專利名稱：一種核酸的檢測方法和一種試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種核酸的檢測方法，ー種采用該方法進(jìn)行核酸檢測的試劑盒，及所述檢測方法和所述試劑盒在檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
分子診斷是現(xiàn)代生物分析的前沿技術(shù)，檢測特定核酸序列是生物分析的重要內(nèi)容。常規(guī)的分子鑒定有多種技術(shù)方法，如熒光定量PCR(Qi Y. Appl Environ Microbiol,2001,67(8) :3720-3727)、RFLP (限制性酶切片段長度多態(tài)性，S. R. Klee. J. AppliedMicrobiology. 2006，100，1364-5072)、基因芯片、測序等。但這些方法操作復(fù)雜，一般需借助大型昂貴的儀器設(shè)備，耗時(shí)較長，難以普及推廣。對于需要快速鑒定診斷的某 些致病性微生物(生物武器)，如炭疽桿菌，尤其難以滿足需要。因此，發(fā)展ー種快速便捷、廉價(jià)高效、不需要復(fù)雜設(shè)備，為醫(yī)護(hù)現(xiàn)場提供診斷的分析手段具有非常重大的現(xiàn)實(shí)意義。金納米顆粒(AuNP)是直徑為I-IOOnm的膠體，其以良好的穩(wěn)定性、小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子效應(yīng)、光學(xué)效應(yīng)以及獨(dú)特的生物親和性，廣泛用于光學(xué)、電學(xué)、成像的生物分子標(biāo)記(HorisbergerM. Scanning Electron M icroscopy 11,1981:9-31)。金納米顆粒具有很高的消光系數(shù)，顆粒直徑為13nm的金納米顆粒在520nm波長左右有尖銳的吸收峰，其自組裝聚集導(dǎo)致吸收峰明顯改變，這種表面等離子共振效應(yīng)(SPR, Surface PlasmonResonance)可顯示顏色的變化。同時(shí)，金納米顆粒具有廣泛的生物親和性，DNA分子可以偶聯(lián)到金納米顆粒上，參與其自組裝過程，最終影響金納米顆粒溶液(或稱膠體金溶液)的物理特性，如顏色、吸光度等。Mirkin發(fā)現(xiàn)通過DNA特異性雜交可使AuNP-DNA顆粒自組裝團(tuán)聚，進(jìn)而出現(xiàn)膠體溶液顏色的變化，從而開創(chuàng)了 AuNP用于生物檢測的先河(Mirkin CA. Nature, 1996,382(6592) =607-609)。AuNP與巰基修飾的短鏈DNA偶聯(lián)成為檢測探針，當(dāng)溶液中存在長短一致的目標(biāo)互補(bǔ)DNA時(shí)，金納米顆粒發(fā)生有序、可逆的團(tuán)聚反應(yīng)，形成ニ維、三維的網(wǎng)狀團(tuán)聚結(jié)構(gòu),顏色可從寶石紅色變成紫藍(lán)色(Elghanian R. Science, 1997,277(22) :1078-1081)。這種聚集后溶液顏色從寶石紅到紫藍(lán)色的肉眼可觀察的顏色變化為生物分析檢測提供了ー種快速、簡便的方法，AuNP在生物檢測中顯示誘人的應(yīng)用前景。ssDNA (單鏈DNA)和dsDNA (雙鏈DNA)對AuNP具有不同的吸附能力，ssDNA可吸附至帶負(fù)電荷的金納米顆粒表面，吸附ssDNA的AuNP處于穩(wěn)定狀態(tài)，免受電解質(zhì)鹽離子引起的聚集反應(yīng)(Li H. PNAS，2004，101 (39) =14036-14039)，Li據(jù)此設(shè)計(jì)AuNP聚集反應(yīng)的核酸雜交比色檢測方法。針對心率失常相關(guān)靶基因，先進(jìn)行常規(guī)的PCR，獲得雙鏈產(chǎn)物。隨后加入膠體金溶液及一定的探針(probes),變性退火。如有特異性祀核酸的擴(kuò)增,膠體金溶液由寶石紅色變成紫藍(lán)色，反之，保持其原來寶石紅色(Li H. J. Am. Chem. Soc.，2004，216 10958-10961)。此法是ー種核酸檢測新思路，非交聯(lián)的方式不需要對AuNP和探針進(jìn)行共價(jià)修飾。但實(shí)際操作中，探針與PCR產(chǎn)物的比例不易掌握，對未知濃度樣本需要大量事先測試或?qū)CR產(chǎn)物純化、定量，從而難以實(shí)際推廣應(yīng)用。近來，利用金納米顆粒的SPR效應(yīng)與PCR技術(shù)的結(jié)合產(chǎn)生了ー種Nano-PCR的檢測方法。Cai利用寡核苷酸探針偶聯(lián)金納米顆粒，替代常規(guī)引物，利用PCR技術(shù)對HIV gpl40的外顯子序列進(jìn)行擴(kuò)增。通過肉眼比色進(jìn)行檢測，快速簡便(Miao Cai. Nano Res. 2010, 3 557-563)。但由于技術(shù)方法本身的局限性，顔色變化并不明顯，實(shí)際應(yīng)用性有限。因此，需要開發(fā)ー種簡便易行、顏色變化明顯的核酸檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供ー種快速簡便、肉眼即可觀察到顯著顏色變化的核酸檢測方法及利用該方法進(jìn)行核酸檢測的試劑盒和該方法與該試劑盒在檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)利用金納米顆粒進(jìn)行核酸檢 測的方法中的顏色變化并不顯著，其主要原因在于探針與待測核酸之間的結(jié)合效率低，從而使得探針上的金納米顆粒的SPR效應(yīng)不強(qiáng)。增加探針與待測核酸之間的結(jié)合效率的方法有很多，但是有些方法本身很繁瑣，并不適用于快速簡便的進(jìn)行檢測，另外，有些方法需要對每次檢測的體系進(jìn)行摸索和優(yōu)化，才能得到較好的效果，因此，這些方法都不具備實(shí)際應(yīng)用的便利性。