專利名稱：一種檢測化合物對人Ⅰ型PI3Ks抑制活性的方法
技術領域：
本發(fā)明 涉及醫(yī)藥技術領域，具體涉及檢測化合物對人I型PI3K抑制活性的方法。
背景技術：
在腫瘤治療領域，分子靶向藥物的開發(fā)是當今研究的熱點和重點之一。PI3Ks(磷脂酰肌醇3-激酶)被認為是一個有效的治療靶分子，在人類中有I、II、III三類共8個亞型的同工酶，其中與腫瘤發(fā)生發(fā)展最為密切的是I型PI3K的四個亞型。因此，開發(fā)出針對這四個亞型的有效的單一的抑制劑有可能提高療效、降低毒性，是目前國際上各大研究機構和制藥公司研發(fā)的熱點領域和前沿領域。人I型PI3K為異源二聚體，由一個調節(jié)亞基和一個催化亞基組成。調節(jié)亞基含有SH2和SH3結構域，與含有相應結合位點的靶蛋白相作用。該亞基通常稱為p85，參考于第一個被發(fā)現(xiàn)的亞型(isotype),然而目前已知的6種調節(jié)亞基,大小從50至IlOkDa不等。催化亞基有4種，即I型PI3K的四個亞型ρ110α、ρ110β、ρ110 δ和pllO Y，其中pllO δ僅限于白細胞，其余則廣泛分布于各種細胞中。ΡΙ3Κ抑制劑體外活性檢測是藥物研發(fā)過程中非常關鍵的一個環(huán)節(jié)，主要包括分子水平和細胞水平活性檢測。在分子水平的檢測方法有多種，包括基于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、突光偏振(fluorescence polarization)、TRFRET(時間分辨的突光共振能量轉
移)、AlphaScreen (美國珀金埃爾默公司專利技術)、HTRF (均相時間分辨熒光)等平臺的競爭性活性檢測方法和基于檢測ATP (腺嘌呤核苷三磷酸)或ADP (腺嘌呤核苷二磷酸)含量的通用型ATP酶檢測方法以及基于同位素標記的檢測方法或者應用熒光標記底物的方法等。在細胞水平活性檢測包括用PI3K下游Akt (—種信號蛋白，亦稱為蛋白激酶B)的磷酸化改變來顯示化合物對人PI3K的泛抑制活性和利用不同細胞因子作用于不同的細胞觀察由此產生的不同下游細胞效應來指示化合物對人I型PI3K的四個亞型的抑制活性。在對這些方法的研究和實踐過程中，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)首先，分子水平的檢測方法中，競爭性方法包括酶反應過程和產物競爭過程兩個步驟，較為繁瑣；而基于檢測ATP或ADP含量的方法對參與反應的酶純度要求高以減低背景提高信噪比；同位素的應用則對人體有實質性或潛在的傷害；熒光標記底物需要最終分離產物和底物，這需要依賴于特定的機器，價格昂貴。其次，細胞水平活性檢測中，常用的以Akt磷酸化作為指標的方法只能顯示泛抑制效果而無法區(qū)分化合物對I型PI3Ks的四個亞型的選擇性；而利用不同細胞因子作用于不同的細胞觀察由此產生的不同下游細胞效應來指示化合物對人I型PI3Ks的四個亞型的抑制活性的方法需要依賴于上游細胞因子，其觀察指標亦不統(tǒng)一，平行比較性欠佳。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種可以檢測化合物對人I型PI3K抑制活性的方法，該方法能夠在分子水平和/或細胞水平觀察化合物對人I型PI3K四個亞型的單一抑制效果。根據(jù)本發(fā)明的一個目的，提供了一種檢測化合物對人I型PI3K抑制活性的方法，該方法包括(I)使用激酶體外反應體系在分子水平測定化合物對人I型PI3K的四種亞型的抑制活性，其中，使用生物素標記的磷脂酰肌醇_4，5- 二磷酸作為底物進行體外反應；和/或(2)構建Grpl-PH-EGFP高表達細胞株以綠色熒光在細胞膜上聚集程度為指標在細胞水平檢測化合物對人I型PI3K的抑制活性；和/或(3)構建表達持續(xù)活化的人I型ΡΙ3Κα、ΡΙ3Κ β、ΡΙ3Κ Y和ΡΙ3Κ δ的各亞型細胞株，以磷酸化的Akt為指標，在細胞水平檢測所述化合物對人I型ΡΙ3Κ各亞型的選擇性。該方法中，步驟(I)中，所述人I型ΡΙ3Κ可以是純化的人I型ΡΙ3Κ的分子亞型ΡΙ3Κα、ΡΙ3Κβ、ΡΙ3ΚΥ和ΡΙ3Κ δ中的任一種，并且采用ELISA方法測定所述體外反應的產物。所述生物素標記的磷脂酰肌醇_4，5-二磷酸可以從美國Cayman Chemical公司購買。所述激酶體外反應體系可以由緩沖劑PH6. 5的M0PS(3-(N-嗎啡啉)丙磺酸)，ATP及激酶PI3K、MgCl2 (氯化鎂)、NaCl (氯化鈉)、NaCholate (膽酸鈉)、DTT ( 二硫蘇糖醇)，底物生物素標記的磷脂酰肌醇_4，5- 二磷酸組成。