專利名稱：一種重組大腸桿菌及應(yīng)用其以單一碳源生產(chǎn)phbv的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組大腸桿菌及其生產(chǎn)生物可降解塑料的方法，尤其涉及一種產(chǎn) PHBV (聚3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯)的重組大腸桿菌及其利用廉價的單一的簡單碳源生產(chǎn)PHBV的方法，屬于基因工程和微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoat，簡稱PHA)，是由微生物合成的功能性生物聚酯。PHA具有生物可降解性、生物相容性、氣體阻隔性、壓電性、非線性光學(xué)活性以及由官能團引起的其它特殊性能。PHA的性質(zhì)決定了它具有可作為生物可降解塑料、組織工程的支架材料等許多潛在的應(yīng)用前景，因此，國內(nèi)外都對其進行大量的基礎(chǔ)和應(yīng)用開發(fā)研究。PHBV是PHA聚合物家族中的一員，它是由3_羥基丁酸(3HB)和3_羥基戊酸(3HV) 兩種短鏈單體聚合而成的一類高分子化合物。PHBV與均聚物PHB相比，其性能更接近于石化來源的聚乙烯塑料。PHB的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了它的高結(jié)晶度(60 80%)，因而硬且脆，斷裂延伸率很低；而且PHB在加熱溫度高于熔點(180°C )10°C以上時，就會裂解，從而增加了 PHB的加工處理難度。針對這些缺點，滲入3HV單體使得共聚物PHBV的結(jié)晶度下降，相應(yīng)的硬度下降，但強度提高，韌性增強；并且PHBV的熔點隨著3HV單體濃度的增加而下降，但 PHBV分子的分解溫度卻沒有相應(yīng)下降。PHBV的優(yōu)良性能決定了它相對于PHB具有更為廣泛的用途。隨著世界范圍內(nèi)能源危機的加劇、以及環(huán)境保護意識的增強，PHBV類材料的開發(fā)以及利用已引起了科研領(lǐng)域以及工業(yè)界的廣泛興趣。從PHBV的合成途徑可以看出，細(xì)胞中丙酰輔酶A的含量直接決定PHBV中3HV單體的含量。一般來說，要在細(xì)胞中合成PHBV，除了以葡萄糖作為主要碳源外，還必須向發(fā)酵液中加入含有奇數(shù)碳的輔助碳源，作為合成丙酰輔酶A的前體，如丙酸、戊酸、正戊醇等。在利用重組大腸桿菌合成PHBV的相關(guān)報道中，絕大部分都是利用丙酸作為PHBV合成的輔助碳源。但是，丙酸作為應(yīng)用最廣泛的PHBV合成的前體物，在PHBV生產(chǎn)中也存在一定的缺點 1)與常用的簡單碳源(如葡萄糖)相比，丙酸的價格較貴，增大了 PHBV的生產(chǎn)成本；2)丙酸是一種毒性較高的化合物，會抑制細(xì)胞的生長。因此，在傳統(tǒng)的PHBV的發(fā)酵生產(chǎn)上都要嚴(yán)格控制丙酸的濃度以防止其抑制細(xì)胞生長。利用廉價的簡單碳源(如葡萄糖)合成PHBV，可以解決PHBV生產(chǎn)成本過高及傳統(tǒng)的生產(chǎn)過程控制較為復(fù)雜的問題。因此，微生物利用單一的簡單碳源合成PHBV成為近年來研究的熱點。在早期的研究中，研究者們分別在Alcaligenes eutrophus和大腸桿菌中實現(xiàn)了利用葡萄糖等簡單碳源合成PHBV。但是，這些嘗試獲得的PHBV產(chǎn)物中3HV的摩爾分?jǐn)?shù)都較低，無法滿足工業(yè)材料的需要。最近，Aldor等人在重組Mlmonella enterica SerovarTyphimurium中構(gòu)建了一條利用甘油合成PHBV的途徑，可以獲得3HV摩爾分?jǐn)?shù)達到 30%以上的PHBV共聚物。然而，該方法在生產(chǎn)過程中，需要向培養(yǎng)基中加入昂貴的CN-B12, 從而增加了 PHBV的生產(chǎn)成本。自然界中存在某些微生物能夠利用單一碳源直接合成PHBV。例如諾卡氏菌屬(Nocardia)或紅球菌屬(Iihodococcus)中的某些野生菌能夠利用葡萄糖為單一碳源合成 3HV高含量的PHBV共聚物(3HV摩爾分?jǐn)?shù)可達到75%以上)。這些野生菌用于合成3HV的丙酰CoA來源于2-甲基丙二酰CoA途徑，該途徑能夠?qū)CA循環(huán)和PHBV合成途徑聯(lián)系到一起。而上述野生的PHBV產(chǎn)生菌一般對營養(yǎng)要求較高，生長速度較慢，聚合物需要在營養(yǎng)不均衡的條件下產(chǎn)生，且回收困難，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。大腸桿菌(Escherichia coli)遺傳背景清楚，底物利用范圍廣，生長速度較快，易于大規(guī)模培養(yǎng)，且細(xì)胞容易破碎，是理想的PHBV生產(chǎn)菌種。然而，申請人在相關(guān)的檢索中發(fā)現(xiàn)，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建重組大腸桿菌，利用葡萄糖、木糖等單一碳源經(jīng)蘇氨酸合成途徑生產(chǎn)PHBV，解決傳統(tǒng)PHBV生產(chǎn)上成本過高和控制策略相對復(fù)雜問題的專利和文獻還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中利用丙酸合成PHBV成本過高及控制策略過于復(fù)雜的問題，本發(fā)明的目的是提供一種重組大腸桿菌并利用所述重組大腸桿菌以單一碳源生產(chǎn)PHBV的方法。