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用不對稱PCR代替現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)PCR，能夠制得單鏈含量較高的待測核酸，并提高探針與待測核酸之間的雜交效率，從而能夠進(jìn)一歩的增強(qiáng)探針中金納米顆粒的SPR效應(yīng)，使溶液發(fā)生顯著的顏色變化。本發(fā)明提供ー種核酸的檢測方法，其特征在于，該方法包括提供待測核酸，在不對稱PCR的反應(yīng)條件下，在PCR緩沖溶液中，使待測核酸與能夠擴(kuò)增靶核酸的ー對弓I物、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸接觸，將接觸所得產(chǎn)物與含有探針分子的液體混合，通過觀測得到的混合物的顔色或顏色變化，判斷待測核酸中是否含有靶核酸。本發(fā)明還提供一種采用上述的檢測方法進(jìn)行核酸檢測的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括(I)能夠擴(kuò)增靶核酸的ー對引物，所述ー對引物為上游引物和下游引物，且上游引物和下游引物的摩爾比滿足不對稱PCR反應(yīng)要求，一對引物獨(dú)立存放或以混合物的形式存放；(2)相對于所述ー對引物或其混合物獨(dú)立存放的所述含有探針分子的液體。此外，本發(fā)明還提供上述方法或上述試劑盒在檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的方法對已知的含有炭疽桿菌基因組DNA片段的待測核酸進(jìn)行檢測首先以待測核酸為模板進(jìn)行不對稱PCR，然后將該不對稱PCR的產(chǎn)物與含有靶向該炭疽桿菌基因組中特定的DNA片段的探針分子的液體(雜交液)混合，能夠在2分鐘之內(nèi)，觀測到明顯的顏色變化，而對已知的不含有炭疽桿菌基因組DNA片段的待測核酸進(jìn)行檢測，卻觀察不到任何的顏色變化。由此可見，本發(fā)明提供的方法是ー種快速簡便、敏感特異、不需要額外的設(shè)備、直接用肉眼觀測的核酸檢測方法。并且，即使用于50 μ L不對稱PCR反應(yīng)的模板核酸的量僅為O. Olng,取5 μ L的不對稱PCR的產(chǎn)物與10 μ L探針濃度為I. 5 μ M的含有探針的液體混合，也能夠觀察到明顯的顏色變化，說明本發(fā)明的方法靈敏度很高，且對操作條件的要求并不苛刻。除了能夠檢測炭疽桿菌以外，通過該方法對小鼠β-actin以及霍亂弧菌的DNA片段進(jìn)行檢測的效果也都十分明顯，說明本發(fā)明的方法具有一定的普適性。


圖I為本發(fā)明一種實(shí)施方式中所用的金納米顆粒的TEM圖；圖2為本發(fā)明一種實(shí)施方式中不對稱PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3為本發(fā)明一種實(shí)施方式中不對稱PCR產(chǎn)物與含有探針的液體混合后顏色變化的結(jié)果；圖4為本發(fā)明一種實(shí)施方式中對檢測方法的敏感性進(jìn)行測試的結(jié)果；圖5為本發(fā)明一種實(shí)施方式中對檢測方法的特異性進(jìn)行測試的結(jié)果 ；圖6為本發(fā)明另ー種實(shí)施方式中不對稱PCR產(chǎn)物與含有探針的液體混合后顏色變化的結(jié)果；圖7為本發(fā)明再一種實(shí)施方式中不對稱PCR產(chǎn)物與含有探針的液體混合后顏色變化的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了ー種核酸的檢測方法，其特征在于，該方法包括提供待測核酸，在不對稱PCR的反應(yīng)條件下，在PCR緩沖溶液中，使待測核酸與能夠擴(kuò)增靶核酸的ー對引物、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸接觸，將接觸所得產(chǎn)物與含有探針分子的液體混合，通過觀測得到的混合物的顔色或顏色變化，判斷待測核酸中是否含有靶核酸。所述待測核酸可以為任何核酸樣品，例如，從待測樣本中提取出來的核酸樣品、PCR擴(kuò)增得到的核酸樣品或通過人工合成得到的核酸樣品。根據(jù)本發(fā)明，所述不對稱PCR(asymmetric PCR)為本領(lǐng)域公知的概念,是用不等量的ー對引物，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA的方法。這對引物分別稱為非限制引物與限制性引物，在PCR反應(yīng)初期，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA，不對稱PCR的關(guān)鍵是控制限制性引物的絕對量。本發(fā)明中，沿用非限制性引物和限制性引物的概念，并且，所述非限制性引物和限制性引物為能夠擴(kuò)增靶核酸的ー對引物。根據(jù)本發(fā)明，所述不對稱PCR的反應(yīng)條件可以為本領(lǐng)域常規(guī)的反應(yīng)條件，根據(jù)待測核酸的不同，反應(yīng)條件相應(yīng)的有所差別，由于在檢測時(shí)，不知道待測核酸中是否含有靶核酸，因此不對稱PCR可能發(fā)生，也可能不會(huì)發(fā)生，但是，無論待測核酸中是否含有靶核酸，都要進(jìn)行同樣的不對稱PCR的操作。因此，需要特別說明的是，本發(fā)明中，所述進(jìn)行不對稱PCR反應(yīng)或進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)并不意指一定能夠?qū)崿F(xiàn)擴(kuò)增，而是指加入的組分和反應(yīng)條件都符合不對稱PCR的要求，或整個(gè)體系進(jìn)行了不對稱PCR或常規(guī)PCR的反應(yīng)過程。