步驟(2)中，所述的在細胞水平檢測化合物對人I型PI3K抑制活性，主要為在Grpl-PH-EGFP高表達細胞株處于無上游信號激活PI3K時先用所述化合物對其作用再通過細胞因子激活人I型PI3K，以EGFP所產生的綠色熒光在細胞膜表面聚集程度來指示化合物對PI3K的抑制活性。具體包括(2-1)使用Rh30(人橫紋肌肉瘤細胞株)構建穩(wěn)定高表達GrpI-PH-EGFP蛋白的細胞株，命名為Rh30-Grpl-PH-EGFP，將這種細胞接種于細胞培養(yǎng)板孔內；(2-2)將步驟(2-1)中所述的細胞貼壁過夜后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時，去除上游信號對內源性PI3K激活的干擾；(2-3)加入待測化合物處理細胞之后，再通過細胞因子激活人I型PI3K ;以及(2-4)觀察EGFP所產生的綠色熒光信號。其中，步驟(2-1)中所述的Rh30-Grp I-PH-EGFP的構建，具體包括將含有Grpl-PH和熒光蛋白融合序列的質粒(如質粒pEGFP-Cl-Grpl-PH)轉入Rh30細胞內，通過篩選(如通過G418 (遺傳霉素)進行篩選)得到單克隆穩(wěn)轉細胞株Rh30-GrpI-PH-EGFP。步驟(2-3)進一步包括采用4%的多聚甲醛室溫固定細胞。步驟(3)中，所述的在細胞水平檢測化合物對人I型PI3K各亞型的選擇性，主要為應用持續(xù)活化的人I型PI3K高表達的細胞株在無上游信號激活內源性PI3K時，以磷酸化的Akt為指標檢測化合物的抑制活性。具體包括(3-1)分別構建穩(wěn)定表達氮端或碳端融合了豆蘧?；蛄谢蚍峄蛄械娜薖llOa、PllO β、PllO Y或PllO δ的Rh30細胞株，使之成為表達持續(xù)活化的人I型ΡΙ3Κ的細胞株，將這四種細胞分別接種于細胞培養(yǎng)板孔內；(3-2)使步驟(3-1)中所述的細胞貼壁過夜后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時，去除上游信號對內源性PI3K激活的干擾；(3-3)加入待測化合物處理細胞之后，裂解細胞；以及(3-4)用Western blot (蛋白質印跡)的方法檢測細胞內對Akt的磷酸化的影響。
其中，步驟3-1)中所述的表達持續(xù)活化的人I型PI3K的細胞株為豆蘧?；蛄腥诤显谌薎型PI3K的PllOa、PllO β、PllO Y或PllO δ的氮端的Rh30細胞，或者法尼基化序列融合在人I型PI3K的PllO a、PllO β、PllO Y或PllO δ的碳端的Rh30細胞。所述穩(wěn)定表達氮端或碳端融合了豆蘧?；蛄谢蚍峄蛄械娜薖llO a、Pl 10 β、Pl 10 Y或PllO δ的Rh30細胞株的建立，具體包括a.豆蘧?；蛄腥诤显谌薎型PI3K的催化亞基PllOa、PllO β、PllO Y或PllO δ 的氮端的 Rh30 細胞(即 Rh30-Myr-P110 a、Rh30_Myr_P110 β、Rh30_Myr_P110 γ 和Rh30-Myr-P110S)，其構建過程是:分別在 PllO α、Ρ110β、Ρ110γ 和 PllO δ 的 ORF (開放閱讀框)5’ 端加入豆蘧?；瘔A基序列 5’ -ATGGGGTCTTCAAAATCTAAACCAAAGGACCCCAGCCAGCGCCGGCGCAGAATCCGAGGT-3’ 及標簽序列(如 HA (血凝素)標簽序列 5’ -ACCCATACGACGTGCCA
GATTACGCC-3’ )后，分別插入到載體(例如pBabe-Puro質粒)中，然后與質粒pE-ampho、PGP共轉入293FT細胞獲取病毒，用該病毒感染Rh30細胞后再通過篩選(如通過嘌呤霉素篩選)得到目的細胞株，所得細胞株分別命名為Rh30-Myr-P110 α、Rh30-Myr_P110 β、Rh30-Myr-P110 γ 和 Rh30_Myr_P110 δ ;以及b.法尼基化序列融合在人I型ΡΙ3Κ的PllOa、PllO β、PllO Y或PllO δ的碳端的 Rh30 細胞(即 Rh30-P110a-CAAX、Rh30_P110 β-CAAX、Rh30-Pl 10 y-CAAX 和他30- 110 6-044乂)，其構建過程是分別在？110 0、？110 0、？