專利名稱：一種抗白細(xì)胞介素-8抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抗白細(xì)胞介素-8抗體。
背景技術(shù)：
抗體(antibody)是機(jī)體在抗原物質(zhì)刺激下，由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、 可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。如圖1所示，抗體結(jié)構(gòu)根據(jù)功能可分解成幾種形式全抗體(IgG)、抗原結(jié)合片段 (antigen-binding fragment, Fab)和單鏈抗體(scFv)，每種抗體均包括重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)。重鏈和輕鏈上有可變區(qū)，可變區(qū)由相互交替的4個(gè)框架區(qū)(FRs)和3個(gè)高變區(qū) (CDRs)組成?？蚣軈^(qū)的氨基酸序列相對(duì)保守，高變區(qū)的氨基酸組成和排列順序更易發(fā)生變化，決定了抗體結(jié)合抗原的特異性。IgG和Fab上還有恒定區(qū)，在給定的物種中，不同抗體分子的恒定區(qū)都具有相同的或幾乎相同的氨基酸序列?？贵w-抗原反應(yīng)是一種獨(dú)特的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用最常用的方法之一是由Fields及其同事發(fā)明的酵母雙雜交技術(shù)(Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. (1991) J Mol Biol. 222 :581-597. ) (Fields，S and Song, 0. (1989)Nature 340:245-247·)， 這項(xiàng)技術(shù)只需要DNA序列而非蛋白質(zhì)就能確定結(jié)合的部分(Bartel PL, Fields S(ed.) (1997) "The Yeast Two-Hybrid System(Advances in Molecular Biology)" Oxford University Press. ) (Zhu L and Hannon (ed. ) (2000)"Yeast Hybrid Technologies^aton Publishing，Natick，MA.) (Fields S, Sternglanz R. (1994) Trends Genet. 10:286-292·)。 酵母雙雜交技術(shù)的原理是利用相互作用的二個(gè)蛋白質(zhì)組分使與該二組分融合的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并激活核報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，使該技術(shù)廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (De Jaeger G, et al (1997)FEBS Lett. 403 :116-122. ) (Tavladoraki P, Benvenuto Ε, Trinca S, De Martinis D, Cattaneo A, Galeffi P. (2000)Nature. 366 :469-472.), ^clfi
(intrabodies)白勺(Visintin Μ, Tse Ε, Axelson H, Rabbitts ΤΗ, Cattaneo Α. (1999)Proc Natl Acad Sci USA. 96 :11723-11728.)(De Jaeger G, Fiers Ε, Eeckhout D,Depicker Α. (2000)FEBS Lett. 467 :316-320.) (Portner-Taliana A,Russell Μ,Froning KJ,Budworth PR,Comiskey JD,Hoeffler JP. (2000) J Immunol Methods. 238 :161—172.)。白細(xì)胞介素-8 (Interleukin-8,或稱IL-8)是CXC趨化因子(Chemokine)家族中一員。已知IL-8是一種嗜中性粒細(xì)胞(Neutrophil)的強(qiáng)烈趨化及激活因子Gchroder JM,Mrowietz U,Morita E,Christophers Ε. (1987)JImmunol. 139 :3474-3483.) (Peveri P, Walz A, Dewald B, Baggiolini Μ. (1988) J Exp Med. 167 :1547-1559.)。目前認(rèn)為 IL-8 能強(qiáng)力地匯集并激活嗜中性粒細(xì)胞，在許多生理和病理過程中都有廣泛的生物活性Gchall TJ,Bacon KB. (1994) Curr Opin Immunol. 6 :865-873.)。過量的 IL-8 能造成炎癥等自身免疫疾病(Baggiolini M, Clark-Lewis I. (1992)FEBS Lett. 307 :97-101)。