根據(jù)本發(fā)明，所述不對稱PCR的反應(yīng)條件包括，預(yù)變性溫度可以為90_98°C，變性溫度可以為90-98°C，退火溫度可以為40-60°C，延伸溫度可以為70-75°C，循環(huán)數(shù)優(yōu)選為大于10，進(jìn)ー步優(yōu)選為30-40 ;所述能夠擴(kuò)增靶核酸的一對引物包括限制性引物和非限制性引物，且限制性引物和非限制性引物的摩爾比根據(jù)不同的靶核酸有所不同，本發(fā)明對限制性引物和非限制性引物的摩爾比沒有特別的限定，只要能夠滿足不對稱PCR反應(yīng)要求即可，優(yōu)選地，所述限制性引物和非限制性引物的摩爾比為I : 5-240，進(jìn)ー步優(yōu)選為I 10-100;所述限制性引物和非限制性引物具體序列的選擇可以通過本領(lǐng)域公知的方法，根據(jù)所述祀核酸進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化，例如可以利用生物學(xué)軟件Primer Premier、Oligo、DNAMAN等輔助進(jìn)行設(shè)計(jì)。根據(jù)本發(fā)明，不對稱PCR反應(yīng)中加入的各種組分可與本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)相同，其中，所述PCR緩沖溶液指的是與DNA聚合酶的反應(yīng)條件相對應(yīng)的緩沖溶液，一般地，PCR緩沖溶液都隨商品化酶附送，所述PCR緩沖溶液加入的體積根據(jù)不同的DNA聚合酶自帶的PCR緩沖溶液的濃度而定，通常以所述接觸所得產(chǎn)物的體積為基準(zhǔn)，所述PCR緩沖溶液加入的體積為5-50%，如本發(fā)明中，所述酶附送的PCR緩沖溶液為2XPCR緩沖溶液，因此，加入的體積為接觸所得產(chǎn)物的體積的50%。PCR緩沖溶液的pH值優(yōu)選為8. 5-9. 5，進(jìn)ー步優(yōu)選為8. 5-8. 8，所述待測核酸的加入量可以在ー個(gè)較寬泛的范圍內(nèi)變化，以能夠擴(kuò)增出足夠下一歩與含有探針的液體進(jìn)行混合并呈現(xiàn)出明顯的顏色變化為準(zhǔn)。所述待測核酸的加入量可以為O. OOl-lOOOnM，根據(jù)本發(fā)明，待測核酸可以為短的人工合成片段，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，也可以為長的基因組DNA，若待測核酸為短的人工合成片段或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，優(yōu)選終濃度為O. Ol-IOnM,若待測核酸為基因組DNA，則優(yōu)選終濃度為10_300nM，因此，總的來說，所述待測核酸的終濃度優(yōu)選為0. 01-300nM，一般地，也可以以重量計(jì)，以50 μ I體積的不對稱PCR反應(yīng)體系為例，所述待測核酸的優(yōu)選加入量為IOpg-I μ g,進(jìn)ー步優(yōu)選為0. Ing-IOOng0所述DNA聚合酶的種類和加入量均可與現(xiàn)有技術(shù)相同，例如加入的終濃度為0. 01-0. 2U/y L，優(yōu)選為0. 02-0. 03U/ μ L,如本發(fā)明中使用了 Promega PCR Master mix (2x)擴(kuò)增系統(tǒng),聚合酶的終濃度為0. 025U/ μし一般地，所述三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(即4XdNTP)中每種核苷酸的加入量均可為常規(guī)值，例如可以為50-500 μ M，進(jìn)ー步優(yōu)選為100-300 μ Μ，如本發(fā)明中dNTP的終濃度為200 μ M0在滿足上述比例的前提下，所述能夠擴(kuò)增靶核酸的ー對引物的加入量，即ー對引物的總量根據(jù)不同的靶標(biāo)有所不同，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選為0. 1-10μΜ，進(jìn)ー步優(yōu)選為0. 3-3 μ M0根據(jù)本發(fā)明，將接觸所得產(chǎn)物與含有探針分子的液體的混合優(yōu)選在無機(jī)鹽MX存在下進(jìn)行，其中，M為Na和/或K，X為Cl、Br或I中的ー種或多種，所述MX優(yōu)選為NaCl，且優(yōu)選地，無機(jī)鹽MX的加入量使得所述混合物中MX的終濃度為0. 5-1M，最優(yōu)選為0. 8-1M。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，所述混合物中存在上述濃度范圍內(nèi)的氯化鈉能夠使得當(dāng)待測核酸含有靶核酸時(shí)，檢測體系出現(xiàn)極為明顯的顏色變化。根據(jù)本發(fā)明，由于PCR緩沖溶液中也可能含有MX，因此，此處的MX的總濃度也包括PCR緩沖溶液中的MX，但是一般地，PCR緩沖溶液中MX的含量較低，尤其是當(dāng)只取一部分不對稱PCR的產(chǎn)物與含有探針的液體進(jìn)行混合的時(shí)候，由PCR緩沖溶液中引入的MX的量是很少的，因此大多可忽略不計(jì)，此處所述MX主要為混合時(shí)另外加入的MX,或者M(jìn)X可以預(yù)先與含有探針的液體混合。根據(jù)本發(fā)明，將接觸所得產(chǎn)物與含有探針分子的液體混合的條件極為寬松，包括，溫度以不低于10°c為好，因?yàn)樘偷臏囟仍斐煞肿硬祭蔬\(yùn)動(dòng)明顯降低，不利于核酸的雜交，溫度的上限低于雜交序列的Tm值，一般的，將接觸所得產(chǎn)物與含有探針分子的液體混合的溫度可以為15-55°C，優(yōu)選為20-50°C，最優(yōu)選為室溫，即22_25°C ;將接觸所得產(chǎn)物與含有探針分子的液體混合的時(shí)間可以為1-60分鐘，優(yōu)選為3-10分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明了，此處所述混合的時(shí)間為能夠觀察到顏色變化的最短時(shí)間，即使混合時(shí)間比上述時(shí)間更長，一祥能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明，并且顏色變化更為明顯。
