mL LB/氨芐青霉素液體培養(yǎng)基，于37°C搖蕩培養(yǎng)至OD6tltl值達(dá)0. 5左右，取出ImL樣品供電泳分析；(3)加入 0. 5mL lmol/L IPTG 至終濃度為 0. 6mmol/L,于 37°C搖蕩培養(yǎng)至 OD6tltl 值達(dá)1.0，終止培養(yǎng)，取出ImL樣品供電泳分析；(4)大量誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白處理方法分別參照GST融合表達(dá)系統(tǒng)操作手冊(cè)，純化后的蛋白電泳圖見圖1。三、單克隆抗體的制備1.免疫脾細(xì)胞的制備(1)取8-10周齡Balb/c雌性小鼠4只，編號(hào)為:1,2,3,4 ；(2)取適量純化的GST-GP5蛋白與等體積的弗氏完全佐劑(Sigma公司)乳化后， 經(jīng)腹腔接種6-8周齡BALB/c小鼠(60 μ g蛋白/只)；(3)兩周后將適量的抗原與等體積的弗氏不完全佐劑(Sigma公司)乳化，進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，免疫量為30yg蛋白/只。以后每隔兩周進(jìn)行第二次、第三次加強(qiáng)免疫。第三次加強(qiáng)免疫后10天眼眶取血，用ELISA方法測(cè)多抗血清效價(jià)；
(4) 10天后，不加佐劑從尾靜脈注射1號(hào)鼠，免疫量為50 μ g蛋白，三天后取小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞。2.細(xì)胞融合(1)按常規(guī)方法融合，取正常小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)M小時(shí)；(2)取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞以1 5_1 10的比例混勻，1500rpm離心 5min ；(3)將離心好的細(xì)胞上清盡量倒掉，拍打離心管底充分懸浮細(xì)胞，將離心管放入 37°C溫水中，在1分鐘內(nèi)緩慢加入ImL的PEG(Sigma公司)，加完后，在溫水中靜置Imin ；(4)然后aiiin內(nèi)緩慢加入2mL的無血清DMEM培養(yǎng)基(GIBC0公司)，接著^iin內(nèi)緩慢加入8mL無血清的DMEM培養(yǎng)基，IOOOrpm離心5min ；(5)倒掉上清，加入IOmL的血清，小心地將細(xì)胞吹勻，倒入前面準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)細(xì)胞，用HAT (Sigma公司)培養(yǎng)基懸浮；(6)將含有細(xì)胞的培養(yǎng)液滴入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μ L，置于37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第七天換成HT (Sigma公司)培養(yǎng)液培養(yǎng)。3.雜交瘤細(xì)胞篩選用含GST的其他抗原篩選GST抗原。細(xì)胞融合10天后進(jìn)行首次ELISA雙篩，篩選GST-GP5陽性、GST-X(含GST的其他抗原)陰性的陽性細(xì)胞進(jìn)行亞克隆。7_10天后，再次進(jìn)行ELISA雙篩和亞克隆。如此篩選3-5次，直到細(xì)胞板上所有克隆均為GST-GP5陽性、 GST-X (含GST的其他抗原)陰性，即雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體只對(duì)GP5蛋白有抗性，而對(duì)GST 蛋白無抗性。ELISA多次篩選后得到的雜交瘤細(xì)胞株，體外連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月后凍存于液氮中，3 個(gè)月、6個(gè)月后復(fù)蘇細(xì)胞，結(jié)果該細(xì)胞株生長良好，仍能穩(wěn)定分泌抗GP5的單克隆抗體，并且抗體水平未見降低。4、ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)(1)用包被液稀釋免疫蛋白原，終濃度為2 μ g/mL, 100 μ L/孔，4°C，過夜，洗液洗滌2次；(2) 1 % BSA封閉液封閉，200 μ L/孔，37 °C孵箱，2h，用洗液洗滌1次；(3)加入一抗(細(xì)胞培養(yǎng)上清)、陰性對(duì)照(SP2/0培養(yǎng)上清)、空白對(duì)照(PBS)JH 性對(duì)照(陽性血清PBS 200倍稀釋)，均為IOOyL/孔，37°C孵箱，lh，用洗液洗滌3次；(4)加入PBS稀釋20000倍的二抗(山羊抗小鼠IgG/HRP中杉金橋)，100 μ L/孔， 37°C孵箱，lh，取出后用洗液洗滌3次；(5)加入顯色液(1% A 液+10% B 液(A 液1% TMB in DMSO ;B 液0. 1 % H202 in 檸檬酸緩沖液))100 μ L/孔，顯色時(shí)間為5min左右；(6)每孔加入50 μ L終止液(2Μ硫酸)終止；(7)雙波長(450，60 測(cè)吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)。5.腹水的制備取雌性Balb/c小鼠，每只腹腔注射0. 5mL液體石蠟，7天后每只小鼠腹腔注射 2. 5 X IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞，觀察小鼠狀態(tài)。