110丫和 PllO δ 的 ORF 3’端去掉終止密碼子并加入標簽序列(如HA標簽序列5’-ACCCATACGACGTGCCAGATTACGCC-3’)和法尼基化序列 5’ -CAGCATGCTTTGAACGAGCTCGGCGCCTCCAAAGATGGCAAAAAGAAGAAGAAGAAGTCCAAGACCAAGTGCGTGATCATGTGA-3 ’或 5 ’ -CAGCATGCTTTGAACGAGCTCGGGGGCGCCAGCGGCCCCGGCTGCATGAGCTGCAAGTGCGTGCTGAGCTGA-3’ 后，分別插入到載體(例如 pBabe-Puro 質粒)中，然后與質粒pE-ampho、pGP共轉入293FT細胞獲取病毒，用該病毒感染Rh30細胞后再通過篩選(如通過嘌呤霉素篩選)得到目的細胞株，所得細胞株分別命名為Rh30-P110 a -CAAX、Rh30-P110 β -CAAX、Rh30_P110 y -CAAX 和 Rh30_P110 δ -CAAX。優(yōu)選地，豆蘧?；蛄腥诤显谌薎型PI3K的PllOa、Ρ110β、Ρ110γ或ΡΙΙΟδ的氮端。由于每種細胞株只高表達人I型ΡΙ3Κ四種亞型中的一種亞型的豆蘧?；蛄谢蚍峄蛄腥诤系鞍仔问剑虼丝梢元毩⒂^察化合物對每個亞型的抑制效果。本發(fā)明中，由于分子反應中采用的底物是之前未有報道過的生物素標記的磷脂酰肌醇_4，5- 二磷酸，產物可以用ELISA法直接檢出，因此不需要競爭過程，沒有同位素的應用，產物也不需要分離就可以直接被檢出，在一定程度上克服了激酶純度不高帶來的高背景的缺點，操作也更方便快捷安全。本發(fā)明中，在細胞水平上，Rh30-Grp I-PH-EGFP細胞株中Grpl-PH (generalreceptor for phosphoinositides I-Pleckstrin homology domain,憐月旨酉先肌酉享 I 一般受體的普列克底物蛋白同源結構域)對PI3K的直接產物PIP3 (磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸)具有高特異的親和力，因此融合蛋白Grpl-PH-EGFP可以指示細胞內PIP3的位置和含量，以EGFP (增強型綠色熒光蛋白)所產生的綠色熒光在細胞膜表面聚集程度來指示化合物對PI3K的抑制活性，比用其它下游信號效應分子作為指標更能直接的體現(xiàn)對PI3K的抑制活性。
本發(fā)明中，當豆蘧?；蛄谢蚍峄蛄腥诤显谌薎型PI3K的各pllO催化亞基(ΡΙΙΟα、Ρ110β、Ρ110γ和ΡΙΙΟδ)的氮端或碳端并高表達于哺乳細胞內時，可以體現(xiàn)出其持續(xù)活化的狀態(tài)，即這種細胞株無需上游信號激活就可以體現(xiàn)出ΡΙ3Κ活性。而Akt被證明是響應ΡΙ3Κ活性的一個很好的信號分子，響應方式是Akt的磷酸化，所以用磷酸化Akt為作為統(tǒng)一指標指示化合物對人I型ΡΙ3Κ的抑制活性，平行比較性更好。本發(fā)明提供的檢測化合物對人I型ΡΙ3Κ抑制活性的方法可以系統(tǒng)的定性定量地顯示化合物在分子和細胞水平對人I型ΡΙ3Κ的抑制活性以及對人I型ΡΙ3Κ各個亞型的選擇性，同時也可以用于ΡΙ3Κ抑制劑高通量的化合物篩選。


圖I是顯示本發(fā)明一個實施方式中使用激酶反應體系在分子水平上檢測ΡΙ3Κ抑制劑ΡΙ103對ΡΙ3Κα的抑制效果的圖。圖2是顯示本發(fā)明一個實施方式中用ΡΙ3Κ抑制劑處理無上游信號激活ΡΙ3Κ時表 達Grpl-PH-EGFP的Rh30細胞后在受到IGF-I刺激后細胞內綠色熒光在膜上的聚集程度的圖。圖3是顯示本發(fā)明一個實施方式中PI3K抑制劑對四個表達持續(xù)活化的人I型PI3K細胞株Rh30內磷酸化Akt的影響的圖。
具體實施例方式下面將結合本發(fā)明的實施例和附圖，對本發(fā)明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分優(yōu)選的實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明實施例提供一種檢測化合物對人I型PI3KS酶抑制活性的方法，能夠在分子和細胞水平考察化合物對人I型PI3Ks的四個亞型的抑制效果，以下分別進行詳細說明。實施例實驗材料及儀器材料含PllO α 和 P85 α 的質粒(pBabe puro HA PIK3CA 和 pBV human p85alpha (HA tag))購自美國 Addgene 組織，含 PllO β 的質粒(pBabe puro HA PIK3CB)由美國哈佛大學Thomas M. Roberts教授提供，含PllO Y或ΡΙΙΟδ的質粒(pBSFI-ΡΙΙΟγ和pBSFI-PllO δ )由美國Peter K. Vogt教授提供，質粒pEGFP_Cl-Grpl_PH由美國國立衛(wèi)生院的Tamas Balla教授贈送,質粒pE-ampho、pGP購自寶生物工程(大連)有限公司，質粒pGEX 4T-1為GEHealthcare公司產品，質粒pFastBacHTB、昆蟲細胞T. ni和轉染試劑lipofect amine 2000購自美國英杰生命技術有限公司，PBS(磷酸緩沖液)購自上海迪生生物有限公司，BSA(牛血清白蛋白)等常規(guī)試劑購自上海生工。