根據(jù)本發(fā)明，以所述混合物的體積為基準(zhǔn)，所述含有探針分子的液體中探針分子的濃度優(yōu)選為500-1500nM，進(jìn)ー步優(yōu)選為600_1000nM，如果為長期儲(chǔ)存可以以更高的濃度作為儲(chǔ)存液，如以所述含有探針分子的液體的體積為基準(zhǔn)，所述探針分子的濃度可以為2_4 u M0根據(jù)本發(fā)明，所述含有探針分子的液體中的探針分子可包括多種偶聯(lián)物，每種偶聯(lián)物由一種納米顆粒與ー種或多種寡核苷酸形成，每種寡核苷酸的至少部分均與靶核酸的一條鏈的一部分互補(bǔ)。優(yōu)選地，至少兩種寡核苷酸的至少部分與靶核酸的同一條鏈的一部分互補(bǔ)；所述寡核苷酸的至少部分與靶核酸互補(bǔ)是指，寡核苷酸可以完全與靶核酸中一部分互補(bǔ)，也可以是寡核苷酸中一部分與靶核酸中的一部分互補(bǔ)，而另一部分不互補(bǔ)，例如，寡核苷酸中靠近納米顆粒的部分與靶核酸不互補(bǔ)，而遠(yuǎn)離納米顆粒的部分與靶核酸互補(bǔ)，互補(bǔ)的程度以二者能夠形成穩(wěn)定的雜交體為準(zhǔn)。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)是為了提高探針與靶核酸之間的結(jié)合能力，進(jìn)而增強(qiáng)探針上金納米顆粒之間的SPR效應(yīng)，因此，遠(yuǎn)離納米顆粒的部分與靶核酸互補(bǔ)是為了增強(qiáng)探針與靶核酸之間的結(jié)合能力，而靠近納米顆粒的部分與靶核酸可 以不互補(bǔ)則是為了避免可能存在的，由于寡核苷酸的位阻或剛性所導(dǎo)致的探針上的金納米顆粒之間的SPR效應(yīng)變?nèi)?。在本發(fā)明的發(fā)明宗g的引導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)實(shí)際情況，對探針，即寡核苷酸序列及其與納米顆粒的連接方式進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和改變，以便能更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，這些內(nèi)容應(yīng)視為屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述偶聯(lián)物，S卩，將納米顆粒與寡核苷酸進(jìn)行偶聯(lián)所得的產(chǎn)物，偶聯(lián)為本領(lǐng)域公知的概念，即，兩個(gè)化學(xué)實(shí)體(或単位)結(jié)合生成ー個(gè)分子的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，所述偶聯(lián)的方法可以為本領(lǐng)域公知的方法，如，當(dāng)納米顆粒為金納米顆粒時(shí)，可將寡核苷酸的5’末端進(jìn)行巰基修飾(如5’末端堿基上的C6位置)，然后與金納米顆粒接觸，通過形成穩(wěn)定的Au-S鍵將二者偶聯(lián)在一起。5’末端為巰基修飾的寡核苷酸可以通過本領(lǐng)域常規(guī)的合成方法得到，如用DNA合成儀進(jìn)行固相合成，也可以通過商購獲得。根據(jù)本發(fā)明，所述探針分子可以為兩種偶聯(lián)物，也可以為多種偶聯(lián)物，一種偶聯(lián)物中可以含有ー種納米顆粒和ー種寡核苷酸，也可以含有ー種納米顆粒和多種寡核苷酸，優(yōu)選地，所述含有探針分子的液體中的探針分子包括兩種偶聯(lián)物，每種偶聯(lián)物為ー種納米顆粒與ー種寡核苷酸的偶聯(lián)物，兩種偶聯(lián)物中的納米顆粒相同，寡核苷酸不相同，且兩種偶聯(lián)物的摩爾比為I : O. 8-1. 2，由于制備偶聯(lián)物的過程一致，相對投料量相同，制得的兩種偶聯(lián)物的濃度是基本一致的，因此，在實(shí)際應(yīng)用中，只要取相同體積的兩種的偶聯(lián)物進(jìn)行混合，二者的摩爾比即能符合上述比例，可以不進(jìn)行嚴(yán)格的測定，當(dāng)然，也可以通過測定260nm或520nm處的吸光度值來確定，來精確計(jì)算兩種偶聯(lián)物的摩爾比，本發(fā)明實(shí)施例中通過測定OD值精確控制二者的摩爾數(shù)滿足上述要求，且比例為I : I。根據(jù)本發(fā)明，對所述寡核苷酸的長度沒有特別的限定，優(yōu)選地，所述寡核苷酸的長度為10-50個(gè)核苷酸，進(jìn)ー步優(yōu)選為15-25個(gè)核苷酸，在上述范圍內(nèi)可以獲得最佳的偶聯(lián)效率。寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)原則包括，寡核苷酸的3’端，優(yōu)選不含有多個(gè)C或G，寡核苷酸的序列優(yōu)選不存在潛在的自身互補(bǔ)或形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能力等。根據(jù)本發(fā)明，在滿足上述要求的前提下，對所述偶聯(lián)物中的納米顆粒的顆粒直徑?jīng)]有特別的限定，優(yōu)選地，所述偶聯(lián)物中的納米顆粒的顆粒直徑為5-100nm，優(yōu)選為10_20nm。