專利名稱：CD8α-白介素21-CD137復(fù)合物擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫學(xué)領(lǐng)域，具體是指使用⑶8 a -白介素21-⑶137復(fù)合物轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞和低濃度白介素2共同作用擴(kuò)增激活自然殺傷細(xì)胞(NK)成為淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)細(xì)胞。
背景技術(shù)：
1982年Grimm等首先報(bào)道外周血淋巴細(xì)胞中加入白介素2體外培養(yǎng)4_6天，能誘導(dǎo)出一種非特異的殺傷細(xì)胞，這類細(xì)胞可以殺傷多種對NK不敏感的腫瘤細(xì)胞。這類細(xì)胞被稱為淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)。1984年11月Rosenberg研究組經(jīng)美國食品和藥品檢驗(yàn)局(FDA)批準(zhǔn)下，首次應(yīng)用IL-2與LAK協(xié)同治療25例腎細(xì)胞癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤患者。其中11例腫瘤縮小超過50%，1例黑素瘤完全消退。1988年該研究組總結(jié)了 IL-2與LAK細(xì)胞協(xié)同治療222例腫瘤患者，其中16例患者腫瘤轉(zhuǎn)移灶完全消退，26例患者腫瘤消退50%以上，該療法對轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌、黑素瘤、結(jié)腸癌和非何杰金氏淋巴瘤患者的療效較顯著。隨后的研究表明LAK細(xì)胞對乳腺癌、膀胱癌，肝癌和急性白血病進(jìn)行治療也有明顯療效。目前LAK細(xì)胞治療在美國主要用來和化療、放療聯(lián)合使用。LAK細(xì)胞數(shù)量與療效直接相關(guān)，治療中存在的問題是獲得大量LAK細(xì)胞非常困難。 通常采用的高劑量白介素2激活生長的方法能夠擴(kuò)增的倍數(shù)有限(100倍)，而且需要從病人身體中采集大量的外周血(500亳升)才能夠初步達(dá)到治療的劑量，這對病人是一個很大的生理負(fù)擔(dān)。高劑量的白介素2費(fèi)用昂貴，對病人又是很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前的研究表明白介素2激活生長的LAK細(xì)胞倍數(shù)有限與白介素2擴(kuò)增后的細(xì)胞端粒酶活性降低有關(guān)。端粒酶活性降低也可能是高劑量白介素2激活生長的LAK細(xì)胞輸入病人體內(nèi)后作用有限的重要原因。本發(fā)明解決了這一問題，本發(fā)明提供了一種可以在體外擴(kuò)增和激活NK的方法。該方法所需的白介素2只有通常采用方法的十分之一，擴(kuò)增的效率高10-100倍，擴(kuò)增后的LAK 細(xì)胞端粒酶活性是通常采用方法的五倍。用該方法擴(kuò)增的LAK細(xì)胞比用通常采用的方法擴(kuò)增的細(xì)胞純度和活性顯著增強(qiáng)，數(shù)量上可以達(dá)到臨床治療的需要，可以用來幫助病人抵抗腫瘤、病毒和細(xì)菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的⑶8 a -白介素21-⑶137復(fù)合物擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于(1)⑶8 a、白介素21和⑶137是上述各蛋白質(zhì)的全部多肽或是包括上述各蛋白質(zhì)中具備功能的多肽成分；(2)⑶8 a -白介素21_⑶137復(fù)合物采用蛋白穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，其中細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄了穩(wěn)定表達(dá)⑶8 α -白介素21-⑶137復(fù)合物的表達(dá)載體，載體中含有病毒啟動子和選擇標(biāo)記基因；(3)外源表達(dá)載體進(jìn)入宿主Κ562細(xì)胞后，激活啟動子，培養(yǎng)細(xì)胞后即可得到表達(dá)跨膜白介素21-CD137復(fù)合物的細(xì)胞；宿主K562細(xì)胞經(jīng)過酸、堿或輻照后即得到用來擴(kuò)增淋巴細(xì)胞的跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物；(4)把跨膜白介素21-CD137復(fù)合物依次用硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素進(jìn)行純化， 即得純化復(fù)合物；純化復(fù)合物可以用來擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞生成LAK細(xì)胞。作為優(yōu)選，上述方法中所述的白介素2、白介素21和CD137從人體分離的細(xì)胞。作為優(yōu)選，上述方法中所述的擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞是外周血淋巴細(xì)胞、純化的NK細(xì)胞、純化的NK細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的組合、純化的NK細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞和別的淋巴細(xì)胞的組合、或白介素2和/或白介素21和/或CD137混合物注射進(jìn)人體血管后作用的血液中所有白細(xì)胞；其中純化是指NK細(xì)胞代表總數(shù)的50%以上。