專(zhuān)利名稱(chēng)：一種刺參拮抗菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋微生物和生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種刺參拮抗菌及其應(yīng)用，即一株具有拮抗刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病活性的細(xì)菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，刺參消費(fèi)需求迅速擴(kuò)大，傳統(tǒng)的捕撈業(yè)已不能滿足人們的需求，刺參人工養(yǎng)殖已成為我國(guó)北方沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種，其養(yǎng)殖面積已達(dá)百萬(wàn)畝，年產(chǎn)值超過(guò) 100億元。然而，養(yǎng)殖的過(guò)速發(fā)展和不規(guī)范操作、養(yǎng)殖技術(shù)水平的參差不齊等導(dǎo)致了病害問(wèn)題的日趨突出。自2003年冬季起，山東和遼寧沿海的養(yǎng)殖刺參先后出現(xiàn)了爛皮、腫嘴的大面積流行病、引發(fā)了 30%以上的大量死亡，造成了慘重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。隨著刺參疾病的頻繁發(fā)生，國(guó)內(nèi)外研究者開(kāi)始關(guān)注刺參養(yǎng)殖過(guò)程中導(dǎo)致皮膚潰爛、 腫嘴流行病的病原問(wèn)題。研究表明假交替單胞菌O^eudoalteromonas sp)和河豚毒素假交替單胞菌(P tetraodonis)可引起刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹等流行性病害的發(fā)生。目前，控制刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹等流行性疾病的方法一般是使用化學(xué)藥物，雖然有一定效果，但是并不能從根本上控制該病，而且生物體極易產(chǎn)生耐藥性，造成體內(nèi)、環(huán)境的藥物殘留，破壞生態(tài)平衡，威脅人體的健康和安全，并造成環(huán)境污染。近年來(lái)我國(guó)水產(chǎn)品因違禁抗生素超量，不斷遭受美國(guó)、歐盟和日本等國(guó)家的進(jìn)口限制，不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失， 而且國(guó)際形象嚴(yán)重受損。因此，采取既能保障水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展又能消除海水養(yǎng)殖產(chǎn)品抗生素污染、增加水產(chǎn)品質(zhì)量的措施已成為目前海水養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中迫切需要解決的重要科學(xué)問(wèn)題。生物防治是近年來(lái)被證明很有成就的新途徑，它主要利用為生物之間的拮抗作用，選擇對(duì)養(yǎng)殖生物不造成危害的微生物來(lái)抑制海水養(yǎng)殖生物病原菌的生長(zhǎng)。使用拮抗菌防治刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹等流行性疾病，可以減少化學(xué)農(nóng)藥的用量和在水產(chǎn)品上的殘留，對(duì)保護(hù)人類(lèi)健康和防治環(huán)境污染都十分重要。同時(shí)，可有利于我國(guó)水產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯，經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益十分顯著。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種刺參拮抗菌及其應(yīng)用，可有效防治刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹病，為刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病的預(yù)防和治療提供了產(chǎn)品和使用方法。本發(fā)明所提供的生物拮抗菌，是奧氏弧菌(Vibrio ordalii)，該菌株已于2011年 3月15日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 4668。本發(fā)明的奧氏弧菌4668的活菌用于制備菌液制劑，所制得的菌液制劑可以預(yù)防刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹病的發(fā)生。