IL-8 可由多種參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞分泌而產(chǎn)生，如巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞等等，繼而作用于內(nèi)皮細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種炎癥相關(guān)的細(xì)胞，從而形成炎癥反應(yīng)。很多人類疾病與體內(nèi)IL-8表達(dá)和分泌的異常或過量、失衡有關(guān)。中國專利200410089202. 4公開了一種具有中和白細(xì)胞介素-8 (IL-8)生物活性的單克隆抗體以及該單克隆抗體的可變區(qū)序列。該專利以IL-8為免疫源，以小鼠為免疫對(duì)象，通過免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾臟制備懸液，并使之與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合獲得可表達(dá)抗IL-8單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株以制備抗IL-8單克隆抗體。中國專利申請(qǐng)01813639. 7公開了一種在酵母中生產(chǎn)抗體文庫以及篩選抗體的方法，在酵母細(xì)胞中表達(dá)試驗(yàn)蛋白質(zhì)文庫，該試驗(yàn)融合蛋白質(zhì)包含在文庫內(nèi)序列變異的第一多肽亞基，在文庫內(nèi)其序列獨(dú)立于第一多肽亞基變異的第二多肽亞基，和一個(gè)連接第一和第二多肽亞基的接頭肽；在表達(dá)試驗(yàn)蛋白質(zhì)的酵母細(xì)胞中表達(dá)一種或多種靶融合蛋白質(zhì)， 每種靶融合蛋白質(zhì)包含一個(gè)靶肽或蛋白質(zhì)；和篩選那些表達(dá)報(bào)道基因的酵母細(xì)胞，該報(bào)道基因的表達(dá)被試驗(yàn)融合蛋白質(zhì)結(jié)合到靶融合蛋白質(zhì)上所激活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種特異性高的抗白細(xì)胞介素-8抗體。一種抗白細(xì)胞介素-8抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)中的3 個(gè)高變區(qū) CDRHl、CDRH2、CDRH3 的氨基酸序列分別為 GFSFSSFEM、YISKSGFTIYYADSVKG, SSffAQDFDffLLPFDff ；其輕鏈可變區(qū)中3個(gè)高變區(qū)CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分別為 RASQGIRNYLA、AASTLQS、QKYNSVPF。一種抗白細(xì)胞介素-8抗體，其重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO. 5所述的氨基酸序列； 所述的輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO. 6所述的氨基酸序列。上述抗體可以是全抗體、抗體片段或單鏈抗體。本發(fā)明還提供了一種編碼上述人白細(xì)胞介素-8抗體的基因，編碼重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的DNA序列分別如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示。上述抗體可應(yīng)用于制備用于治療與人白細(xì)胞介素-8表達(dá)和分泌異常、過量或失控相關(guān)的疾病的藥物。本發(fā)明抗白細(xì)胞介素-8抗體特異性高，制備過程相對(duì)簡(jiǎn)單，成本低廉。


圖1為抗體3種類型的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明單鏈抗體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為本發(fā)明#IL-8_31抗體特異性測(cè)試抗體濃度與OD450關(guān)系曲線圖；圖4為本發(fā)明#IL-8_21抗體特異性測(cè)試抗體濃度與OD450關(guān)系曲線圖；圖5為本發(fā)明#IL-8_31抗體濃度與IL8趨向抑制率的關(guān)系曲線圖；圖6為本發(fā)明#IL-8_21抗體濃度與IL8趨向抑制率的關(guān)系曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明采用專利申請(qǐng)01813639. 