作為優(yōu)選，上述方法中所述的培養(yǎng)液為Eagle’ s培養(yǎng)液加入10%人血清或 10%小牛血清；或RPMI1640加入10%人血清或10%小牛血清；或F_10 (Ham，s) Nutrient mixtures加入10%人血清或10%小牛血清。作為優(yōu)選，上述方法中所述的跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物的劑量在50pM InM ； 其中K562細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的用量比例如下為，K562細(xì)胞淋巴細(xì)胞=1 10 1 ；作為更佳選擇，所述的K562細(xì)胞中加入跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物；K562細(xì)胞淋巴細(xì)胞= 1 4 1。作為優(yōu)選，上述方法中所述的宿主K562細(xì)胞經(jīng)過強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或高劑量輻照后即得到用來擴(kuò)增淋巴細(xì)胞的跨膜白介素21-CD137復(fù)合物，本發(fā)明中所述的強(qiáng)酸、強(qiáng)堿為濃硫酸、鹽酸、硝酸等一般技術(shù)人員認(rèn)為酸性足夠強(qiáng)的酸即可，而高劑量輻照也為本行業(yè)內(nèi)的普通技術(shù)人員所熟知的輻照劑量，一般是指輻照IOOGy以上IOOOGy以下。作為優(yōu)選，上述方法中所述的跨膜白介素21-CD137復(fù)合物擴(kuò)增的LAK細(xì)胞通過溶于生理鹽水溶液，再用于靜脈滴注。⑶8 α -白介素21-⑶137轉(zhuǎn)染的Κ562細(xì)胞對淋巴細(xì)胞和NK擴(kuò)增和激活有重要的作用。擴(kuò)增和激活后產(chǎn)生的LAK細(xì)胞有重要的醫(yī)療作用。本發(fā)明利用的方法可以得到的足夠數(shù)量和質(zhì)量的LAK細(xì)胞，是理想的識別和摧毀腫瘤細(xì)胞和病原體感染的細(xì)胞，增強(qiáng)病人免疫反應(yīng)的方法。LAK細(xì)胞可以識別和摧毀腫瘤細(xì)胞和病原體感染的細(xì)胞，其中包括病毒感染，如乙肝病毒、甲肝病毒和艾滋病毒。腫瘤的類型包括但不限于急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓系白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、艾滋病相關(guān)的癌癥、肛門癌、星形細(xì)胞瘤、非典型畸胎/橫紋肌樣瘤、中楸神經(jīng)系統(tǒng)瘤、基底細(xì)胞癌-皮膚癌(非黑色素瘤)、膽管癌、膀胱癌、 骨腫瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、腦干膠質(zhì)瘤、腦腫瘤、乳腺癌、支氣管腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、子宮頸癌、脊索瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病OXL)、慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)Vg 性骨髓增生性疾病、結(jié)腸癌、大腸癌、顱咽管瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤-蕈樣肉芽腫、乳腺導(dǎo)管原位癌、胚胎性腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、食管癌、嗅神經(jīng)母細(xì)胞、尤因肉瘤家族腫瘤、顱外生殖細(xì)胞瘤、性腺外生殖細(xì)胞腫瘤、肝外膽管腫瘤、眼癌、骨纖維組織細(xì)胞瘤、骨肉瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌、胃腸道間質(zhì)瘤-成人軟組織肉瘤、生殖細(xì)胞瘤、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、毛細(xì)胞白血病、頭頸部癌癥、心臟腫瘤、肝癌、組織細(xì)胞增多癥、朗格漢斯細(xì)胞、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼內(nèi)黑色素瘤、胰島細(xì)胞瘤(內(nèi)分泌胰腺)，卡波西氏肉瘤、腎癌、朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥、喉癌、白血病、唇及口腔癌、肝癌、小葉原位癌、腫癌、淋巴瘤、巨球蛋白血癥、男性乳腺癌、骨惡性纖維組織細(xì)胞瘤、骨肉瘤、髓母細(xì)胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、惡性間皮瘤、轉(zhuǎn)移性鱗癌頸部腫瘤、口腔癌、多發(fā)性內(nèi)分泌瘤綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞腫瘤、蕈樣肉芽腫、骨髓增生異常綜合癥、骨髓增生異常/骨髓增殖性腫瘤、慢性粒細(xì)胞性白血病、髓細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生性疾病、鼻腔鼻竇腫瘤、鼻咽癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、口腔癌、唇口咽癌、骨肉瘤、 