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，只要能夠通過相對空間距離的變化產(chǎn)生顏色變化的納米顆粒均可以用于本發(fā)明，目前，所述偶聯(lián)物中的納米顆粒優(yōu)選為金納米顆粒，進(jìn)ー步優(yōu)選為顆粒直徑約為13nm的金納米顆粒。本發(fā)明中，選擇粒徑約為13nm的金納米顆粒的原因是制備方法簡便、穩(wěn)定；粒徑差異小，形貌一致，穩(wěn)定性好；顆粒在520nm處有尖鋭狹窄的吸收峰，一旦峰值偏移，SPR效應(yīng)導(dǎo)致的顏色變化明顯，肉眼容易辨別。但是本發(fā)明并不限于這ー種納米顆粒。根據(jù)本發(fā)明，所述靶核酸可以為任何生物物種的核酸或其核酸中的一部分，尤其通過對核酸中特征序列部分的檢測，可以確定待測核酸中是否含有某種物種的核酸。在應(yīng)用于有害病毒和細(xì)菌的檢驗(yàn)檢疫時(shí)，所述靶核酸可以為炭疽桿菌、霍亂弧菌、鼠疫桿菌、野兔熱桿菌、傷寒桿菌、布氏桿菌、天花病毒、黃熱病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、班疹傷寒立克次體、肉毒桿菌毒素、鳥疫衣原體、肉毒桿菌毒素、葡萄球菌腸毒素、粗球孢子菌、莢膜組織胞漿菌中至少ー種的基因組中的至少一部分。優(yōu)選地，所述靶核酸為炭疽桿菌、霍亂弧菌的基因組中的至少一部分。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，本發(fā)明適用的靶核酸并不限 于以上所述物種，為了驗(yàn)證體系的可能性，本發(fā)明的發(fā)明人首先選取了管家基因，小鼠的β -肌動(dòng)蛋白(β -actin)，作為研究対象，因?yàn)楣芗一虻难芯拷Y(jié)果對其他基因具有普遍的指導(dǎo)意義，這也是研究新體系的一般模式。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)見，當(dāng)檢驗(yàn)的目的為待測樣品中是否含有某些有害病毒或細(xì)菌而不必知道具體含有的是哪幾種時(shí)，可以同時(shí)加入多個(gè)探針進(jìn)行檢測，只要出現(xiàn)陽性結(jié)果，則表明必然含有某幾種致病病毒(或病菌)中的至少ー種。例如，所述靶核酸的序列可以為炭疽桿菌基因組DNA(或其中的序列片段)，所述限制性引物的序列如SEQ ID NO :1所示，所述非限制性引物的序列如SEQ ID NO :2所示，且限制性引物與非限制性引物的摩爾比為I : 10-100，更優(yōu)選的比例根據(jù)擴(kuò)增的靶標(biāo)序列的不同而不同，且對于特定的靶標(biāo)序列，更優(yōu)選地比例可以通過常規(guī)的試驗(yàn)方法得到；所述探針為金納米顆粒與寡核苷酸形成的兩種偶聯(lián)物，第一偶聯(lián)物為金納米顆粒與SEQ ID NO 3所示的寡核苷酸形成的偶聯(lián)物，第二偶聯(lián)物為金納米顆粒與SEQ ID NO :4所示的寡核苷酸形成的偶聯(lián)物，且第一偶聯(lián)物與第二偶聯(lián)物的摩爾比為I : O. 8-1. 2，進(jìn)ー步優(yōu)選為I : I。根據(jù)本發(fā)明，所述檢測的方法可以為分光光度法和/或目視比色法，優(yōu)選地，目視比色法即通過肉眼看出顔色的變化，并且不需要額外的儀器設(shè)備，能夠滿足快速、便捷的要求。偶聯(lián)物如果未結(jié)合靶核酸，其最大吸收峰在524nm處，如果結(jié)合了靶核酸，引發(fā)SPR效應(yīng)，則最大吸收峰發(fā)生紅移(red-shift)，文獻(xiàn)報(bào)道最大吸收峰飄移7nm以上吋，肉眼可分辨。本發(fā)明中，對于不同靶標(biāo)核酸的檢測，其最大吸收峰的位置不同，如對于小鼠β-actin進(jìn)行檢測時(shí)，其最大吸收峰飄移至575nm，肉眼很容易分辨，而對于炭疽桿菌基因組DNA進(jìn)行檢測時(shí)，其最大吸收峰飄移至537nm，肉眼也能夠十分明顯的分辨；由于偶聯(lián)物與靶核酸結(jié)合，金納米顆粒會(huì)團(tuán)聚從而導(dǎo)致由于單分散性金納米顆粒有效濃度的減少造成的吸收峰強(qiáng)度的降低，一般地，2-10分鐘內(nèi)能夠觀察到明顯的顏色變化，當(dāng)把偶聯(lián)物與靶核酸的混合物放置過夜或更長時(shí)間后，團(tuán)聚的金納米顆粒會(huì)發(fā)生沉淀，因而溶液顔色已經(jīng)不是紫藍(lán)色，而是逐漸變得澄清，因此上清液的最大吸收峰波長會(huì)隨時(shí)間發(fā)生變化，最大吸收峰強(qiáng)度也會(huì)進(jìn)ー步降低，直至無法檢測到。由此可以看出，在偶聯(lián)物與靶核酸結(jié)合的初期，能夠通過肉眼觀察到明顯的紅-藍(lán)顏色轉(zhuǎn)化，當(dāng)結(jié)合的時(shí)間較長后，則能通過肉眼觀察到明顯的溶液變澄清的現(xiàn)象，即，只要待測核酸中含有足夠檢出量的靶核酸，根據(jù)本發(fā)明的檢測方法就可以通過肉眼十分清晰 的觀察到顔色的變化，從而判讀檢測結(jié)果。本發(fā)明還提供了一種采用上述的檢測方法進(jìn)行核酸檢測的試劑盒，其特征在干，該試劑盒包括(I)能夠擴(kuò)增靶核酸的ー對引物，所述ー對引物為限制性引物和非選擇性引物，且限制性引物和非限制性引物的摩爾比滿足不對稱PCR反應(yīng)要求，具體的，所述限制性引物和非限制性引物的摩爾比為I : 5-240，進(jìn)ー步優(yōu)選為I : 10-100 ; —對引物獨(dú)立存放或以混合物的形式存放，優(yōu)選地，以混合物的形式存放；(2)相對于所述ー對引物或其混合物獨(dú)立存放的上述含有探針分子的液體。其中，所述試劑盒中各個(gè)組分的量可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行調(diào)整。