專利名稱：一種棉花種子純度檢驗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于種子質(zhì)量檢驗技術(shù)領(lǐng)域，涉及雜交棉花種子純度檢驗的方法，
特別是一種利用SSR分子標(biāo)記對抗蟲雜交棉國豐棉198棉花種子進行純度檢驗的方法。
背景技術(shù)：
國豐棉198是合肥豐樂種業(yè)股份有限公司培育的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交棉花新品種，具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的抗蟲基因?qū)＠Ｔ撈贩N在雜交制種過程當(dāng)中，需要通過母本人工去雄，授以父本花粉來完成雜交過程，母本去雄不徹底或漏去雄，將會極大地影響制種純度。 傳統(tǒng)的雜交種純度檢測方法為種植鑒定，依賴于品種表型差異，通過成株外觀形狀比較鑒定，鑒定時間長、費用高、難度較大和準(zhǔn)確性差。SSR(Simple Sequence R印eat)是在PCR(Polymerase Chain Reaction)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分子標(biāo)記技術(shù)，具有高度多態(tài)性、共顯性、保守性、且僅需少量的DNA、操作簡便、重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，在動物、植物、微生物等研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用， 并已開始應(yīng)用于棉花的遺傳多樣性分析及雜交種純度的鑒定研究。朱美霞等利用15對 SSR引物對8621號、中棉19等5個棉花品種進行單株和引物組合法檢測的結(jié)果說明SSR 引物組合法在檢測品種純度上具有高效性和可靠性。秦利等用2對SSR引物對當(dāng)前新疆主栽品種進行的指紋圖譜構(gòu)建和雜交種純度鑒定的結(jié)果表明SSR標(biāo)記可將3個雜交種與它們的親本加以區(qū)分。本研究利用國豐棉198雜交種與雙親在一些SSR位點上的差異， 尋找合適的引物擴增出雜交種與雙親差異明顯的穩(wěn)定條帶，用于國豐棉198的室內(nèi)純度檢測。為國豐棉198純度鑒定提供一個準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快捷、實用的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)S棉198棉花種子進行準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快捷、實用檢測的方法。其技術(shù)方案是一種國豐棉198棉花種子純度檢驗的方法，其特征在于其具體步驟是
1)DNA提取
將種子置于營養(yǎng)缽中發(fā)芽出苗至幼苗有2-3片真葉時，取4cm左右的葉片于研缽中，加入1.5XCTAB提取緩沖液將其研碎，轉(zhuǎn)入離心管65°C水浴半小時；加入與提取緩沖液等體積的氯仿/異戊醇混合液，手搖10分鐘，IOOOOrpm離心10分鐘；取其上清，加入冰凍95%乙醇，-20°C冰柜內(nèi)放置30分鐘沉淀DNA ； IOOOOrpm離心10分鐘，棄上清，加75%乙醇，靜置4 分鐘去鹽；棄75%乙醇，離心管倒置于吸水紙上風(fēng)干；加200ul滅菌雙蒸水溶解DNA待用；
2)PCR反應(yīng)
在PCR管中分別加入DNA模板、10XPCR緩沖液(含MgCl2氯化鎂)、dNTP三磷酸脫氧核糖核苷(2. OmM)、引物Pl和P2、Taq酶及ddH20雙蒸水；先94°C預(yù)變性4'；再94°C變性30〃，55°C退火30〃，72°C延伸1'，32個循環(huán)；72°C延伸7'，95°C水浴4'變性后置冰上； 3)注膠電泳檢測
將分離膠緩慢注入兩玻璃板之間，靜置凝固半小時以上；將玻璃板裝上電泳槽，2000V, 90W 預(yù)熱半小時；插梳子，點樣；2000V，85W電泳約3小時；下膠后，將膠板放在10%冰醋酸的盒子里， 輕搖20分鐘至膠全部脫色；用清水漂洗兩次，每次5分鐘；放入染色盆染色液中，輕輕搖動染色15-20分鐘；取出膠板，用清水漂洗10秒；放入顯影液中顯影至DNA帶清晰；水洗1分鐘。4)受檢種子純度計算
用上述方法分別獲取國豐棉198雜交一代和親本種子電泳譜帶，計數(shù)受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數(shù)，并用下式計算受檢樣品的種子純度(％)=受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數(shù)/受檢種子總數(shù)X 100。其技術(shù)效果是本發(fā)明利用一對SSR引物Pl和P2對棉花雜交品種國豐棉198的父母本和雜交一代的基因組DNA進行擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，找出雜交一代與父母本差異的特征譜帶，通過受檢種子純度計算，對國豐棉198雜一代種子樣品進行檢驗，其檢驗的純度經(jīng)與田間種植鑒定的純度對照比較，二者的結(jié)果高度一致(詳見附表1)。附表1 應(yīng)用SSR分子標(biāo)記室內(nèi)檢測純度與田間種植鑒定純度對照表