惡性纖維組織細(xì)胞瘤骨、卵巢癌胰腺癌、乳頭狀瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、鼻竇和鼻腔癌、甲狀旁腺腫瘤、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、松果體實(shí)質(zhì)腫瘤、垂體瘤、漿細(xì)胞腫瘤/多發(fā)性骨髓瘤、胸膜肺母細(xì)胞瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞(腎)癌癥、腎盂和輸尿管、移行細(xì)胞癌、呼吸道癌癥、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、涎腺腫瘤、皮膚癌、小細(xì)胞肺癌、小腸腫瘤、軟組織肉瘤、鱗癌頸部腫瘤、原始神經(jīng)外胚層腫瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、睪丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲狀腺癌、滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、輸尿管及腎盂移行細(xì)胞癌、尿道癌、 子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特巨球蛋白血癥和腎母細(xì)胞瘤。本發(fā)明中的白介素21、⑶137、⑶8 α和白介素2是該蛋白質(zhì)的全部多肽，其中也包括這些蛋白質(zhì)中具備功能的多肽成分。本發(fā)明中的外周血淋巴細(xì)胞來自于外周血、臍帶血和骨髓。本發(fā)明中的外周血淋巴細(xì)胞可以是NK細(xì)胞；也可以是NK細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的不同組合；也可以是NK細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞和別的淋巴細(xì)胞的不同組合；也可以是白介素2和/或白介素21和/或CD137混合物注射進(jìn)人體血管后所作用的血液中所有白細(xì)胞的總和。本發(fā)明中的白介素2、白介素21和CD137來源于人，但不僅僅限于人，如注射或處理的對象是其它物種，如小鼠、大鼠、猴子等等，也可以是其它物種的白介素2、白介素21 和 CD137。本發(fā)明提供了一個可以用來制成藥物的方案，按照這個方案制成的藥物可以有下面所描述的多種用途。這個方案包括白介素2、白介素21和CD137。利用本方案擴(kuò)增的LAK 細(xì)胞適用與需要增強(qiáng)病人免疫力的各種情景。例如，擴(kuò)增NK細(xì)胞對治療腫瘤特別有效，如急性髓細(xì)胞性白血病、慢性淋巴瘤白血病、前列腺腫瘤、惡性黑色素瘤和腎細(xì)胞惡性腫瘤， 但不僅僅限于上述腫瘤。例如，擴(kuò)增LAK細(xì)胞對治療細(xì)菌、真菌或寄生蟲內(nèi)感染特別有效。 擴(kuò)增的LAK細(xì)胞對治療病毒感染特別有效，如乙肝病毒、甲肝病毒和艾滋病毒但不僅僅限于上述病毒感染。擴(kuò)增的LAK細(xì)胞可以顯著提高抗原的作用效果。除非另有說明，本發(fā)明中所有的技術(shù)和科學(xué)詞匯的含義是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士通常理解的含義。常用術(shù)語的定義在所有分子生物學(xué)書中可以找到，例如， Benjamin Lewin,Genes VIII, Oxford University Press,2004(ISBN 0-13-145140-5)；為了確保長期，高收益的生產(chǎn)重組白介素21和⑶137，本發(fā)明采用了蛋白穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。首先構(gòu)建⑶8 α -白介素21-⑶137的表達(dá)載體，這個載體中同時含有病毒啟動子和選擇標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因。⑶8 α是一種在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜蛋白，⑶8 α基因連接白介素21和⑶137基因后使得白介素21和⑶137同時表達(dá)在細(xì)胞膜上，成為跨膜蛋白(以下統(tǒng)稱為跨膜白介素21-CD137復(fù)合物)。然后用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄Κ562細(xì)胞系， 用恰當(dāng)?shù)姆椒せ顔幼?，培養(yǎng)Κ562細(xì)胞一段時間后即可以得到在細(xì)胞膜上高水平表達(dá)的⑶8 α -白介素21-⑶137復(fù)合物。構(gòu)建⑶8 α -白介素21-⑶137的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)錄細(xì)胞系的方法是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士通常理解的方法。其中構(gòu)建CDSa-白介素21-CD137的表達(dá)載體的方法參考下面的文獻(xiàn) . et. al.，J Mol Cell Biol (2010) 2 (4) 217-222;構(gòu)建蛋白穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士所通常采用的技術(shù)。例如，細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄了穩(wěn)定表達(dá)CD8 α -白介素21-CD137的表達(dá)載體，這個載體中含有病毒啟動子和選擇標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因。