根據(jù)本發(fā)明，由于DNA聚合酶、PCR緩沖溶液和4X dNTP為本領(lǐng)域常規(guī)的試劑，并且DNA聚合酶的存放條件相對較苛刻，因此，所述試劑盒中優(yōu)選不包括上述組分，當(dāng)然也可以包括上述組分PCR緩沖溶液、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸中的ー種或多種，其中，DNA聚合酶獨(dú)立存放，進(jìn)ー步優(yōu)選為獨(dú)立低溫存放；其他組分各自獨(dú)立存放或以ー種或多種組分的混合物的形式存放。上述組分的相對量，濃度等可以與前文描述相同，在此不再贅述。本發(fā)明所述的方法和所述的試劑盒可以應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域，尤其適用于需要快速進(jìn)行檢測的場合，如車站、機(jī)場、海關(guān)等。下面，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。由于本發(fā)明的方法具有普適性，因此，選取具有代表性的幾種靶核酸進(jìn)行檢測，包括小鼠的β-actin基因，其基因的NCBI Genbank號為NM_007393. 2 ;小鼠β-actin基因的一部分，如 SEQ ID NO 5 所示5’ -CTT CTC TTT GAT GTC ACG CAT ATG GAA TCC TGT GGCATC-3’;炭疽桿菌的基因組DNA中的特定序列片段，其NCBI Genbank號為AF_360750. I ;以及霍亂弧菌的CTX-A基因，其NCBI Genbank號為EU_546136. I。其中，炭疽桿菌基因組DNA和霍亂弧菌基因組DNA由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng)。其中，測試用TEM為TECNAI公司的G2 F30透射電鏡；紫外可見分光光度計(jì)為微量紫外可見-熒光分光光度計(jì)e-spect ;寡核苷酸序列(包括常規(guī)的和5’巰基修飾的)委托Invitrogen公司進(jìn)行合成；Nap_5純化柱購自GE公司；所用DNA聚合酶為Promega DNA聚合酶，所用PCR緩沖液為Promega聚合酶附帶的Promega PCR Mix (2 X)緩沖液；用于克隆小鼠β -actin基因序列及其中片段的不對稱PCR和常規(guī)PCR的程序?yàn)?4°C, 2min ；94°C，20sec ；55°C,20sec ；70°C,20sec ；32 個(gè)循環(huán)，70°C，3min，用于克隆炭疽桿菌中的序列片段的不對稱 PCR 的程序?yàn)?940C，3min ；94°C，30sec ；40°C，30sec ；72°C, 30sec ；40 個(gè)循環(huán)，72°C，5min ;用于克隆霍亂弧菌CTX-A基因的不對稱PCR的程序?yàn)?4°C，3min ;94°C，25sec ；60°C，20sec ；72°C,25sec ；40cycles ;72°C，5min ;使用 Promega 的總 RNA提取試劑盒從小鼠肝臟中分離得到小鼠的總RNA，然后通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。本發(fā)明實(shí)施例中所用常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純，所述納米級水通過美國Mi 11 ipore公司的Mi 11 i_Q超純水系統(tǒng)得到,其他的分子生物學(xué)操作參考試劑附帶的說明書和《分子克隆》(第三版)進(jìn)行。制備例I
本制備例用于合成顆粒直徑約為13nm的金納米顆粒。采用經(jīng)典的氯金酸-檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒。所有玻璃容器用王水浸泡，然后用納米級水漂洗浄，干燥備用。在50mL三角燒瓶中，加入40mL的納米級水及O. 4mL、lg/mL的HAuC14(氯金酸)，用磁力攪拌器劇烈攪拌均勻，加熱至沸騰。隨后快速一次性加入I. 2mL、lg/mL的檸檬酸鈉，溶液逐步從淺黃至深紅。繼續(xù)加熱15分鐘，隨后停止加熱，繼續(xù)攪拌自然降溫至室溫。密閉溶液并在4°C避光保存，用紫外-可見光分光光度計(jì)在520nm處測量最大吸收峰，計(jì)算濃度為3nM。取IOyL樣品滴加銅網(wǎng)，真空抽干，用透射電鏡(TEM)表征，結(jié)果如圖I所示，納米金顆粒的粒徑約為13nm，圓型，均勻一致，單分散性良好。制備例2根據(jù)小鼠β-actin的cDNA序列，選擇合適的雜交位點(diǎn)，并據(jù)此設(shè)計(jì)限制性引物 P1、非限制性引物P2及寡核苷酸Oligol和01igo2，用于后續(xù)的分子雜交，序列分別如下Pl :5，-GAT GCC ACA GGA TTC CAT A-3’ (SEQ ID NO 6)；P2 :5’ -CTT CTC TTT GAT GTC ACG CA-3’ (SEQ ID NO 7)；Oligol :5，-TGC GTG ACA TCA AAG AGA AG-3’ (SEQ ID NO 8)；01igo2 :5，-GAT GCC ACA GGA TTC CAT A-3’ (SEQ ID NO 9)；其中，用于偶聯(lián)的Oligol和01igo2的5’端堿基的C6被巰基修飾。需要說明的是，本發(fā)明實(shí)施例中所用的探針中的寡核苷酸均為商購的5’端堿基的C6位置上進(jìn)行巰基修飾的寡核苷酸。制備例3本制備例用于制備含有探針的液體。將50D巰基修飾的寡核苷酸干粉溶于80 μ L的ニ硫化物裂解液(170mM磷酸緩沖液，pH8. O)中，待完全溶解后得到寡核苷酸的溶液，將其分成4管，每管20μし將DTT(ニ硫蘇糖醇)也溶于ニ硫化物裂解液中，得到新鮮配制的O. IM的DTT溶液。加SOyL的上述DTT溶液至20 μ L的上述寡核苷酸的溶液中，得到100 μ LDNA的DTT還原液，用鋁箔將其包裹置于室溫反應(yīng)I小時(shí)，每半小時(shí)渦旋振蕩5秒。