本發(fā)明所述產(chǎn)PHBV (聚3-羥基丁酸酯-C0-3-羥基戊酸酯)的重組大腸桿菌，命名為重組大腸桿菌QW103PT，由如下方法制得，即以基因工程技術(shù)敲除大腸桿菌中的prpC 基因，得到大腸桿菌QWlOO ；再在菌株QWlOO中敲除scpC基因得到大腸桿菌QW102 ；再進一步在菌株QW102中敲除pta基因，獲得基因型為E. coli AprpC AscpC Apta的大腸桿菌QW103 ；然后將來源于大腸桿菌MG1655的已將thrA基因1034位的C堿基突變?yōu)門堿基的thrABC基因簇插入到載體pCL1920中，獲得thrABC基因表達載體pCL_thrABC，將來源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes eutropha)中的phbCAB基因簇以及來源于谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中的 ilvA 基因依次插入到載體 pBluescript SIT 中， 獲得PHBV合成酶和蘇氨酸脫氨酶雙表達載體pHB-ilvA ；最后將獲得表達載體pCL_thrABC 和pHB-i IvA分別轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌QW103中，得到產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯-C0_3-羥基戊酸酯 (PHBV)的重組大腸桿菌菌株QW103PT。上述產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯-C0-3-羥基戊酸酯(PHBV)的重組大腸桿菌的出發(fā)菌株大腸桿菌選大腸桿菌MG1655、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌JM109、大腸桿菌W3110或大腸桿菌 XLl-Blue0進一步優(yōu)選大腸桿菌DH5 a。上述產(chǎn)PHBV的重組大腸桿菌QW103PT外形呈桿狀，大小為0. 4 0. 7微米X 1 3微米，無芽胞。有普通菌毛與性菌毛，屬于革蘭氏陰性桿菌。此菌合成代謝能力強，在含無機鹽、胺鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37°C，在42 44°C條件下仍能生長，生長溫度范圍為15 46°C。本發(fā)明所述重組大腸桿菌在利用單一碳源生產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯(PHBV)中的應(yīng)用，其特征在于，所述重組大腸桿菌應(yīng)用的方法是(1)菌種選擇重組大腸桿菌QW103PT ；(2)平板培養(yǎng)將重組大腸桿菌QW103PT菌種接種于含有質(zhì)量百分比為1. 5 2. 0%的瓊脂并加有終濃度為50 150微克/毫升的氨芐霉素和25 75微克/毫升的壯觀霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，25 42°C條件下，靜置培養(yǎng)8 16小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟( 培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于20 100毫升并加有終濃度為50 150微克/毫升的氨芐霉素和25 75微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，25 42°C條件下，150 250轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)8 16小時， 制得種子液；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為5 15%的的接種量，將步驟(3)的種子液接種于 200 1000毫升并加有終濃度為50 150微克/毫升的氨芐霉素和25 75微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，25 42°C條件下，150 250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)8 16小時，制得擴大量的培養(yǎng)菌液；(5)發(fā)酵培養(yǎng)以5 15%的體積比的接種量，將步驟(4)所述培養(yǎng)菌液接種于含培發(fā)酵養(yǎng)基工作體積為2. 5 3. 5升的5升發(fā)酵罐中，其中發(fā)酵培養(yǎng)基是加有終濃度為 50 150微克/毫升氨芐霉素和25 75微克/毫升的壯觀霉素的M9培養(yǎng)基；然后向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)并使其終濃度達到0. 2 0. 6毫摩爾/ 升；在25 40°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)1 3小時使菌體0D_達到1 2，之后向菌液中加入碳源， 使菌液中的總糖含量達到5 30克/升，維持pH值在5. 5 9. 