⑶8α是一種在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜蛋白，⑶8 α基因連接白介素21和⑶137基因后使得白介素21和⑶137同時表達(dá)在細(xì)胞膜上，成為跨膜蛋白(以下統(tǒng)稱為跨膜白介素21-CD137復(fù)合物)。外源表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后，用恰當(dāng)?shù)姆椒せ顔幼?，培養(yǎng)細(xì)胞一段時間后即可以得到在細(xì)胞膜上高水平表達(dá)的多肽。這些方法是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士通常理解的方法。在細(xì)胞膜上高水平表達(dá)跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物的細(xì)胞可以通過高速離心的方法收集。細(xì)胞可以通過這些技術(shù)包括但不限于下面所列的方法處理強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和輻照。 在細(xì)胞膜上的跨膜白介素21-CD137復(fù)合物可以直接與外周血淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞共同培養(yǎng)，激活擴(kuò)增LAK細(xì)胞，也可以純化分離后與外周血淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，激活擴(kuò)增LAK細(xì)胞。在細(xì)胞膜上高水平表達(dá)的跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物可以通過本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士所熟悉的技術(shù)來純化和分離。這些技術(shù)包括但不限于下面所列的方法硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素。如有必要，蛋白質(zhì)復(fù)性的方案可用來幫助純化表達(dá)的蛋白多肽。 如果有必要，高效液相色譜法(HPLC)可作最后的純化步驟進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的跨膜白介素21-CD137復(fù)合物會有一部分分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士都可以根據(jù)普通的生物化學(xué)技術(shù)來驗(yàn)證。分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物也可以通過上述方法純化和分離?？缒ぐ捉樗?1-⑶137復(fù)合物也可以通過標(biāo)準(zhǔn)的操縱核苷酸編碼序列的方法來生產(chǎn)。例如，用特定的、非特定的定點(diǎn)突變或其他分子生物學(xué)技術(shù)來生產(chǎn)功能等同的，但一級結(jié)構(gòu)不相同的多肽。簡單的一個或多個氨基酸修改如果不影響蛋白質(zhì)的生化特性，這些通過氨基酸保守替換產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也在本發(fā)明保護(hù)的范圍之內(nèi)。本發(fā)明中的跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物可用來擴(kuò)增LAK細(xì)胞。體外擴(kuò)增的LAK 細(xì)胞可移植病人。例如，跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2按照順序依次擴(kuò)增激活LAK細(xì)胞的方法比通常所用的高劑量白介素2擴(kuò)增激活LAK細(xì)胞更有效100倍以上。 跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用擴(kuò)增后的LAK細(xì)胞端粒酶活性是采用高劑量白介素2擴(kuò)增激活LAK細(xì)胞的五倍以上。端粒酶活性檢測采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP)(詳見 Kim NW, Piatyszek MA, prowse KR, et al. Science, 1994 ；266 :2011)。 跨膜白介素21-CD137復(fù)合物擴(kuò)增激活的LAK細(xì)胞比用高劑量白介素2擴(kuò)增激活的LAK細(xì)胞活性高4倍以上?？缒ぐ捉樗?1-⑶137復(fù)合物擴(kuò)增三個星期后，LAK細(xì)胞的純度可以達(dá)到95%，細(xì)胞的數(shù)量可以達(dá)到1.0X1010以上，滿足臨床治療的需求?？缒ぐ捉樗?1-CD137復(fù)合物擴(kuò)增的LAK細(xì)胞，可以用來進(jìn)行自體移植，也可以進(jìn)行異體移植。在受捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原與捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原相匹配的前提下，捐助人被激活和擴(kuò)增的細(xì)胞可以通過靜脈滴注的方式注入到被捐助人的血管中。在某些應(yīng)用中，細(xì)胞系(例如，NK細(xì)胞系、NKT細(xì)胞系)也可以通過跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物激活和擴(kuò)增。 擴(kuò)增的細(xì)胞系用于臨床治療目的也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞可從來源于包含有大量淋巴細(xì)胞和前體細(xì)胞的任何組織。