遺傳霉素和嘌呤霉素購自applied chemical 公司，化合物 PI103 (CAS :371935-74-9)、TGX_221(CAS :663619-89-4)和 AS604850(CAS :648449-76-7)購自美國 Cayman Chemical 公司，⑶C0941(CAS :957054-30-7)和 IC87114(CAS :371242-69-2)購自 Symansis 公司。RPMI 1640 等細胞培養(yǎng)基及所用血清均購自美國英杰生命技術有限公司。Glutathione Sepharose 4B Beads ( —種蛋白純化用顆粒)為GE Healthcare公司產品，Ni-NTA Superflow( 一種蛋白純化用顆粒)為美國Qiagen公司產品，細菌培養(yǎng)用酵母提取物(Yeast Extract)、胰蛋白胨(Trypton)為Oxoid公司(Hampshire, England)產品，大腸桿菌B121為北京鼎國生物公司產品。HRP標記的抗GST抗體購自英國Abcam公司，TMB購自碧云天公司，IGF-I (生長因子I)購自美國R&D systems公司。Rh30細胞為美國St. Jude兒童研究醫(yī)學院來源，293FT細胞購自美國英杰生命技術有限公司。本發(fā)明中所涉及的核苷酸序列的合成均由上海生工完成。儀器細胞培養(yǎng)用超凈工作臺是美國Heal force公司產品，細胞培養(yǎng)箱及恒溫搖床是Thermo Fisher公司產品，SHJ潔凈工作臺為上海匯龍儀表電子有限責任公司產品；TY-20型脫色搖床為上海西巴斯生物技術開發(fā)有限公司產品；SCS-24水平搖床為上海市離 心機械研究所產品；Envision MultilabelPlate Readers 為 PERKIN ELMER 公司產品；Eppendorf centrifuge 5417R 為 EppendorfHanburg 公司產品。實施例IGrpl-PH-EGFP高表達細胞株Rh3O-Grpi-PH-EGFP的建立將質粒pEGFP-Cl-Grpl-PH、轉染試劑Lipofenctamine 2000依試劑說明操作轉入Rh30細胞內，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后加入800μ g/mL終濃度的G418(遺傳霉素)篩選兩周，所得細胞重新接種至96孔板中培養(yǎng)。兩周后，于熒光顯微鏡下觀察得到的高表達EGFP-Grpl-PH的單克隆穩(wěn)轉細胞株Rh30-GrpI-PH-EGFP。之后，將該細胞在含500 μ g/mL終濃度的G418培養(yǎng)基(即RPMI 1640+10%牛血清+G418)中培養(yǎng)。實施例2表達持續(xù)活化的人I型PI3K的四種亞型的細胞株的建立豆蘧?；蛄蟹謩e融合在人I型PI3K的PllOa、ΡΙΙΟβ、PllO Y和PllO δ的氮端的 Rh30-Myr-P110 a、Rh30_Myr_P110 β、Rh30_Myr_P110 γ 和 Rh30_Myr_P110 δ，其構建過程是用常規(guī)分子生物學方法(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾，《分子克隆實驗指南(第三版)》，科學出版社)分別在PllO a、PllO β、PllO Y和ΡΙΙΟδ的ORF 5’端加入豆■酰化堿基序列 5，-ATGGGGTCTTCAAAATCTAAACCAAAGGACCCCAGCCAGCGCCGGCGCAGAATCCGAGGΤ-3’ 及 HA 標簽序列 5’ -ACCCATACGACGTGCCAGATTACGCC-3’ 后，插入質粒 pBabe-Puro 中，然后與質粒pE-ampho、pGP共轉入293FT細胞獲取病毒，用該病毒感染Rh30細胞48小時后，再通過I μ g/mL終濃度的嘌呤霉素篩選得到目的細胞株，所得細胞株分別命名為Rh30-Myr-P110α、Rh30-Myr_P110 β、Rh30-Myr_P110 γ 和 Rh30-Myr_P110 δ。