7公開的方法構(gòu)建人單鏈抗體文庫，并在人單鏈抗體文庫中篩選IL-8抗體，具體實(shí)施過程如下實(shí)施例1逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增得到人抗體重鏈和輕鏈DNA以來自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白細(xì)胞的polyA+RNA(購自Clontech)為模板，并使用從Clontech購得的逆向轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，以oligo(dT)和隨機(jī)引物(random primers)為引物，根據(jù)Clontech試劑盒所提供的方法指南，將polyA+RNA逆向轉(zhuǎn)錄成 cDNA。以上述cDNA為模板，使用一系列識(shí)別人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因的引物，應(yīng)用PCR法擴(kuò)增人抗體中所有的重鏈和輕鏈的可變區(qū)。一系列識(shí)別人抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的引物序列如下第1組人抗體重鏈可變區(qū)(VH)基因的5’ -端引物
C(C/T)
GG
GGVHlb:5，-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC (C/G)G
VH2b:5，-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA
VH3b:5，-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTACAGCAGTGG G
VH4b :5，-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GAG GTG CAG CTG(G/T)TG GAG(A/T)
VH5b :5，-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTC CAGCT(G/T)GT(A/G)CAG TCT
VH6b VH7b
-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG (A/G)TC ACCTTG AAG GAG TCT G -CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTGGTG(C/G)A(A/G) TCT第2組人抗體重鏈可變區(qū)(VH)基因的3’ -端引物
VHlf:5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGAGAC(A/G)GT GAC CAG GGT G
VH2f:5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGAGACGGTGAC CAG GGT T
VH3f:5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA AGAGACGGTGAC CAT TGT
VH4f:5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGAGACGGTGAC CGT GGT CC
VH5f:5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC GGT TGGGGCGGATGC ACT CC
VH6f:5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC (C/G)GATGGGCCCTT GGT GGA(A/G)GC
第3組人抗體λ-輕鏈可變區(qū)(V λ)基因的5’ -端引物
VLlb:5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG TCT GT(C/G)(C/G/T)TG ACG CAGCCG CC
VL2b:5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT G(A/T)GCTG AC(A/T)CAG CCA
C
T)A CC GAG CC CC (A/C)CCVL7b
VL3b :5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT GAG CTGA(C/T)(A/G)CAG C(C/
VL4b VL5b
:5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CCT GTG CTGACT CA(A/G) (C/T)C :5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG (A/G/T) CT GTGGTG AC (C/T) CAG
VL6b 5 -GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CC(A/T)G(G/T)G CTG ACT CAG
:5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TCT GAG CTGA(C/G)T CAG GA(C/CN 102199209 A
說明書
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G) CC CCT TCT CC TCT CC T)CT CC