菌液制劑中奧氏弧菌4668活菌的數(shù)量為IO7 101(lCFU/ml。本發(fā)明篩選到的奧氏弧菌4668用于提取胞外產(chǎn)物，預(yù)防刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹病的發(fā)生。本發(fā)明篩選的具有拮抗刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病活性的細(xì)菌，拮抗活性強(qiáng)， 利用鹽析法制備的拮抗菌胞外產(chǎn)物的產(chǎn)量穩(wěn)定，成本低，可具有較高的拮抗活性。使用該拮抗菌或拮抗產(chǎn)物對(duì)刺參的免疫保護(hù)率達(dá)70-80%，該拮抗菌產(chǎn)物為純生物制劑，且具有安全、環(huán)保的特點(diǎn)，不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留和環(huán)境造成污染，并可從根本上遏制刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病的發(fā)生和流行。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。上述拮抗菌的篩選方法如下首先分離養(yǎng)殖刺參池水中菌，然后以刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹病原菌假交替單胞菌(I^eudoalteromonas sp)作為指示菌，篩選其拮抗菌。提取拮抗菌的胞外產(chǎn)物，用于刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病的預(yù)防。具體技術(shù)方案如下(1)養(yǎng)殖刺參池水、底泥、以及養(yǎng)殖大菱鲆池水細(xì)菌分離取養(yǎng)殖海參池水、底泥和大菱鲆池水，用無(wú)菌海水稀釋不同的倍數(shù)、劃線接種于2216E平板上，27°C培養(yǎng)48小時(shí)。 挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，直到獲得60株純培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)菌株，轉(zhuǎn)入斜面培養(yǎng)基中4°C保存。(2)拮抗菌的篩選將指示菌-刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹病原菌假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas sp)接種于含有3% NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)12 16小時(shí)，取40 μ 1 50 μ 1指示菌均勻涂布于高鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，肉浸粉 10g/L,NaCL 30g/L，瓊脂20g/L，PH為7. 4)平板上，用接種環(huán)或滅菌牙簽挑取(1)中的單菌落于涂有指示菌的平板上，每個(gè)平板涂2 3個(gè)單菌落，或者將該平板貼上滅菌后的小圓形濾紙片(5mm直徑)，并用移液槍取50 μ 1(1)中分離純化的菌液涂于濾紙片上，每個(gè)平板上放兩片或三片藥敏片(藥敏片直徑為6mm)，并做三個(gè)平行平板，減少隨機(jī)誤差。將平板放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，并測(cè)量抑菌圈的大小。根據(jù)抑菌圈的大小篩選得到一株分離自刺參養(yǎng)殖池水的強(qiáng)拮抗菌YASM12，抑菌圈直徑M 43mm。(3)牛灃杯法將篩選得到的強(qiáng)拮抗菌YASM12重新鑒定，方法如下將牛灃杯放入高鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，在牛灃杯中放入50 μ 1(1)中分離純化的菌液，將平板放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，結(jié)果檢測(cè)到抑菌圈直徑為25mm。(4)拮抗菌YASM12胞外產(chǎn)物的抗菌活性鑒定利用鹽析法制備上述( 、(3)篩選得到的拮抗菌的胞外產(chǎn)物，沉淀用PH7. 4、10mM的無(wú)菌PBS溶解，并用透析袋，4°C過(guò)夜透析后即得拮抗菌胞外產(chǎn)物，放入1. 5ml的滅菌EP管中。將制備得到的10 μ 1胞外產(chǎn)物涂在滅菌濾紙片上，并將濾紙片貼于涂布40 μ 1 50 μ 1指示菌的高鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察抑菌圈的大小。