權(quán)利要求
1.一種國豐棉198棉花種子純度檢驗的方法，其特征在于其具體步驟是DNA提取將種子置于營養(yǎng)缽中發(fā)芽出苗至幼苗有2-3片真葉時，取4cm左右的葉片于研缽中，加入1. 5XCTAB提取緩沖液將其研碎，轉(zhuǎn)入離心管65°C水浴半小時；加入與提取緩沖液等體積的氯仿/異戊醇混合液，手搖10分鐘，IOOOOrpm離心10分鐘；取其上清，加入冰凍95%乙醇，-20°C冰柜內(nèi)放置30分鐘沉淀DNA ； IOOOOrpm離心10分鐘，棄上清，加75%乙醇，靜置4 分鐘去鹽；棄乙醇，離心管倒置于吸水紙上風(fēng)干；加200ul滅菌雙蒸水溶解DNA待用；2)PCR反應(yīng)在PCR管中分別加入DNA模板、10XPCR含氯化鎂緩沖液、三磷酸脫氧核糖核苷、引物 Pl和P2、Taq酶及雙蒸水；先94°C預(yù)變性4'；再94°C變性30〃，55°C退火30〃，72°C延伸 1'，32個循環(huán)；72°C延伸7'，95°C水浴4'變性后置冰上；3)注膠電泳檢測將分離膠緩慢注入兩玻璃板之間，靜置凝固半小時以上；將玻璃板裝上電泳槽，2000V， 90W預(yù)熱半小時；插梳子，點樣；2000V，85W電泳約3小時；下膠后，將膠板放在10%冰醋酸的盒子里，輕搖20分鐘至膠全部脫色；用清水漂洗兩次，每次5分鐘；放入染色盆染色液中， 輕輕搖動染色15-20分鐘；取出膠板，用清水漂洗10秒；放入顯影液中顯影至DNA帶清晰； 水洗1分鐘；4)受檢種子純度計算用上述方法分別獲取國豐棉198雜交一代和親本種子電泳譜帶，計數(shù)受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數(shù)，并用下式計算受檢樣品的種子純度(％)=受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數(shù)/受檢種子總數(shù)X 100。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種國豐棉198棉花種子純度檢驗的方法，其特征在于所述1. 5XCTAB提取緩沖液由1. 5%(w/v)的十六烷基三甲溴化銨，1. 4M的氯化鈉，IOOmM的 Tris-Cl緩沖液，20mM的乙二胺四乙酸，0.2% (ν/ν)的α-巰基乙醇構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種國豐棉198棉花種子純度檢驗的方法，其特征在于所述氯仿/異戊醇混合液由氯仿和異戊醇混合而成，其混合體積比為M 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種國豐棉198棉花種子純度檢驗的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)體系中引物P1序列為5 ’ -CGGTCAGATTCCAACAGA-3 ’，引物Ρ2序列為 5’ -GCCATCTCAGAGAGGACA-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種國豐棉198棉花種子純度檢驗的方法，其特征在于所述分離膠由4%的聚丙烯酰胺、10%的過硫酸銨和N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺混合而成，其混合體積比為65:0. 4:0. 04。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種棉花種子純度檢驗的方法，特別是一種利用SSR分子標(biāo)記對抗蟲雜交棉國豐棉198棉花種子進行純度檢驗的方法。其利用一對SSR引物P1和P2對棉花雜交品種國豐棉198的父母本和雜交一代的基因組DNA進行擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，找出雜交一代與父母本差異的特征譜帶，通過受檢種子純度計算，對國豐棉198雜一代種子樣品進行檢驗，其檢驗的純度經(jīng)與田間種植鑒定的純度對照比較，二者的結(jié)果高度一致。適用于對國豐棉198及其親本真實性和種子純度的檢驗。
文檔編號C12Q1/68GK102181540SQ20111007944
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者吳曉亮, 周桂林, 彭家成, 王兆賢, 程國旺, 陳先鋒, 馬惠應(yīng) 申請人:合肥豐樂種業(yè)股份有限公司