VL8b 5' -GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG TCT G(C/T) (C/T)CTGA(C/T)T CAG
VL9b :5， -GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT AAT TTT ATG CTGACT CAG CCC C 第4組人抗體λ-輕鏈可變區(qū)(V λ)基因的3’ -端引物
VLlf 5' -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TAG GAC GGT(C/G)A(C/G)CTT GGT CC VL2f :5，-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA GAG GAC GGT CAGCTG GGT GC 第5組人抗體κ-輕鏈可變區(qū)(VK)基因的5’ -端引物
VKlb :5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAC ATC C(A/G)G(A/G/T)TG ACC CAG
VK2b :5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAA ATT GT(A/G) (A/T)TG AC(A/G)CAG
VK3b 5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAT ATT GTG(A/C)TG AC (C/G/T)CAG(A/
VK4b :5， -GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAAACG ACA CTCACG CAG TCT C
第6組人抗體κ-輕鏈可變區(qū)(VK)基因的3’ -端引物
VKlf 5' -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT TTC CACCTT GGT CC
VK2f 5' -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT CTCCA(C/G)CTT GGT CC
VK3f :5，-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT ATC CACTTT GGT CC
VK4f :5’ -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT AAT CTC CAGTCG TGT CC
PCR法擴(kuò)增人抗體中的重鏈可變區(qū)(VH)時(shí)應(yīng)用上述第1組引物與第2組引物的組
合，即有42個(gè)PCR反應(yīng)；類似地，擴(kuò)增人抗體中的λ輕鏈可變區(qū)(V λ)時(shí)應(yīng)用上述第3組引物與第4組引物的組合，即有18個(gè)PCR反應(yīng)；擴(kuò)增人抗體中的κ輕鏈可變區(qū)(Vk)時(shí)應(yīng)用上述第5組引物與第6組引物的組合，即有16個(gè)PCR反應(yīng)。第1組引物中包含有酵母雙雜交載體pACT2 (Hua SB, Luo Y，Qiu Μ, Chan Ε, Zhou H, Zhu L. (1998)Gene. 215 :143-152.)(Hua SB, Qiu M, Chan E, Zhu L, Luo Y. (1997) Plasmid. 38 :91-96.)多克隆位點(diǎn)上游的同源序列(下劃線部分)；第4組和第6組引物中包含有與酵母雙雜交載體PACT2多克隆位點(diǎn)下游的同源序列(下劃線部分)；而第2組、第 3組和第5組引物中包含有連接肽(linker)的序列(下劃線部分)。連接肽用于連接抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)。PCR法擴(kuò)增人抗體中所有的重鏈和輕鏈可變區(qū)的反應(yīng)條件如下5. 0 μ 1 PCR 緩沖液(IOx)1. 0μ 1 3，-端引物(ΙΟμΜ)1· 0μ 1 5，-端引物(ΙΟμΜ)5· 0 μ 1 cDNA 底物1. 0μ 1 dNTP(IOmM)36 μ 1 7jC1. 0 單位 Taq 聚合酶(Clontech 生產(chǎn))將上述各組分混合均勻后置于PCR儀(Applied BioSystems公司)中進(jìn)行反應(yīng)。