(5)拮抗菌YASM12的形態(tài)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定將拮抗菌劃線接種于 2216E平板，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)和生理生化鑒定菌落特征為菌落呈乳白色，羽毛狀， 有鞭毛，細(xì)胞革蘭氏染色陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，對(duì)弧菌抑制劑0/1 敏感，接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性，無(wú)鹽條件下不生長(zhǎng)，和3% NaCl胨水刺激其生長(zhǎng)，IBSrRNA進(jìn)行的分子生物學(xué)鑒定為奧氏弧菌(Vibrio ordalii)。菌株在高鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng) 24h后，菌落呈乳白色，羽毛狀，有鞭毛可運(yùn)動(dòng)，革蘭氏染色陰性。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，對(duì)
4弧菌抑制劑0/1 敏感，接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性，無(wú)鹽條件下不生長(zhǎng)，和3% NaCl胨水刺激其生長(zhǎng)。奧氏弧菌的培養(yǎng)條件將該菌涂布于高鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，肉浸粉10g/L，NaCL30g/L，瓊脂20g/L, PH為7. 4)平板上，28°C培養(yǎng)16-18小時(shí)即長(zhǎng)出單菌落。篩選的菌株的抗菌性檢測(cè)實(shí)施例1 從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)體形均一、健康刺參，飼養(yǎng)于10L海水的整理箱中，每組15頭， 實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)充氣，水溫14 °C，每天換水，不投餌。將刺參病原菌假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas sp)和篩選分離到的奧氏弧菌(Vibrio ordalii)分別接種于含有 3 % Na C1的LB培養(yǎng)基中，觀°C培養(yǎng)2 4 h后，離心，用無(wú)菌海水分別重懸，得菌懸液，進(jìn)行以下四組實(shí)驗(yàn)處理(1)對(duì)照組，未加病原菌和拮抗菌；(2)水體中病原菌菌液終濃度為 3. 5X108CFU/ml ； (3)水體中拮抗菌和病原菌菌液終濃度均為3. 5X 108CFU/ml，拮抗菌比病原菌先1天加入；(4)水體中拮抗菌菌液終濃度為3. 5X108CFU/ml,以上四組處理每天換水補(bǔ)充菌液，定時(shí)觀察記錄各組發(fā)病和死亡情況。處理組⑵第3天刺參開(kāi)始出現(xiàn)病癥，第4 天出現(xiàn)死亡，第6天發(fā)病率是100%，死亡率是66. 7% ；處理組(3)中的刺參第5天有1頭出現(xiàn)皮膚潰爛、圍口部腫脹，第7天，死亡2頭，死亡率為13.3%;處理組⑴和(4)則無(wú)一例死亡。 二、奧氏弧菌菌液制劑的制備將奧氏弧菌接種于添加了 3% NaCl的LB培養(yǎng)基中，條件下培養(yǎng)至0D600值達(dá)到0.6以上時(shí)終止培養(yǎng)，獲得奧氏弧菌的擴(kuò)大培養(yǎng)液；使菌液中的奧氏弧菌的濃度為 107-101QCFU/ml，即制得奧氏弧菌菌液制劑。本發(fā)明制得的奧氏弧菌菌液制劑可以添加在刺參餌料中或養(yǎng)殖水體中。三、拮抗菌奧氏弧菌胞外產(chǎn)物的信息1、拮抗菌奧氏弧菌胞外產(chǎn)物的制備拮抗菌接種于250ml、3% NaCl的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12-1 后，4°C、8000g離心10-20分鐘，棄沉淀，取上清，攪拌條件下緩慢滴加飽和硫酸銨達(dá)50%的飽和度，于4°C沉淀30min以上或過(guò)夜，使蛋白充分沉淀，10000g/min，10min4°C離心，棄上清。沉淀用5ml、 pH7. 4、IOmM的無(wú)菌PBS溶解，并裝入處理好的透析袋(截留分子量為14000Da)中，在4°C 條件下，于PH7. 4、IOmM的無(wú)菌PBS中透析過(guò)夜后，期間換兩到三次PBS溶液，即得拮抗菌胞外產(chǎn)物，分裝、放入1. 5ml的滅菌EP管中，_80°C條件下保存?zhèn)溆谩?、拮抗菌奧氏弧菌胞外產(chǎn)物的抗菌效果檢測(cè)實(shí)施例1 將健康、體形均一的刺參70頭，飼養(yǎng)于IOL海水的整理箱中，隨機(jī)分組每組15頭， 實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)充氣，水溫14°C，每天換水，不投餌。使用制備的拮抗菌胞外產(chǎn)物進(jìn)行注射拮抗效果試驗(yàn)，方法如下，試驗(yàn)分3個(gè)處理，第1組為對(duì)照組，第2組為終濃度為3. 5 X IO8CFU/ ml的刺參病原菌處理組，第3組為注射20 40 μ 1的奧氏弧菌胞外產(chǎn)物后1天后加入終濃度為3. 5X108CFU/ml的刺參病原菌處理。10天后，第1組刺參無(wú)死亡，第2組刺參死亡率為100%，第3組的死亡率為20%。