與此同時(shí)，用至少IOmL以上的納米級純水預(yù)洗Nap-5純化柱備用。將反應(yīng)后的100 μ L的DNA的DTT還原液上樣到Nap-5純化柱中，加入400 μ L的Milli-Q水洗柱，最后加入500 μ L的Milli-Q水洗脫，得到含巰基的寡核苷酸樣品，收集樣品于I. 5mL的離心管中，用紫外可見光分光光度計(jì)測定OD26tl值進(jìn)行定量。在9000 X g，4°C下離心15分鐘，濃縮金納米顆粒(Au-NPs)至17nM，按照含巰基的寡核苷酸Au-NPs = 200 I的比例(摩爾比)混合。用鋁箔將其包裹，低速水平振搖，室溫下振搖16小時(shí)或37°C下振搖8小吋。隨后將溶液調(diào)為NaCl濃度為O. 1M、磷酸鹽濃度為IOmM的磷酸緩沖液(pH = 7. O)，室溫孵育40小時(shí)繼續(xù)偶聯(lián)。將所得偶聯(lián)物在HOOOrpm離心25-40分鐘，移去上清；用含有O. IM的NaCl、IOmM磷酸鹽的磷酸緩沖液(pH = 7. O)重懸、離心3次，洗滌沉淀，充分去除未結(jié)合的單鏈DNA。偶聯(lián)物最后溶于O. 3M的NaCl、0. 01重量％的疊氮化鈉、IOmM磷酸鹽的磷酸緩沖液(pH = 7. O)中，4°C下避光保存。正常功能化的納米金顔色同修飾前ー樣為寶石紅，無顆粒聚集。根據(jù)上述方法分別制得含有探針Probel和Probe2的液體,探針Probel和Probe2分別為Oligol和01igo2與金納米顆粒的偶聯(lián)物(即上述巰基修飾的寡核苷酸干粉分別為Oligol和01igo2的干粉)，且以含有探針的液體的體積為基準(zhǔn)，所述Probel和Probe2的濃度均為I. 5 μ Μ。實(shí)施例I進(jìn)行不對稱PCR，建立50 μ L的不對稱PCR反應(yīng)體系，加樣如表I所示。表I
組分終濃度
模板Ing/ μ L 4 XdNTP每種 200 μ M
Promega PCR MixIX
Promega DNA 聚合酶O. 025U/ μ L
PlO. 02 μ M
Ρ2O. 6μΜ
ddH20全 50 μ L其中，模板可以為小鼠的cDNA ;也可以為小鼠cDNA中的一段，如SEQ ID NO :5所示序列的DNA。本實(shí)施例中模板為SEQ ID NO :5所示序列的DNA，通過商購得到。實(shí)施例2進(jìn)行不對稱PCR，加樣體系如表2所示。表 2
組分終濃度
模板Ing/ μ L
4 XdNTP每種 200 μ M
Promega PCR MixIX
Promega DNA 聚合酶O. 025U/ μ L
PlO. 01 μ M
Ρ2O. 6μΜ
ddH20至 50 μ L其中，本實(shí)施例中模板為SEQ ID NO5所示序列的DNA。實(shí)施例3
進(jìn)行不對稱PCR，加樣體系如表3所示。表權(quán)利要求
1.ー種核酸的檢測方法，其特征在于，該方法包括提供待測核酸，在不對稱PCR的反應(yīng)條件下，在PCR緩沖溶液中，使待測核酸與能夠擴(kuò)增靶核酸的ー對引物、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸接觸，將接觸所得產(chǎn)物與含有探針分子的液體混合，通過觀測得到的混合物的顔色或顏色變化，判斷待測核酸中是否含有靶核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其中，不對稱PCR的反應(yīng)條件包括，預(yù)變性溫度為90-98°C，變性溫度為90-98°C，退火溫度為40_60°C，延伸溫度為70_75°C，循環(huán)數(shù)大于10 ；所述能夠擴(kuò)增靶核酸的一對引物包括限制性引物和非限制性引物，且限制性引物和非限制性引物的摩爾比為I : 5-240。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其中，循環(huán)數(shù)為30-40;且限制性引物和非限制性引物的摩爾比為I : 10-100。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的檢測方法，其中，以所述接觸所得產(chǎn)物的體積為基準(zhǔn)，所述PCR緩沖溶液加入的體積為5-50%，且PCR緩沖溶液的pH值為8. 5-9. 5，所述待測核酸的加入量為O. OOl-lOOOnM，所述DNA聚合酶的加入量為0. 01-0. 2U/y L，所述三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸各自的加入量為50-500 μ Μ，所述能夠擴(kuò)增靶核酸的ー對引物的加入量為 0. 1-5 μ Mo
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其中，以所述接觸所得產(chǎn)物的體積為基準(zhǔn)，所述待測核酸的加入量為l_300nM，所述DNA聚合酶的加入量為0. 01-0. IU/ μ L，所述三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸各自的加入量為100-300 μ Μ，所述能夠擴(kuò)增靶核酸的ー對引物的加入量為O. 3_3 u Mo