6PCR反應(yīng)的參數(shù)為解鏈94°C，1分鐘、退火50°C，1分鐘、延伸72°C，2. 5分鐘、循環(huán)30次。實(shí)施例2連接載體多克隆位點(diǎn)的同源序列和連接肽序列以實(shí)施例1中所述PCR所得的人抗體重鏈可變區(qū)DNA為模板，以引物7和引物8分別為上游引物和下游引物，采用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件同上。引物7序列為載體pACT2 多克隆位點(diǎn)的上游同源序列，引物8序列為連接肽反鏈序列。弓丨物7(pACT2多克隆位點(diǎn)上游同源序列)5' -ACC CCA CCA AAC CCA AAA AAA GAG ATC TGT ATG GCTTAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC引物8(連接肽反鏈序列)5' -ACT GCC TCC ACC ACC GCT GCC ACC TCC GCC AGA TCCTCC GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC以實(shí)施例1中所述PCR所得的人抗體輕鏈可變區(qū)DNA為模板，以引物9和引物10 分別為下游引物和上游引物，采用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件同上。引物9為載體pACT2多克隆位點(diǎn)的下游同源序列，引物10為連接肽順鏈序列。引物9(pACT2多克隆位點(diǎn)下游同源序列)5' -GAG ATG GTG CAC GAT GCA CAG TTG AAG TGA ACT TGCGGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA弓丨物10(連接肽順鏈序列)5' -GGC GGT GGT GGA TCA GGC GGC GGA GGA TCT GGC GGAGGT GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT實(shí)施例3將人抗體重鏈和輕鏈DNA通過連接肽序列連接成單鏈抗體將實(shí)施例2中PCR擴(kuò)增得到的含載體pACT2多克隆位點(diǎn)的同源序列和連接肽序列的人抗體重鏈可變區(qū)DNA和輕鏈可變區(qū)DNA混合。以該混合DNA為模板，以引物7和引物 9分別為上游引物和下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到包括人抗體重鏈DNA序列、輕鏈DNA序列、載體PACT2多克隆位點(diǎn)同源序列以及連接肽DNA序列的單鏈抗體(scFv)DNA，反應(yīng)條件同實(shí)施例1實(shí)施例4構(gòu)建人單鏈抗體(scFv)基因文庫上述實(shí)施例3所述的單鏈抗體(scFv)DNA兩側(cè)接有酵母雙雜交載體 pACT2 (Clontech公司生產(chǎn))多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的同源序列。將上述實(shí)施例3所述的單鏈抗體(scFv)DNA與經(jīng)限制性內(nèi)切酶(Bam HI和Eco RI)處理后的酵母雙雜交載體pACT2按照 Clontech公司提供的方法(Yeast Protocol Handbook，PT3024-1)將其共同轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母菌株丫187(基因型獻(xiàn)丁0 ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trpl-901,leu2-3,112， gal4，gal80, URA3: GALlUAS-GALlTATA-IacZ)內(nèi)，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)同源重組后將單鏈抗體(scFv) DNA整合到pACT2載體上，從而得到酵母雙雜交單鏈抗體(scFv)文庫。單鏈抗體(scFv)DNA 片段與pACT2載體上的激活區(qū)域(Activation Domain, AD)融合在一起。為檢查這個(gè)人單鏈抗體(scFv)文庫的質(zhì)量，隨機(jī)挑出了 30個(gè)克隆。對(duì)插入片段測(cè)序分析表明所有克隆都包括與融合在一起的單鏈抗體(scFv)DNA片段(數(shù)據(jù)未顯示)，而且所有單鏈抗體(scFv)DNA序列都是獨(dú)特的。上述經(jīng)同源重組而得到酵母雙雜交單鏈抗體(scFv)基因文庫中抗體DNA拷貝數(shù)大約有1 X IO8個(gè)，可應(yīng)用于酵母雙雜交技術(shù)篩選特定的抗體。實(shí)施例5篩選抗體將編碼人IL-8的DNA克隆進(jìn)入載體pGBKT7 (Clontech公司)構(gòu)建出pGBK_IL_8。 pGBK-IL-8 編碼 Gal4DNA 結(jié)合區(qū)域(Binding Domain, BD)并融合在人 IL-8 的 N 端。在編碼人IL-8的DNA序列得到驗(yàn)證后，pGBK_IL_8質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母菌株 AH109(基因型 MATa， ura3-52， his3-200， ade2-101， trpl-901， leu2-3， 112， gal4, gal80, LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2， URA3: :MELlUAS-MELlTATA-lacZ) (Clontech 公司)。帶有 pGBK_IL_8 質(zhì)粒的 AH109 酵母可在不含色氨酸的合成培養(yǎng)基(SD/-W)上生長(zhǎng)。將等量的含有pGBK-IL-8的MAI1a型酵母細(xì)胞(AH109菌株)與包含單鏈抗體 (scFv)基因文庫的ΜΑΤ α型酵母細(xì)胞(Υ187菌株)進(jìn)行共同培養(yǎng)時(shí)，此二型細(xì)胞即可交配