例如，外周血(包括臍帶血)、骨髓、脾臟和淋巴結(jié)。淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞通常取自于外周血或骨髓。在其他應(yīng)用中(例如，實(shí)驗(yàn)研究)，脾臟和/或淋巴結(jié)也是合適的來源。例如，淋巴細(xì)胞可以通過抽外周血和/或骨髓來獲得。淋巴細(xì)胞可以進(jìn)一步經(jīng)過純化得到NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞。純化NK細(xì)胞，NKT細(xì)胞的步驟和工藝是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士所熟悉的。淋巴細(xì)胞可以通過密度梯度離心的方式來分離血液或骨髓中的血紅細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞。NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞可以利用抗體介導(dǎo)的親和制備方法進(jìn)一步純化，例如抗體結(jié)合磁珠法。純化淋巴細(xì)胞并不要求純化的淋巴細(xì)胞絕對純，而是指純化的細(xì)胞比其在來源組織中所占的比例更高。通常情況下，純化的淋巴細(xì)胞至少代表總數(shù)的 50%，或者60%，或者更高。純化的NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞懸浮在一個合適的生理緩沖溶液中， 然后懸浮生長于但不局限于下列培養(yǎng)液中，Eagle' s培養(yǎng)液加入10%人血清，RPMI1640加入10%人血清，F(xiàn)-IO (Ham，s)Nutrient mixtures加入10%人血清。人血清也可以用10% 胎牛血清取代，但人血清對LAK細(xì)胞的擴(kuò)增效果更好。淋巴細(xì)胞和/或純化的淋巴細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞懸浮生長于細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2培養(yǎng)，每周加入新的跨膜白介素 21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2培養(yǎng)。通常情況下為了降低成本和避免感染，本發(fā)明采用最小的劑量來擴(kuò)增淋巴細(xì)胞。白介素2的劑量在50單位/亳升到1000單位/毫升之間。在某些情況下，白介素2復(fù)合物的劑量至少在500單位/毫升以上。在某些情況下，有必要進(jìn)行高劑量的處理，激活濃度約為500單位/毫升或1000單位/毫升。另外，跨膜白介素21-CD137復(fù)合物直接注射入人體，用來在體內(nèi)擴(kuò)增LAK細(xì)胞時，所用劑量在0. 5皮摩到0. 5鈉摩之間?？缒ぐ捉樗?1-⑶137復(fù)合物的采用劑量按照跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物在K562中的表達(dá)劑量來確定。在某些情況下，按照K562 淋巴細(xì)胞=1 1,2 1， 3 1,4 1或以上加入跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物。在某些情況下，有必要進(jìn)行高劑量的處理，按照K562 淋巴細(xì)胞=10 1或以上加入跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物。在體外擴(kuò)增的LAK細(xì)胞可以移植給淋巴細(xì)胞的捐助人本身或者受捐助人，以加強(qiáng)天生或抗原特異性免疫反應(yīng)。通常情況下，擴(kuò)增的LAK細(xì)胞通過溶于生理鹽水溶液的方法靜脈滴注。有益效果本發(fā)明通過跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2培養(yǎng)擴(kuò)增的 LAK提高病人的免疫力來幫助病人抵抗腫瘤，抵抗病毒和細(xì)菌。


圖1跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物示意圖，顯示⑶8 α -白介素21-⑶137復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和依次構(gòu)建的順序；圖2Α. LAK細(xì)胞體外擴(kuò)增線性圖顯示淋巴細(xì)胞在跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下線性增長B.外周血淋巴細(xì)胞細(xì)胞體外擴(kuò)增線性圖顯示淋巴細(xì)胞在跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下線性增長。