0，攪拌轉(zhuǎn)速為100-500轉(zhuǎn) /分鐘，25 42 °C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)M 72小時；(6)收集細(xì)胞發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在5，000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心10 30分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞2 3次后，再5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 30分鐘收集細(xì)胞；(7)聚3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯(PHBV)提取取步驟(6)所得的細(xì)胞置于_70°C冰箱中12 30小時，然后在凍干機中凍干；向獲得的干菌體中加入其8 10倍體積的丙酮，50 60°C處理20 60分鐘后，過濾除去丙酮，烘干；然后加入干菌體8 10 倍體積的氯仿，40 60°C浸提1 3小時后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氯仿，獲得聚3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯(PHBV)產(chǎn)物。上述的應(yīng)用中，步驟(2)、(3)、⑷、(5)中所述的菌體培養(yǎng)溫度優(yōu)選是35 40°C ； 氨芐霉素的終濃度優(yōu)選是80 120微克/毫升，壯觀霉素的終濃度優(yōu)選是45 60微克/毫升。上述的應(yīng)用中，步驟(2)、(3)、(4)中所述的菌體培養(yǎng)時間優(yōu)選為10 14小時。上述的應(yīng)用中，步驟(5)中所述異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入的終濃度優(yōu)選為0. 3 0. 5毫摩爾/升，誘導(dǎo)時間優(yōu)選為2 3小時。上述的應(yīng)用中，步驟(5)中所述碳源選葡萄糖、木糖或甘油；進一步優(yōu)選木糖。上述的應(yīng)用中，步驟(5)中所述菌液中的總糖含量優(yōu)選為10 20克/升。其中，所述的總糖質(zhì)量的計算方式為(以葡萄糖計)總糖質(zhì)量(克)=使用碳源的物質(zhì)的量(摩爾)χ該碳源所含碳原子數(shù)+6X葡萄糖的分子量(克/摩爾)。上述的應(yīng)用中，步驟(5)中所述菌體發(fā)酵時間優(yōu)選為36 60小時，所述pH值維持在7. 0 8. 0。本發(fā)明所述的大腸桿菌MG1655、JM109、W3110和DH5 α來源于ATCC (美國典型菌種保藏中心)；真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes eutropha和谷氨酸棒桿菌 Corynebacteriumglutamicum購自CICC(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)；質(zhì)粒pBluescript SIT、pKD46、pKD3、pKD4 和 pCP20 來源于 DSMZ (德國微生物保藏中心)。本發(fā)明創(chuàng)造性地利用重組大腸桿菌，使其能夠利用單一碳源生產(chǎn)PHBV，在發(fā)酵48 小時后，大腸桿菌胞內(nèi)PHBV含量達到11. 1%，其中3HV的摩爾分?jǐn)?shù)達到17. 5%。與傳統(tǒng)的 PHBV生產(chǎn)方法相比，解決了丙酸作為輔助碳源成本過高及生產(chǎn)過程中控制策略過于復(fù)雜的問題，開創(chuàng)了利用簡單碳源合成PHBV的新思路。
具體實施例方式實施例1.菌株構(gòu)建(a).prpC基因的敲除I)大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制備①挑取大腸桿菌單菌落接種于LB液體試管，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。之后按轉(zhuǎn)接量(體積比)接種過夜培養(yǎng)物于30毫升新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)，約池至 OD6tltl 為 0. 4 0. 5。②4000轉(zhuǎn)/分，4°C離心10分鐘，收集菌體。之后用10毫升冰冷的0. 1摩爾/升 CaCl2懸浮菌體。③4000轉(zhuǎn)/分，4°C離心10分鐘，收集菌體。之后用10毫升冰冷的0. 1摩爾/升 CaCl2懸浮菌體，置于冰上放置30分鐘。④4000轉(zhuǎn)/分，4°C離心10分鐘，收集菌體。加入1毫升冰冷的0. 1摩爾/升 CaCl2-甘油溶液懸浮菌體。⑤將菌液以100微升/管分裝入1. 5毫升無菌離心管中，放置于-70°C凍存?zhèn)溆?。II)質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌轉(zhuǎn)化①取100微升貯存于_70°C的大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，冰浴使之成為液態(tài)。②加入連接產(chǎn)物10微升，輕輕混勻，冰浴30分鐘。③在42°C水浴中熱激90秒，之后迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2 3分鐘。