實(shí)施例2 將健康、體形均一的刺參70頭，飼養(yǎng)于IOL海水的整理箱中，隨機(jī)分組每組15頭， 實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)充氣，水溫14°C，每天換水，不投餌。使用制備的拮抗菌胞外產(chǎn)物進(jìn)行注射拮抗效果試驗(yàn)，方法如下，試驗(yàn)分3個(gè)處理，第1組為對(duì)照組，第2組為終濃度為3. 5 X IO8CFU/ ml的刺參病原菌處理組，第3組為注射20 40 μ 1的奧氏弧菌胞外產(chǎn)物后3天后加入終濃度為3. 5X108CFU/ml的刺參病原菌處理。10天后，第1組刺參無(wú)死亡，第2組的刺參死亡率為100%，第3組的死亡率為30%。實(shí)施例3 將健康、體形均一的刺參200頭，飼養(yǎng)于IOL海水的整理箱中，隨機(jī)分組，每組50 頭，實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)充氣，水溫14°C，每天換水。將制備的拮抗菌胞外產(chǎn)物混合入刺參餌料中， 進(jìn)行拮抗效果試驗(yàn)，每天胞外產(chǎn)物的飼喂量為50 μ 1，連續(xù)飼喂6天后，再飼喂正常餌料， 進(jìn)行病原菌感染試驗(yàn)。10天后，未進(jìn)行拮抗菌胞外產(chǎn)物餌料飼喂的對(duì)照組刺參死亡率為 89%，第2組飼喂拮抗菌胞外產(chǎn)物餌料的刺參死亡率為30%。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明篩選得到的刺參拮抗菌及其保外產(chǎn)物具有高效的拮抗效果，能夠有效的提高刺參的抗病力，具有良好的市場(chǎng)推廣前景。
權(quán)利要求
1.一種刺參拮抗菌，為奧氏弧菌，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 4668。
2.一種菌液制劑，其特征在于包含有權(quán)利要求1所述的奧氏弧菌的活菌。
3.如權(quán)利要求2所述的菌液制劑，其特征在于上述的奧氏弧菌活菌的數(shù)量為IO7 10lclCFU/ml。
4.如權(quán)利要求2或3所述的菌液制劑，其特征在于上述的菌液的培養(yǎng)基為高鹽營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求4所述的菌液制劑，其特征在于上述的高鹽營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基為添加有3%g/ ml NaCl的LB培養(yǎng)基。
6.一種細(xì)菌胞外產(chǎn)物，其特征在于是由權(quán)利要求1所述的奧氏弧菌發(fā)酵生產(chǎn)的。
7.權(quán)利要求6所述的胞外產(chǎn)物用作飼料添加劑或抗菌增效劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種刺參拮抗菌及其應(yīng)用，所述的刺參拮抗菌為奧氏弧菌，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4668。本發(fā)明的拮抗菌用于制備菌液制劑和提取胞外產(chǎn)物。本發(fā)明篩選的具有拮抗刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病活性的細(xì)菌，拮抗活性強(qiáng)，利用鹽析法制備的拮抗菌胞外產(chǎn)物的產(chǎn)量穩(wěn)定，成本低，可具有較高的拮抗活性。使用該拮抗菌或拮抗產(chǎn)物對(duì)刺參的免疫保護(hù)率達(dá)70-80％，使用該拮抗菌產(chǎn)物為純生物制劑，且具有安全、環(huán)保的特點(diǎn)，不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留和環(huán)境造成污染，并且該方法可從根本上遏制刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病的發(fā)生和流行。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102206595SQ201110079359
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者劉均玲, 劉洪展, 吳艷君, 孫修勤, 曲凌云, 鄭風(fēng)榮 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第一海洋研究所