高劑量白介素2處理的細(xì)胞作為陰性對照；圖3LAK細(xì)胞體外擴(kuò)增前后流示儀數(shù)據(jù)圖，人外周血淋巴細(xì)胞在跨膜白介素 21-⑶137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下培養(yǎng)14天后LAK細(xì)胞(⑶56+，⑶16+和CD56+/CD16+)的比例顯著增長；高劑量白介素2處理的細(xì)胞作為陰性對照；圖4LAK細(xì)胞端粒酶活性圖，人外周血淋巴細(xì)胞在跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下培養(yǎng)14天后LAK細(xì)胞端粒酶活性變化；高劑量白介素2處理的細(xì)胞作為陰性對照；圖5LAK細(xì)胞STAT3磷酸化圖，人外周血淋巴細(xì)胞在跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下培養(yǎng)14天后LAK細(xì)胞STAT3磷酸化顯著增加，STAT5磷酸化未見顯著變化；圖6LAK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞圖；人外周血淋巴細(xì)胞在跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下培養(yǎng)14天后LAK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用；高劑量白介素 2處理的細(xì)胞作為陰性對照；圖7擴(kuò)增激活后人LAK細(xì)胞對小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用；A.高劑量白介素2處理的細(xì)胞作為陰性對照；跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增激活的LAK細(xì)胞比高劑量白介素2處理的細(xì)胞殺傷作用顯著增強(qiáng)；B.跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增激活的LAK細(xì)胞比高劑量白介素2處理的細(xì)胞顯著提高腫瘤小鼠的存活率和延長小鼠平均壽命。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明的實(shí)施作具體說明實(shí)施例1跨膜白介素21-CD137復(fù)合物體外擴(kuò)增LAK細(xì)胞。健康捐獻(xiàn)人的NK細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI1640中，輔以10%的人血清。在培養(yǎng)液中加入表達(dá)跨膜白介素21-CD137復(fù)合物的K562細(xì)胞(輻照，IOOGy)和低劑量白介素2后培養(yǎng)7天。 7天后離心，用等量的培養(yǎng)液重懸，加入經(jīng)過輻照的K562細(xì)胞，再培養(yǎng)7天(圖1)。高劑量白介素W200單位/毫升)作為對照組。如圖2A所示，LAK細(xì)胞在跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2的共同作用下，數(shù)量顯著增加。細(xì)胞數(shù)量的增加可以通過插入胸苷的方法來測定。胸苷插入之后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12小時，然后再開始測量細(xì)胞數(shù)量的變化。在 K562 淋巴細(xì)胞=1 1濃度的跨膜白介素21-CD137復(fù)合物作用下LAK細(xì)胞數(shù)量在7天時進(jìn)入對數(shù)生長期，14天的時約增長了 1000倍。在加入跨膜白介素21-CD137復(fù)合物的條件下，LAK細(xì)胞最低在50單位/毫升的白介素2作用下即可開始增長。而對照組細(xì)胞在高劑量白介素2單獨(dú)作用下LAK細(xì)胞的生長顯著低于跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下的細(xì)胞生長速度。實(shí)施例2跨膜白介素21-XCD137復(fù)合物擴(kuò)增未經(jīng)純化的外周血淋巴細(xì)胞跨膜白介素21-CD137復(fù)合物不僅可以擴(kuò)增純化的NK細(xì)胞，還可以擴(kuò)增未經(jīng)過純化的淋巴細(xì)胞。健康捐獻(xiàn)人的PBM培養(yǎng)在RPMI1640中，輔以10%的人血清。在培養(yǎng)液中加入表達(dá)跨膜白介素21-CD137復(fù)合物的K562細(xì)胞(輻照，IOOGy)和低劑量白介素2后共同培養(yǎng)7天。7天后離心，用等量的培養(yǎng)液重懸，加入經(jīng)過IOOGy輻照的K562細(xì)胞，再培養(yǎng) 7天(圖1)。高劑量白介素2 QOO單位/毫升)作為對照組。如圖2B所示，LAK細(xì)胞在跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2的共同作用下，數(shù)量顯著增加。LAK細(xì)胞數(shù)量在7天時進(jìn)入對數(shù)生長期，14天的時約增長了 1200倍。在加入跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物的條件下，LAK細(xì)胞最低在50單位/毫升的白介素2作用下即可開始增長。而對照組細(xì)胞在高劑量白介素2單獨(dú)作用下LAK細(xì)胞的生長顯著低于跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下的細(xì)胞生長速度。在跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下，第14天時91%的淋巴細(xì)胞變成LAK細(xì)胞(⑶56+，⑶16+，⑶56+/⑶16+)(圖幻。對照組在高劑量白介素2 QOO 單位/毫升)作用下，外周血淋巴細(xì)胞僅有16%細(xì)胞變成LAK細(xì)胞(⑶56+，⑶16+，⑶56+/ CD16+)。實(shí)施例3LAK細(xì)胞端粒酶的活性和STAT3磷酸化檢測用液氮反復(fù)凍融的方法破碎擴(kuò)增后的細(xì)胞，IOOOOg離心，取上清，用TRAP方法檢測擴(kuò)增后LAK細(xì)胞端粒酶的活性。50微升TRAP體系中包含20毫摩/升Tris-HCL (pH8. 3)， 1. 5 毫摩 / 升 MgCL，63 毫摩 / 升，KCL, 0. 005 % Tween-20，1 毫摩 / 升 EDTA，50 毫摩 / 升 dNTP，0. 