法尼基化序列分別融合在人I型ΡΙ3Κ的Pl 10 α、PllO β、Pl 10 Y和ΡΙΙΟδ的碳端的 Rh30-P110 a -CAAX、Rh30_P110 β -CAAX、Rh30_P110 y -CAAX 和 Rh30_P110 δ -CAAX，其構建過程是分別在Ρ110α、Ρ110β、Ρ110γ和ΡΙΙΟδ的ORF 3’端去掉終止密碼子，并加入 HA 標簽序列 5’ -ACCCATACGACGTGCCAGATTACGCC-3’ 和法尼基化序列 5’ -CAGCATGCTTTGAACGAGCTCGGCGCCTCCAAAGATGGCAAAAAGAAGAAGAAGAAGTCCAAGACCAAGTGCGTGATCATGTGA-3，或 5，-CAGCATGCTTTGAACGAGCTCGGGGGCGCCAGCGGCCCCGGCTGCATGAGCTGCAAGTGCGTGCTGAGCTGΑ-3’后,插入質粒pBabe-Puro中，然后與質粒pE_ampho、pGP共轉入293FT細胞獲取病毒，用該病毒感染Rh30細胞48小時后,再通過I μ g/mL終濃度的嘌呤霉素篩選得到目的細胞株，所得細胞株分別命名為 Rh30-P110 a -CAAX、Rh30_P110 β -CAAX、Rh30_P110 y -CAAX 和Rh30-P110δ-CAAX。
實施例3使用激酶體外反應體系在分子水平測定化合物對人I型PI3K的亞型ΡΙ3Κα的抑制活性GST-Grpl-PH蛋白的表達及純化用常規(guī)分子生物學方法(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾，《分子克隆實驗指南(第三版)》，科學出版社)將Grpl-PH片段從質粒pEGFP-Cl-Grpl-PH中克隆進質粒pGEX 4T-1形成新質粒pGEX4T-l-Grpl_PH，再將該質粒轉入大腸桿菌B121中。然后將目的轉化子在2XYT-Amp培養(yǎng)基(O. 5%酵母提取物，I. 6%胰蛋白胨，O. 5% NaCl，50 μ g/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)至0D600為O. 6時，采用100 μ M的IPTG (異丙基硫代半乳糖苷)誘導表達4h，離心取菌體，加入PBS重懸后超聲破碎，離心取上清。隨后加入Glutathione Sepharose 4B Beads孵育2小時，離心取Beads, PBS洗漆數(shù)次，用PH8. O的25mM終濃度的還原型谷胱甘肽洗脫即得目的蛋白GST_Grpl-PH。ΡΙ3Κα的表達和純化用常規(guī)分子生物學方法(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾，《分子克隆實驗指南(第三版)》，科學出版社)將PllOa片段從質粒pBabe puro HA PIK3CA克隆到質粒pGEX 4T-1后，再將GST-pllOa片段克隆進質粒pFastBacHTB中，同時將p85 a 片段從質粒pBV human p85alpha (HAtag)克隆進pFastBacHTB中，將這兩個最終目的質粒通過英杰生命技術有限公司的Bac-to-Bac技術，依其說明操作得到兩種桿狀病毒。將這兩種桿狀病毒共轉昆蟲細胞T.ni表達出蛋白ΡΙ3Κα，這種蛋白用Ni-NTA superflow依其說明書操作得到最終所需激酶PI3KCI。激酶活性檢測I、將親和鏈霉素加入96孔蛋白高結合力的透明酶標板中孵育過夜。2、用PBST清洗板孔后，換含5% BSA的PBS封閉液于室溫放置2h以封閉板孔。3、化合物PI103對PI3K α的抑制效果檢測反應在96孔聚苯丙烯板中進行，用激酶反應液配制不同濃度的ΡΙ103，2. 5 μ M最高濃度，兩倍稀釋共7個濃度梯度。激酶反應液組分為50mMM0PS，pH 6. 5 ；10mM MgCl2 ；25mMNaCl ;0. 5mMNaCholate (膽酸鈉)以及ImM DTT。然后在每孔加入10 μ L由激酶反應液配置的不同濃度的 PI103 (2. 5 μ Μ，I. 25 μ Μ, O. 625 μ Μ，O. 31 μ Μ，O. 16 μ Μ, O. 08 μ Μ,