社a
？口口。載有單鏈抗體(scFv)文庫的pACT2載體含有LEU2基因，pGBK_IL_8包含TRPl 基因。包含上述兩種質(zhì)粒的酵母細(xì)胞可以生長(zhǎng)在不含亮氨酸和絲氨酸的酵母合成培養(yǎng)基 (SD/-LW)。存在scFv/IL-8相互作用的細(xì)胞會(huì)激活整合在菌株基因組中的報(bào)告基因ADE2 和HIS3，從而使得酵母細(xì)胞可以生長(zhǎng)在缺乏腺嘌呤，組氨酸，亮氨酸和色氨酸的培養(yǎng)基 (SD/-AHLW)上，并在該平板培養(yǎng)基上形成菌落。在上述篩選培養(yǎng)基(SD/-AHLW)上總共挑選出20個(gè)菌落。然后對(duì)這些菌落作進(jìn)一步的分析。首先，按Clontech公司的方法使用β半乳糖苷酶檢測(cè)法檢測(cè)IacZ表達(dá)。存在 scFv/IL-8相互作用的細(xì)胞也會(huì)激活整合在菌株基因組中的另一報(bào)告基因lacZ，從而能測(cè)得酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的β半乳糖苷酶。檢測(cè)酵母細(xì)胞β半乳糖苷酶的方法如下(1)上述酵母在篩選培養(yǎng)基(SD/-AHLW)平板上生長(zhǎng)。(2)將存活的酵母菌落轉(zhuǎn)移到Whatman五號(hào)濾紙上。(3)將帶有酵母細(xì)胞菌落的濾紙浸入液氮之中，使細(xì)胞破裂。(4)將濾紙從液氮中取出，并置于30°C的烘箱內(nèi)。(5)重復(fù)步驟3和4 二次。(6)將濾紙鋪于適量的X-gal溶液中，并置于37°C的溫箱內(nèi)約15分鐘。若帶有菌落處顯示藍(lán)色，表明為β半乳糖苷酶陽性。X-gal溶液配方如下16. lg/L5. 50g/L0. 75g/L0. 246g/L
Na2HPO4 · 7H20 NaH2PO4 · H2O
KCl
MgSO4 · 7H2035mg/L X-gal (5_ 溴 _4_ 氯 _3_ 吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷)5mMβ-巰基乙醇ρΗ 7. 0檢測(cè)結(jié)果上述挑選出的20個(gè)菌落中有12個(gè)是β半乳糖苷酶陽性的，表明在這些菌落的細(xì)胞內(nèi)另一報(bào)告基因IacZ也被激活了。
其次，對(duì)上述12個(gè)β半乳糖苷酶陽性菌落的scFv進(jìn)行特異性分析，以確定scFv 是否特異性地與IL-8部分結(jié)合，而不是與其它部分。將含有scFv基因的pACT2質(zhì)粒DNA 從上述12個(gè)β半乳糖苷酶陽性的酵母中提取出來。并分別與pGBKT空載體，或與含有編碼融合&114-DNA結(jié)合區(qū)(BD)和人核纖層蛋白C編碼序列的質(zhì)粒pGBKT-Lam (Clontech公司)，共同轉(zhuǎn)化到AH109酵母細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞先鋪于平板培養(yǎng)基(SD/-LW)上生長(zhǎng)，然后轉(zhuǎn)移到平板培養(yǎng)基(SD/-AHLW)上，并進(jìn)一步使用β半乳糖苷酶分析。經(jīng)上述方法對(duì)scFv進(jìn)行特異性分析后，得到3個(gè)對(duì)人IL-8具有特異性的單鏈抗體(scFv)ο最后，對(duì)上述3個(gè)對(duì)人IL-8具有特異性的單鏈抗體(scFv)進(jìn)行測(cè)序分析，使用 ABI自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定scFv的DNA序列。分析這些單鏈抗體(scFv)克隆的DNA序列發(fā)現(xiàn)有二個(gè)不同的抗人白細(xì)胞介素_8 的單鏈抗體(scFv)。其中與克隆號(hào)#IL-8-31相同的有2個(gè)，另一個(gè)為克隆號(hào)#IL-8-21?？寺√?hào)#IL-8_31的單鏈抗體重鏈(VH)可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ IDN0. 1所示， 單鏈抗體重鏈(VL)可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；編碼克隆號(hào)#IL_8_31的單鏈抗體重鏈(VH)可變區(qū)的DNA序列如SEQ IDN0. 3所示，編碼克隆號(hào)#IL_8_31的單鏈抗體輕鏈(VL)可變區(qū)的DNA序列如SEQ ID NO. 4所示。#IL-8-31的單鏈抗體重鏈(VH)可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO. 1)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYffSfflRQPPGKGLEfflGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDYYDFffSGYYDAFDIffGQGTMVTVSS下劃線部分依次為重鏈可變區(qū)中的三個(gè)高變區(qū)⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的氨基酸序列。#IL-8-31的單鏈抗體輕鏈(VL)可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)QSALIQPASVSGPPGQSITISCTGSSSDVGDYYYVSffYQQHPGKAPKLLIYDVNYRPSGVSSRFSGSKS