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的檢測方法，其中，將接觸所得產(chǎn)物與含有探針分子的液體混合在無機(jī)鹽MX存在下進(jìn)行，M為Na和/或K，X為Cl、Br或I中的一種或多種，無機(jī)鹽MX的加入量使得所述混合物中無機(jī)鹽MX的濃度為0. 5-1. 5摩爾/升。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的檢測方法，其中，將接觸所得產(chǎn)物與含有探針分子的液體混合的條件包括，溫度不低于10°c，時(shí)間為1-60分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的檢測方法，其中，以所述混合物的體積為基準(zhǔn)，所述含有探針分子的液體中探針分子的濃度為500-1500nM。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的檢測方法，其中，所述含有探針分子的液體中的探針分子包括多種偶聯(lián)物，每種偶聯(lián)物由一種納米顆粒與ー種或多種寡核苷酸形成，每種寡核苷酸中的至少部分均與靶核酸的一條鏈的一部分互補(bǔ)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其中，所述含有探針分子的液體中的探針分子包括兩種偶聯(lián)物，每種偶聯(lián)物為ー種納米顆粒與ー種寡核苷酸的偶聯(lián)物，兩種偶聯(lián)物中的納米顆粒相同，寡核苷酸不相同，且兩種偶聯(lián)物的摩爾比為I : 0.8-1.2。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的檢測方法，其中，所述寡核苷酸的長度為10-50個(gè)核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任意一項(xiàng)所述的檢測方法，其中，所述偶聯(lián)物中的納米顆粒的顆粒直徑為5-100納米。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12中任意一項(xiàng)所述的檢測方法，其中，所述偶聯(lián)物中的納米顆粒為金納米顆粒。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任意一項(xiàng)所述的檢測方法，其中，所述靶核酸為炭疽桿菌、霍亂弧菌、鼠疫桿菌、野兔熱桿菌、傷寒桿菌、布氏桿菌、天花病毒、黃熱病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、班疹傷寒立克次體、肉毒桿菌毒素、鳥疫衣原體、肉毒桿菌毒素、葡萄球菌腸毒素、粗球孢子菌、莢膜組織胞漿菌中至少ー種的基因組中的至少一部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的檢測方法，其中，所述靶核酸為炭疽桿菌基因組DNA，所述限制性引物的序列如SEQ ID NO :1所示，所述非限制性引物的序列如SEQ ID NO :2所示，且限制性引物與非限制性引物的摩爾比為I : 10-100 ;所述探針為金納米顆粒與寡核苷酸形成的兩種偶聯(lián)物，第一偶聯(lián)物為金納米顆粒與SEQ ID NO :3所示的寡核苷酸形成的偶聯(lián)物，第二偶聯(lián)物為金納米顆粒與SEQ ID NO :4所示的寡核苷酸形成的偶聯(lián)物，且第一偶聯(lián)物與第二偶聯(lián)物的摩爾比為I : O. 8-1.2。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任意一項(xiàng)所述的檢測方法，其中，所述檢測的方法為目視比色法。
17.ー種采用權(quán)利要求1-16中任意一項(xiàng)所述的檢測方法進(jìn)行核酸檢測的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括 (1)能夠擴(kuò)增靶核酸的ー對引物，所述ー對引物為限制性引物和非限制性引物，且限制性引物和非限制性引物的摩爾比滿足不對稱PCR反應(yīng)要求，一對引物獨(dú)立存放或以混合物的形式存放； (2)相對于所述ー對引物或其混合物獨(dú)立存放的所述含有探針分子的液體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，所述限制性引物和非限制性引物的摩爾比為 I 5-240。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括PCR緩沖溶液、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸中的ー種或多種，其中，DNA聚合酶獨(dú)立存放，其他組分各自獨(dú)立存放或以ー種或多種組分的混合物的形式存放。
20.權(quán)利要求1-16中任意一項(xiàng)所述的方法或權(quán)利要求17-19中任意一項(xiàng)所述的試劑盒在檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種核酸的檢測方法，其特征在于，該方法包括提供待測核酸，在不對稱PCR的反應(yīng)條件下，在PCR緩沖溶液中，使待測核酸與能夠擴(kuò)增靶核酸的一對引物、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸接觸，將接觸所得產(chǎn)物與含有探針分子的液體混合，通過觀測得到的混合物的顏色或顏色變化，判斷待測核酸中是否含有靶核酸。本發(fā)明還提供一種采用上述檢測方法進(jìn)行核酸檢測的試劑盒，以及該檢測方法和試劑盒在檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的方法是一種快速簡便、敏感特異、不需要額外的設(shè)備、直接用肉眼觀測的核酸檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK102719520SQ20111007866
公開日2012年10月10日 申請日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月30日
發(fā)明者劉艷華, 徐一, 梁興杰, 車志軍, 鄧華, 馬曉溦 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗(yàn)檢疫局, 國家納米科學(xué)中心