0.0411|0，再加入用激酶反應液配制的人1型？131(中的？131((1 (30 μ L/孔)。隨后，每孔再加入10 μ L包含250 μ M ATP和50ηΜ底物(生物素標記的磷脂酰肌醇_4，5- 二磷酸)的激酶反應液啟動反應。同時設置無酶對照孔和DMSO溶劑對照孔，室溫作用I小時后用終濃度為20mM的EDTA終止反應。終止后的反應液體轉入棄去封閉液的酶標板孔中，酶標板放于濕盒內室溫孵育2小時。4、將GST-Grpl-PH蛋白稀釋于封閉液(5% BSA的PBS)中，其終濃度2nM。棄去孔中液體，PBST洗板后加入IOOyL/孔的稀釋后的GST-Grpl-PH蛋白，室溫孵育2小時。5、以 I : 10000 的稀釋度將 HRP-conjugated anti-GST (HRP 標記的抗 GST)抗體稀釋于封閉液中。棄去孔中液體，PBST洗板后加入80 μ L/孔的稀釋后的抗體，室溫孵育I小時。6、棄去孔中液體，PBST洗板后加入100 μ L/孔的TMB顯色劑，避光顯色至藍色明顯為止。用2Μ H2SO4 5(^17孔來終止顯色，讀取00450值。抑制率的計算公式如下 抑制率(％ ) = 100 X (DMS0對照孔0D450-化合物孔0D450) / (DMS0對照孔0D450-無酶孔 0D450)。
結果分析最終PI103對PI3K α的抑制效果如圖I所示，其IC50 = 31. 2ηΜ，與文獻 艮道相"(以(Horiuchi KY, Ma H. , Fluorescence polarization and time-resolvedfluorescence resonance energy transfer techniques for PI3K assays. Methods MolBiol. 2009 ；572 :161-76.)，表明該方法的可靠性。實施例4細胞水平考察化合物對高表達Grpl-PH-EGFP細胞株綠色熒光在細胞膜表面聚集的影響將實施例I中的Rh30_GrpI-PH-EGFP細胞接種于細胞培養(yǎng)板孔內，貼壁過夜后，換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時以去除上游信號對內源性PI3Ks激活的干擾。然后，力口入待測化合物⑶C0941或DMSO對照處理細胞I小時，再加入IGF-I或溶劑對照刺激細胞10分鐘來激活人I型PI3K，用4%多聚甲醛室溫固定細胞15分鐘，然后在熒光顯微鏡下觀
察綠色熒光信號。結果如圖2所示，表明150ng/mL終濃度的IGF-I在10分鐘內可以促使綠色熒光在細胞膜表面成點狀聚集，而化合物GDC0941在I μ M的濃度下可以有效抑制這一過程的發(fā)生，這與文獻報道的⑶C0941是一個ΡΙ3Κ抑制劑的結果一致(Folkes A. J. etal., The identification of 2-(lH-indazol-4-yl)-6-(4-methanesulfonyl-piperazin-l-ylmethyl)-4-morphoIin-4-yI-thieno[3，2_d]pyrimidine(GDC-0941) as a potent,selective,orally bioavailable inhibitor of class I PI3 kinase for the treatmentof cancer. J Med Chem. 2008Sep 25 ；51 (18) :5522-32.)。實施例5細胞水平考察化合物對高表達持續(xù)活化的人I型PI3K細胞株磷酸化Akt的影響將實施例2 中的 Rh30-Myr_P110a、Rh30_Myr_Pl 10 β、Rh30-Myr-P110 y 和Rh30-Myr-P110 δ四種細胞分別接種于細胞培養(yǎng)板孔內，貼壁過夜后，換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時以去除上游信號對內源性PI3Ks激活的干擾。然后，加入待測化合物或DMSO對照處理細胞I小時，棄去培養(yǎng)液后裂解細胞，用Western blot的方法檢測細胞內抑制劑對Akt磷酸化的影響，結果如圖3所示，其中化合物GDC0941顯示出對PI3Ka有較高的選擇性抑制，化合物TGX221顯示出對ΡΙ3Κβ有較高的選擇性抑制，化合物AS604850顯示出對ΡΙ3Κ Y有較高的選擇性抑制，化合物IC87114顯示出對ΡΙ3Κ δ有較高的選擇性抑制，這個結果與相關文獻報道一致(Folkes A. J. et al. , The identi fixation of 2- (ΙΗ-indazo
1-4-yl)-6-(4-methanesulfonyl-piperazin-l-ylmethyl)-4-morpholin-4-yl_thieno[3,