GNTASLTIsglqaedeadyycssyrdtqilgvfgggtkltvl下劃線部分依次為輕鏈可變區(qū)中的三個(gè)高變區(qū)⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3的氨基酸序列?？寺√?hào)#IL-8_21的單鏈抗體重鏈(VH)可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ IDN0. 5所示， 單鏈抗體重鏈(VL)可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示；編碼克隆號(hào)#IL_8_21的單鏈抗體重鏈(VH)可變區(qū)的DNA序列如SEQ IDN0. 7所示，編碼單鏈抗體輕鏈(VL)可變區(qū)的 DNA序列如SEQ ID N0. 8所示。#IL-8-21的單鏈抗體重鏈(VH)可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID N0. 5)EVQLLETGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFSSFEMNffVRQAPGKGLEffLSYISKSGFTIYYADSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSffAQDFDffLLPFDffffGQGTLVTVSS下劃線部分依次為重鏈可變區(qū)中的三個(gè)高變區(qū)⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的氨基酸序列。#IL-8-21的單鏈抗體輕鏈(VL)可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID N0. 6)ETTLTQSPSSVSAYVGDRVTITCRASQGIRNYLAffYQQKPGKVPNLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSET DFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSVPFTFGPGTKVDIK下劃線部分依次為輕鏈可變區(qū)中的三個(gè)高變區(qū)⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3的氨基酸序列。 實(shí)施例6抗體表達(dá)與純化將實(shí)施例5中篩選得到的抗人IL-8的單鏈抗體(scFv)DNA克隆到蛋白質(zhì)表達(dá)載體中 pET27b (+) (Novagen 公司)而得到 pET27b_aIL_8?？寺『蟮?pET27b_aIL_8 在 scFv 的 N 端是PelB序列(可將表達(dá)后的scFv蛋白質(zhì)分泌到表達(dá)細(xì)菌E. coli的周質(zhì)腔(periplasmic space)中)，而C端含有一段編碼HSV標(biāo)記物和一個(gè)6x His (組氨酸)標(biāo)記物(可用于蛋白質(zhì)的純化)的序列。將pET27b-aIL-8轉(zhuǎn)化入蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)菌E. coli菌株BL21DE3 (Novagen 公司)。并按照該公司提供的方法用IPTG(濃度0. 5mM)誘導(dǎo)表達(dá)和分離抗人IL-8的單鏈抗體scFv蛋白質(zhì)。因?yàn)閟cFv蛋白質(zhì)的C端含有一個(gè)6x His標(biāo)記物，我們可以應(yīng)用Qiagen公司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱Oliagen公司)來純化scFv蛋白質(zhì)。純化前后蛋白質(zhì)用 SDS-PAGE凝膠電泳分析。實(shí)施例7酶標(biāo)免疫法(ELISA)測(cè)試抗IL_8的scFv特性我們測(cè)試了純化后的抗IL-8單鏈抗體的特性。第一個(gè)特性是用酶標(biāo)免疫法 (ELISA)測(cè)定抗體與IL-8的免疫親和。重組人IL-8的蛋白質(zhì)購自Pierce公司。用于酶標(biāo)免疫法(ELISA)的96-孔板 (MaxiSorp板，購自Nunc公司)。方法如下(1)上述96-孔板首先用IL-8包被。(2)包被后的96-孔板再用SuperBlock(購自Pierce公司)作封閉處理。(3)純化了的抗IL-8單鏈抗體在0. 02% BSA中作系列稀釋后加入已包被有IL_8 的96-孔中，與IL-8結(jié)合。