1微克tS，l微克T4，0. 1毫克/毫升牛血清白蛋白，1 2微升CHAPS，細(xì)胞提取液 (含6微克)蛋白，0. 2 0. 4微升[α -32P]dGTP。反應(yīng)條件:23°C 10分鐘，94°C 3秒鐘后， 加入Taq酶，940C 30秒鐘，50°C 30秒鐘，72°C 1. 5分鐘，擴(kuò)增27個循環(huán)，取25微升產(chǎn)物進(jìn)行15% PAGE凝膠電泳。PAGE凝膠電泳后在X-光片上放射自顯影8小時至兩天以上。與擴(kuò)增前相比，對照組高劑量白介素2顯著激活端粒酶的活性。而跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的LAK細(xì)胞端粒酶的活性顯著高于對照組細(xì)胞在高劑量白介素2單獨(dú)作用下LAK細(xì)胞端粒酶的活性(圖4A，圖4B)。在擴(kuò)增后的細(xì)胞中加入含有SDS的Westernblot裂解液，94°C 15分鐘。取40微升產(chǎn)物進(jìn)行15% SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至纖維素膜上，依次加入一抗和二抗后顯影?？缒ぐ捉樗?1-⑶137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的LAK細(xì)胞STAT3 磷酸化顯著高于對照組細(xì)胞在高劑量白介素2單獨(dú)作用下的細(xì)胞，STAT5磷酸化保持不變。 (圖幻這提示STAT3磷酸化水平的不同可能是跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的LAK細(xì)胞活性強(qiáng)的原因之一。實(shí)施例4LAK細(xì)胞對腫瘤的抑制作用跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的LAK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的裂解作用。以前的研究表明給患腫瘤的小鼠注射白介素2能夠增強(qiáng)小鼠的抗腫瘤能力，延緩小鼠的壽命。本實(shí)施例采用跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的LAK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)的方法，來研究用擴(kuò)增的LAK細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤的可行性。 本實(shí)施例采用跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的LAK細(xì)胞注射小鼠體內(nèi)治療小鼠體內(nèi)腫瘤的方法，來研究擴(kuò)增的LAK細(xì)胞抗腫瘤的效果。將健康捐獻(xiàn)者的淋巴細(xì)胞中分離出來后，加入跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的LAK細(xì)胞生長14天。K562、PC3、A549和H印G2被用來作為裂解的靶細(xì)胞。K562是B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系是血液腫瘤細(xì)胞系。PC3是前列腺腫
9瘤細(xì)胞系，A549是肺腫瘤細(xì)胞系，HepG2是肝腫瘤細(xì)胞系。PC3，A549和H印G2是固體腫瘤細(xì)胞系。擴(kuò)增的LAK細(xì)胞和靶細(xì)胞按照適當(dāng)?shù)谋壤餐囵B(yǎng)6小時后檢測存活的靶細(xì)胞。 高劑量白介素2擴(kuò)增的LAK細(xì)胞作為對照組?？缒ぐ捉樗?1-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的LAK細(xì)胞比對照組高劑量白介素2擴(kuò)增的LAK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷作用顯著增強(qiáng)。(圖6) 體外用Lentivirus系統(tǒng)構(gòu)建Fluc報(bào)告基因穩(wěn)定表達(dá)的PC3細(xì)胞系。Fluc Lentivirus系統(tǒng)購自System Biosciences (美國，加州)，具體構(gòu)建方法詳見產(chǎn)品介紹。 PC3-Fluc細(xì)胞皮下注射進(jìn)嚴(yán)重免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)，三天后熒光檢測器檢測腫瘤的生長情況，隨機(jī)分組。擴(kuò)增后的LAK細(xì)胞按照IXlO7細(xì)胞/每只小鼠自尾靜脈注射，一周兩次。連續(xù)治療四周后停止治療，觀察治療效果。圖7A顯示治療14天后腫瘤報(bào)告基因的熒興信號。高劑量白介素2擴(kuò)增的LAK對腫瘤的生長有一定的抑制作用?？缒ぐ捉樗?1-CD137 復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的LAK細(xì)胞比高劑量白介素2擴(kuò)增的LAK細(xì)胞對 PC3腫瘤細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)。圖7B顯示，白介素2擴(kuò)增的LAK細(xì)胞對延長小鼠的存活率有一定的作用。而與白介素2擴(kuò)增的LAK細(xì)胞相比，跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的LAK顯著提高了對腫瘤的治愈率，顯著延長了小鼠的存活率。這提示跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的LAK細(xì)胞可以用于臨床的腫瘤治療。