2-d]pyrimidine(GDC-0941)asa potent,selective,orally bioavailable inhibitor ofclass I PI3 kinase for the treatment of cancer. J Med Chem. 2008Sep 25 ；51 (18)5522-32. Straub A.et al, Selective inhibition of the platelet phosphoinositide
3-kinasepllObeta as promising new strategy for platelet protection duringextracorporeal circulation. Thromb Haemost. 2008Mar ；99(3) :609-15. M. Camps etal.Blockade of PI3Kg suppresses joint inflammation and damage in mouse modelsof rheumatoid arthritis. Nature Medicine, 2005,11,936-943.以及 Sadhu, C. et al.，Selective role of PI3K delta in neutrophil inflammatory responses. BiochemBiophys Res Commun. 2003Sep 5 ；308 (4) :764-9.)。以上對本發(fā)明所提供的檢測化合物對人I型PI3K抑制活性的方法進行了詳細介紹，本文中應用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時，對于本領域的一般技術人員，依據(jù)本發(fā) 明的思想，在具體實施方式
及應用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發(fā)明的限制。
權利要求
1.一種檢測化合物對人I型PI3K抑制活性的方法，該方法包括 1)使用激酶體外反應體系在分子水平測定化合物對人I型PI3K的四種亞型的抑制活性，其中，使用生物素標記的磷脂酰肌醇-4，5- 二磷酸作為底物進行體外反應；和/或 2)構建Grpl-PH-EGFP高表達細胞株以綠色熒光在細胞膜上聚集程度為指標在細胞水平檢測化合物對人I型PI3K的抑制活性；和/或 3)構建表達持續(xù)活化的人I型PI3Kα、ΡΙ3Κ β、ΡΙ3Κ Y或ΡΙ3Κ δ的各亞型細胞株，以磷酸化的Akt為指標，在細胞水平檢測所述化合物對人I型ΡΙ3Κ各亞型的選擇性。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述人I型ΡΙ3Κ是純化的人I型ΡΙ3Κ的分子亞型ΡΙ3Κα、ΡΙ3Κβ、ΡΙ3Κγ和ΡΙ3Κ δ中的任一種。
3.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)中，采用ELISA方法測定所述體外反應的產物。
4.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述激酶體外反應體系包括緩沖劑=PH 6. 5的MOPS，底物生物素標記的磷脂酰肌醇-4,5- 二磷酸，以及ATP、ΡΙ3Κ、MgCl2, NaCl, NaCholate 和 DTT。
5.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟2)包括以下步驟 2-1)構建穩(wěn)定高表達Grpl-PH-EGFP蛋白的細胞株Rh30_GrpI-PH-EGFP，將該細胞接種于細胞培養(yǎng)板孔內； 2-2)將步驟2-1)中所述細胞貼壁過夜后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時，去除上游信號對內源性PI3K激活的干擾； 2-3)加入待測化合物處理細胞之后，再通過細胞因子激活人I型PI3K ;以及 2-4)觀察EGFP所產生的綠色熒光信號。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2-1)中所述的Rh30-Grpl-PH-EGFP細胞株的構建包括將含有Grpl-PH和熒光蛋白融合序列的質粒轉入Rh30細胞內，通過篩選得到單克隆穩(wěn)轉的所述Rh30-GrpI-PH-EGFP細胞株。