7-10天后小鼠腹部顯著膨隆，收集腹水，12000rpm離心30秒，去除沉淀和上層油脂，收集中段液體，間接ELISA測(cè)其效價(jià)，-70°C保存?zhèn)溆谩?.腹水的純化參照免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，采用rProtein G親和層析純化步驟5得到的單克隆抗體 (腹水)，經(jīng)紫外分光度計(jì)測(cè)定其濃度，-70°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例2單克隆抗體的生物學(xué)鑒定一 .抗體亞類的鑒定利用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒(PERSEN公司)對(duì)最終篩選出來的單獨(dú)針對(duì)免疫原蛋白的陽性細(xì)胞株進(jìn)行亞類鑒定，結(jié)果顯示，實(shí)施例制備的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體為IgA型。二 .ELISA效價(jià)的測(cè)定采用實(shí)施例1中提到的檢測(cè)抗體的ELISA方法，將本發(fā)明制備的CGMCCNo. 4651得到的單克隆抗體培養(yǎng)上清和腹水進(jìn)行ELISA抗體滴度的檢測(cè)，同時(shí)采用SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)液和SP2/0細(xì)胞腹水作為陰性對(duì)照。結(jié)果雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清與腹水效價(jià)分別為IO3和106。三.單克隆抗體分泌穩(wěn)定性的測(cè)定將得到的抗PRRSV GP5蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株CGMCC No. 4651連續(xù)傳代 3個(gè)月以上及液氮凍存6個(gè)月后復(fù)蘇，取細(xì)胞上清，按照實(shí)施例1中所述的ELISA方法，檢測(cè)其抗體效價(jià)，以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。結(jié)果抗體效價(jià)與實(shí)施例2步驟二的結(jié)果無顯著差異，說明該單克隆抗體分泌穩(wěn)定性高。四.雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目檢測(cè)將傳代培養(yǎng)2-3天處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞株CGMCC No. 4651和SP2/0細(xì)胞分別制片、染色后選擇染色體分散良好的細(xì)胞于顯微鏡下進(jìn)行觀察，記錄其染色體數(shù)目。結(jié)果雜交瘤細(xì)胞株CGMCC No. 4651染色體平均記數(shù)49對(duì)，該數(shù)值大于SP2/0細(xì)胞染色體數(shù)(平均記數(shù)44對(duì))，小于脾細(xì)胞(平均記數(shù)40對(duì))與SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)目之和，表明抗PRRSV GP5蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株CGMCC No. 4651確為脾細(xì)胞與SP2/0 細(xì)胞融合而成。五.單克隆抗體的抗原位點(diǎn)識(shí)別分析將PRRSV裂解處理后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后取下膠，裁剪合適大小的硝酸纖維膜(Nitrocellulose Membrane, NC)和濾紙，按常規(guī)方法進(jìn)行蛋白免疫印跡 (Western-blot)分析。抗體為雜交瘤細(xì)胞株CGMCC No. 4651細(xì)胞培養(yǎng)上清，SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，小鼠抗GP5陽性血清作為陽性對(duì)照。結(jié)果見圖2所示，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清與病毒呈特異性染色，而陰性對(duì)照SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)液則無相應(yīng)染色。采用同樣的方法檢測(cè)單克隆抗體(腹水)，結(jié)果無顯著差異。六.單克隆抗體的特異性檢測(cè)用PRRSV株感染Marc-145細(xì)胞，36h后收獲感染細(xì)胞，制備細(xì)胞涂片，分別用已知的PRRS陽性豬血清、陰性豬血清、SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清液和本發(fā)明制備的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗，按常規(guī)IFA試驗(yàn)方法進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)(二抗中加入0. 01%伊文思
藍(lán) ) 。結(jié)果如圖3，其中陽性細(xì)胞呈綠色或黃綠色，陰性細(xì)胞呈紅色。