權(quán)利要求
1.CD8α -白介素21-⑶137復(fù)合物擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于(1)CD8α、白介素21和⑶137是上述各蛋白質(zhì)的全部多肽或是包括上述各蛋白質(zhì)中具備功能的多肽成分；(2)CD8α -白介素21-CD137復(fù)合物采用蛋白穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，其中細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄了穩(wěn)定表達(dá)⑶8 α -白介素21-⑶137復(fù)合物的表達(dá)載體，載體中含有病毒啟動子和選擇標(biāo)記基因；(3)外源表達(dá)載體進(jìn)入宿主Κ562細(xì)胞后，激活啟動子，培養(yǎng)細(xì)胞后即得到表達(dá)跨膜白介素21-CD137復(fù)合物的細(xì)胞；宿主Κ562細(xì)胞經(jīng)過酸、堿或輻照后即得到用來擴(kuò)增淋巴細(xì)胞的跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物；(4)把跨膜白介素21-CD137復(fù)合物依次用硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素進(jìn)行純化，即得純化復(fù)合物；純化復(fù)合物用來擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞生成LAK細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的白介素2、白介素21和CD137從人體分離的細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞是外周血淋巴細(xì)胞、純化的NK細(xì)胞、純化的NK細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的組合、純化的NK細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞和別的淋巴細(xì)胞的組合、或白介素2和/或白介素21和/或CD137混合物注射進(jìn)人體血管后作用的血液中所有白細(xì)胞；其中純化是指NK細(xì)胞代表總數(shù)的50%以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)液為fegle’s培養(yǎng)液加入10%人血清或10%小牛血清；或RPMI1640加入10%人血清或10%小牛血清；或 F-10 (Ham，s) Nutrient mixtures 加入 10%人血清或 10% 小牛血清。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21-CD137復(fù)合物的劑量在50pM InM ；其中K562細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的用量比例如下為，K562細(xì)胞淋巴細(xì)胞=1 10 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的K562細(xì)胞中加入跨膜白介素 21-⑶137復(fù)合物；K562細(xì)胞淋巴細(xì)胞=1 4 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的宿主K562細(xì)胞經(jīng)過強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或高劑量輻照后即得到用來擴(kuò)增淋巴細(xì)胞的跨膜白介素21-CD137復(fù)合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21-CD137復(fù)合物擴(kuò)增的 LAK細(xì)胞通過溶于生理鹽水溶液，再用于靜脈滴注。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫學(xué)領(lǐng)域，具體是指使用CD8α-白介素21-CD137復(fù)合物經(jīng)作用擴(kuò)增、激活自然殺傷細(xì)胞(NK)成為淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)細(xì)胞。本發(fā)明通過將CD8α、白介素21和CD137功能的多肽形成CD8α-白介素21-CD137復(fù)合物，然后外源表達(dá)載體進(jìn)入宿主K562細(xì)胞后，激活啟動子，培養(yǎng)細(xì)胞后即得到表達(dá)跨膜白介素21-CD137復(fù)合物的細(xì)胞；再把復(fù)合物經(jīng)常規(guī)純化后的復(fù)合物用來擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞生成LAK細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是通過跨膜白介素21-CD137復(fù)合物和低劑量白介素2培養(yǎng)擴(kuò)增的LAK提高病人的免疫力來幫助病人抵抗腫瘤，抵抗病毒和細(xì)菌。本發(fā)明在臨床具有廣泛的使用前景。
文檔編號C12N5/0783GK102154207SQ20111007573
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者吳忠福, 徐以兵, 董生聚 申請人:浙江中贏干細(xì)胞生物工程股份有限公司