7.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟3)包括以下步驟 3-1)分別構建穩(wěn)定表達氮端或碳端融合了豆蘧酰化序列或法尼基化序列的人PllOa、PllO β、PllO Y或PllO δ的Rh30細胞株，使之成為表達持續(xù)活化的人I型ΡΙ3Κ的細胞株，將這四種細胞分別接種于細胞培養(yǎng)板孔內； 3-2)使步驟3-1)中所述的細胞貼壁過夜后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時，去除上游信號對內源性PI3K激活的干擾； 3-3)加入待測化合物處理細胞之后，裂解細胞；以及 3-4)用Western blot的方法檢測細胞內對Akt的磷酸化的影響。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟3-1)中所述的表達持續(xù)活化的人I型PI3K的細胞株為豆蘧酰化序列融合在人1型？131(的？110 0、？110 0、？110￥或PllO δ的氮端的Rh30細胞,或者 法尼基化序列融合在人I型PI3K的Ρ110α、Ρ110β、Ρ110γ或PllO δ的碳端的Rh30細胞。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述豆蘧酰化序列融合在人I型PI3K的PllO a、PllO β、PllOy或PllO δ的氮端的Rh30細胞的構建過程是分別在PllO a、PllO β、PllO γ和PllO δ的ORF的5’端加入豆蘧?；瘔A基序列及標簽序列后，分別插入到載體中，然后與質粒pE-ampho、pGP共轉入293FT細胞獲取病毒，用該病毒感染Rh30細胞后再通過篩選得到目的細胞株Rh30-Myr-P110 a、Rh30-Myr_P110 β、Rh30-Myr_P110 γ 或Rh30-Myr-P110 δ ； 所述法尼基化序列融合在人I型ΡΙ3Κ的PllOa、PllO β、PllO Y或PllO δ的碳端的Rh30細胞的構建過程是分別在PllO a、PllO β、PllO Y和PllO δ的ORF的3’端去掉終止密碼子并加入標簽序列以及法尼基化序列后，分別插入到載體中，然后與質粒pE-ampho、PGP共轉入293FT細胞獲取病毒，用該病毒感染Rh30細胞后再通過篩選得到目的細胞株Rh30-P110 a -CAAX、Rh30_P110 β -CAAX、Rh30_P110 y -CAAX 或 Rh30_P110 δ -CAAX ； 其中，所述豆蘧?；瘔A基序列為5 ’ -ATGGGGTCTTCAAAATCTAAACCAAAGGACCCCAGCCAGCGCCGGCGCAGAATCCGAGGT-3， 所述法尼基化序列為5 ’ -CAGCATGCTTTGAACGAGCTCGGCGCCTCCAAAGATGGCAAAAAGAAGAAGAAGAAGTCCAAGACCAAGTGCGTGATCATGTGA-3，或為 5，-CAGCATGCTTTGAACGAGCTCGGGGGCGCCAGCGGCCCCGGCTGCATGAGCTGCAAGTGCGTGCTGAGCTGA-3，。
10.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，所述人Ρ110α、Ρ110β、Ρ110γ或PllO δ的Rh30細胞株為豆蘧?；蛄腥诤显谌薎型PI3K的PllO a、PllO β、PllO Y或PllO δ的氮端的Rh30細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測化合物對人I型PI3K抑制活性的方法，該方法包括使用激酶體外反應體系在分子水平測定化合物對人I型PI3K的四種亞型的抑制活性，其中，使用生物素標記的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸作為底物進行體外反應；和/或構建Grp1-PH-EGFP高表達細胞株以綠色熒光在細胞膜上聚集程度為指標在細胞水平檢測化合物對人I型PI3K的抑制活性；和/或構建表達持續(xù)活化的人I型PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ或PI3Kδ的各亞型細胞株，以磷酸化的Akt為指標，在細胞水平檢測所述化合物對人I型PI3K各亞型的選擇性。本發(fā)明的PI3K抑制劑的活性檢測方法系統(tǒng)、準確、經濟且安全性好。
文檔編號C12Q1/48GK102719517SQ201110077540
公開日2012年10月10日 申請日期2011年3月29日 優(yōu)先權日2011年3月29日
發(fā)明者丁健, 王祥, 蒙凌華 申請人:中國科學院上海藥物研究所