(4)將96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀釋了 5000倍的鼠抗HSV標(biāo)記物的抗體(購自Novagen公司)用來檢測(cè)結(jié)合了的單鏈抗體(在scFv的C端含有一個(gè)HSV標(biāo)記物)。(5)將96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀釋了 10000倍的山羊抗鼠IgG抗體并偶聯(lián)有HRP (辣根過氧化物酶)的偶聯(lián)物(購自Sigma公司)。(6)將96-孔板最終清洗后，應(yīng)用購自Sigma公司的HRP底物TMB試劑作顯色處理。(7)最后，反應(yīng)用0. 5M的硫酸終止，并檢測(cè)450nm的吸收光譜。結(jié)果如圖3和圖4所示，結(jié)果說明克隆號(hào)#IL-8_31與克隆號(hào)#IL_8_21的二個(gè)單鏈抗體都能有效地結(jié)合IL-8。實(shí)施例8測(cè)試IL-8單鏈抗體對(duì)IL-8的趨化性采用微孔小室(改進(jìn)型的Boyden Chamber)趨化實(shí)驗(yàn)測(cè)試純化后的抗IL_8單鏈抗體的對(duì)IL-8趨化性的抑制作用，實(shí)驗(yàn)步驟如下(1)重組人IL-8的蛋白質(zhì)(濃度為lOng/ml)與純化后的抗IL-8單鏈抗體或鼠抗人IL-8抗體(購自Wiarmingen公司)或與IL-8不相關(guān)的抗p_53單鏈抗體混合在培養(yǎng)基中(此三種抗體的濃度為1微克/毫升或10微克/毫升)，并置于改進(jìn)型的Boyden Chamber(購自New Probe公司)的底室。(2)分離后的嗜中性粒細(xì)胞QX IO5細(xì)胞)加于改進(jìn)型的Boyden Chamber的上室。上、下室之間有孔徑3. 0 μ m的聚碳膜相隔。(3)加置細(xì)胞后的Boyden Chamber在37°C的(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)保溫一小時(shí)。(4)移動(dòng)到下室的嗜中性粒細(xì)胞在顯微鏡下作觀測(cè)。趨化實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果如圖5和圖6所示，結(jié)果說明克隆號(hào)#IL-8_31與克隆號(hào) #IL-8-21的二個(gè)單鏈抗體都能有效地抑制IL-8對(duì)細(xì)胞的趨化性。
權(quán)利要求
1.一種抗白細(xì)胞介素-8抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，重鏈可變區(qū)中的3個(gè)高變區(qū)⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3的氨基酸序列分別為GFSFSSFEM、 YISKSGFTIYYADSVKG、SSffAQDFDffLLPFDff ；其輕鏈可變區(qū)中 3 個(gè)高變區(qū) CDRLl、CDRL2、CDRL3 的氨基酸序列分別為 RASQGIRNYLA、AASHQS、QKYNSVPF。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗白細(xì)胞介素-8抗體，其特征在于所述的重鏈可變區(qū)具有 SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列；所述的輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗白細(xì)胞介素-8抗體，其特征在于所述的抗體為單鏈抗體。
4.一種編碼權(quán)利要求1或2所述的抗白細(xì)胞介素-8抗體的基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗白細(xì)胞介素-8抗體在制備用于治療與人白細(xì)胞介素-8表達(dá)和分泌異常、過量或失控相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明一種抗白細(xì)胞介素-8抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)中的3個(gè)高變區(qū)CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分別為GFSFSSFEM、YISKSGFTIYYADSVKG、SSWAQDFDWLLPFDW；其輕鏈可變區(qū)中3個(gè)高變區(qū)CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分別為RASQGIRNYLA、AASTLQS、QKYNSVPF。本發(fā)明抗白細(xì)胞介素-8抗體具有全人源化的特點(diǎn)，特異性高，制備過程相對(duì)簡(jiǎn)單，成本低廉。
文檔編號(hào)C12N15/13GK102199209SQ20111007463
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者余乃絢, 華紹炳 申請(qǐng)人:余乃絢, 華紹炳