采用同樣的方法檢測(cè)單克隆抗體(腹水)，結(jié)果無顯著差異。實(shí)施例3單克隆抗體的應(yīng)用臨床樣品的間接免疫熒光檢測(cè)1.制作病理涂片采取臨床上疑似PRRS豬的組織如肺臟、扁桃體、淋巴結(jié)等，按常規(guī)方法制成涂片， 并進(jìn)行固定。2.間接免疫熒光檢測(cè)按常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)，一抗為本發(fā)明得到的單克隆抗體(腹水)或雜交瘤細(xì)胞株 CGMCC No. 4651的細(xì)胞培養(yǎng)上清(分別經(jīng)PBS稀釋10000倍和10倍后使用)。二抗為FITC 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。3.判定標(biāo)準(zhǔn)如果二抗中加入0. 01%伊文思藍(lán)，則陽性細(xì)胞呈綠色或黃綠色，陰性細(xì)胞呈紅色。 如果二抗中未加入伊文思藍(lán)，則陽性細(xì)胞呈綠色或黃綠色，陰性細(xì)胞無特異性著色。
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權(quán)利要求
1.一株抗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為 CGMCC No. 4651。
2.權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株制備的單克隆抗體，抗體亞型為IgA型。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體的制備方法，其制備過程如下根據(jù)豬高致病性繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白中第32-65個(gè)氨基酸和第127-200個(gè)氨基酸設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，并在引物中引入12個(gè)氨基酸，即SGGRGGSGGRGG，作為連接橋段，采用PCR的方法分別擴(kuò)增高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白中第32-65個(gè)氨基酸基因序列及第127-200個(gè)氨基酸基因序列，這兩段序列利用上述12個(gè)氨基酸作為連接橋段， 連接成一個(gè)大片段；將上述連接片段產(chǎn)物酶切處理，克隆于攜帶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的原核表達(dá)載體pGEX-6p-l中；測(cè)序鑒定，用異丙基硫代半乳糖苷對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-GP5融合蛋白；用谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-GP5融合蛋白免疫Balb/c雌性小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出能夠分泌對(duì)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白有反應(yīng)性而對(duì)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶沒有反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞上清液中或從注射雜交瘤細(xì)胞后的動(dòng)物腹水中獲取單克隆抗體。
4.權(quán)利要求3所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的兩對(duì)引物序列為， 第 32-65 個(gè)氨基酸的上游引物TTCGAAT TCAGCAACAACAACAGCTCTCAT,下游引物GCCGC CGCGGCCGCCGCTGCCGCCGCGGCCGCCGCTCTCCACTGCCCAGTCAAA ；第 127-200 個(gè)氨基酸上游引物AGCGGCGGCCGCGGCGGCAGCGGCGGCCGCGGCGGCCTTGCGAAGAACTGC，下游弓丨物TCGCTCGAG GAGACGACCCCATTG。
5.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的雜交瘤細(xì)胞株、單克隆抗體及其制備，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定，體外連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月以上或液氮凍存6個(gè)月后，該細(xì)胞株仍能穩(wěn)定分泌抗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病GP5蛋白的單克隆抗體；單克隆抗體敏感、特異性強(qiáng)，只對(duì)GP5蛋白有抗性，而對(duì)GST蛋白無抗性，為進(jìn)一步建立特異、敏感、快速的PRRS病毒檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/40GK102181402SQ201110072320
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者嚴(yán)景華, 侯艷紅, 王美君, 趙亞榮, 高福 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司