④加入LB液體培養(yǎng)基900微升，于37°C緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘。⑤取適量培養(yǎng)液涂于1. 5%瓊脂LB的氨芐霉素抗性平板，37°C正面向上培養(yǎng)1小時，之后再倒置培養(yǎng)至菌落長出。III)同源重組片斷的克隆設(shè)計引物pKD-prpCl與pKD_prpC2，以質(zhì)粒pKD3為模板，通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))體外擴增獲得帶有卡那霉素抗性的重組片斷。其中，上述pKD-prpCl、pKD_prpC2引物序列為pKD-prpCl 5 ‘ -ACCCATGTCATTAAACCGAAAAAATCTGTGGCACTTTCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 ‘pKD-prpC2 5' -GCGGTCTTCCGGTCCAACATAATTGGCGGAAGGACGGATATGGGAATTAGCCATGGTCC-3‘PCR反應(yīng)體系如下(引物濃度為20微摩爾/升)IOX緩沖液 5微升；
25mmol/L MgCl2 4 微升；IOmmol/L四種dNTP混合液 1微升；引物pKD-prpCl 與 pKD_prpC2 各 1 微升；Taq DNA 聚合酶 0. 5 微升；模板DNA 1微升，加水補至50微升；PCR反應(yīng)條件97°C預(yù)變性10分鐘，94 °C變性60秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸90 秒，30個循環(huán)后72°C延伸10分鐘，4°C保存。通過DpnI內(nèi)切酶消化后，回收純化濃縮同源
重組片斷。IV)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備①挑取已轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌DH5 α，轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)OD6tltl至0. 6 ；②冰浴15分鐘，離心菌體，然后利用10%的甘油洗滌三次；③加入10 %的甘油，濃縮50倍，分裝感受態(tài)細(xì)胞。V)電轉(zhuǎn)化，篩選重組子①吸取7 10微升的上述(I)獲得的同源重組片斷，加入100微升的上述感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。調(diào)節(jié)電穿孔儀，2. 5千伏，電擊；②加入900微升的LB培養(yǎng)基，37°C，100轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)1小時；③涂布卡那霉素抗性平板培養(yǎng)，挑取重組子，以引物prpC-testF和prpC-testR進行PCR檢測，挑取prpC缺陷型的大腸桿菌菌株。其中，上述prpC-testF、prpC-testR 引物序列為prpC-testF 5' -GCCCGTAGCCAGGTGAAATA-3‘prpC-testR 5' -CGGATGTTGTTGATTTGAGC-3‘VI)質(zhì)粒pKD46的消除將上述得到的大腸桿菌菌株在42°C培養(yǎng)16-30小時后，劃線挑取單菌落分別涂布含有100 μ g/mL的氨芐霉素和25 μ g/mL的卡那霉素的LB平板，挑取在氨芐霉素平板上不能生長而在卡那霉素平板上可以生長的菌落，即為消除質(zhì)粒PKD46的大腸桿菌菌株。VII)卡那霉素抗性的消除將上述消除pKD46的大腸桿菌菌株按照上述I)中的方法制備成感受態(tài)細(xì)胞，然后按照上述II)中的方法將質(zhì)粒PCP20轉(zhuǎn)入VI)中所述消除質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌菌株。然后，將該菌株30°C培養(yǎng)8-10小時后，轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中42°C培養(yǎng)2_4小時后劃線挑取單菌落，然后分別涂布卡那霉素平板和無抗性LB平板，獲得去除卡那霉素抗性的大腸桿菌prpC缺陷型菌株QW100。(b). scpC基因的敲除I)大腸桿菌QW100感受態(tài)細(xì)胞的制備①挑取大腸桿菌單菌落接種于LB液體試管，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。之后按轉(zhuǎn)接量(體積比)接種過夜培養(yǎng)物于30毫升新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)，約池至 OD600 為 0. 4-0.5。②4000轉(zhuǎn)/分，4°C離心10分鐘，收集菌體。之后用10毫升冰冷的0. 1摩爾/升 CaCl2懸浮菌體。③4000轉(zhuǎn)/分，4°C離心10分鐘，收集菌體。之后用10毫升冰冷的0. 1摩爾/升CaCl2懸浮菌體，置于冰上放置30分鐘。④4000轉(zhuǎn)/分，4°C離心10分鐘，收集菌體。加入1毫升冰冷的0. 1摩爾/升 CaCl2-甘油溶液懸浮菌體。⑤將菌液以100微升/管分裝入1. 5毫升無菌離心管中，放置于-70°C凍存?zhèn)溆?。II)質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌轉(zhuǎn)化①取100微升貯存于_70°C的大腸桿菌QW100感受態(tài)細(xì)胞，冰浴使之成為液態(tài)。②加入連接產(chǎn)物10微升，輕輕混勻，冰浴30分鐘。③在42°C水浴中熱激90s，之后迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2 3分鐘。④加入LB液體培養(yǎng)基900微升，于37°C緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘。⑤取適量培養(yǎng)液涂于1. 5%瓊脂LB的Amp抗性平板，37°C正面向上培養(yǎng)lh，之后再倒置培養(yǎng)至菌落長出。III)同源重組片斷的克隆設(shè)計引物pKD-scpCl與pKD-scpC2，以質(zhì)粒pKD3為模板，通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))體外擴增獲得帶有卡那霉素抗性的重組片斷。其中，pKD-scpCl、pKD-scpC2引物序列為pKD-scpCl 5 ‘ -GCCGCTGACGATGTACTTTCTGACGCCGTAGCTGTTTCCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 ‘pKD-scpC2 5 ‘ -TTAACCCAGCATCGAGCCGGTTGCAATTAAATTACGGTGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3‘PCR反應(yīng)體系如下(引物濃度為20微摩爾/升)IOX緩沖液 5微升；25mmol/L MgCl2 4 微升；IOmmol/L四種dNTP混合液 1微升；引物pKD-scpCl 與 pKD_scpC2 各 1 微升；Taq DNA 聚合酶 0. 5 微升；模板DNA 1微升，加水補至50微升；PCR反應(yīng)條件97°C預(yù)變性10分鐘，94 °C變性60秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸90 秒，30個循環(huán)后72°C延伸10分鐘，4°C保存。通過DpnI內(nèi)切酶消化后，回收純化濃縮同源
重組片斷。IV)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備①挑取已轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌QW100，轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)OD6tltl至0. 6 ；②冰浴15分鐘，離心菌體，然后利用10%的甘油洗滌三次；③加入10 %的甘油，濃縮50倍，分裝感受態(tài)細(xì)胞。V)電轉(zhuǎn)化，篩選重組子①吸取7 10微升的上述(I)獲得的同源重組片斷，加入100微升的上述感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。調(diào)節(jié)電穿孔儀，2. 5千伏，電擊；②加入900微升的LB培養(yǎng)基，370C，100轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)1小時；
③涂布25μ g/mL的卡那霉素抗性平板培養(yǎng)，挑取重組子，以引物scpC-testF和 scpC-testR進行PCR檢測，挑取scpC缺陷型的大腸桿菌菌株。其中，上述scpC-testF、scpC-testR 引物序列為scpC-testF 5' -ATGGAAACTCAGTGGACAAG-3‘scpC-testR 5' -TTAACCCAGCATCGAGCCGG-3‘

VI)質(zhì)粒pKD46的消除將上述得到的大腸桿菌菌株在42°C培養(yǎng)16-30小時后，劃線挑取單菌落分別涂布含有100 μ g/mL的氨芐霉素和25 μ g/mL的卡那霉素的LB平板，挑取在氨芐霉素平板上不能生長而在卡那霉素平板上可以生長的菌落，即為消除質(zhì)粒PKD46的大腸桿菌菌株。VII)卡那霉素抗性的消除將上述消除pKD46的大腸桿菌菌株按照上述I)中的方法制備成感受態(tài)細(xì)胞，然后按照上述II)中的方法將質(zhì)粒PCP20轉(zhuǎn)入VII)中所述消除質(zhì)粒PKD46的大腸桿菌。然后， 將該菌株30°C培養(yǎng)8 10小時后，轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中42°C培養(yǎng)2 4小時后劃線挑取單菌落，然后分別涂布卡那霉素平板和無抗性LB平板，獲得去除卡那霉素抗性的大腸桿菌prpC和scpC缺陷型菌株Qff 102ο(c). pta基因的敲除:I)大腸桿菌QW102感受態(tài)細(xì)胞的制備①挑取大腸桿菌單菌落接種于LB液體試管，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。之后按轉(zhuǎn)接量(體積比)接種過夜培養(yǎng)物于30毫升新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)，約池至 OD600 為 0. 4-0.5。②4000轉(zhuǎn)/分，4°C離心10分鐘，收集菌體。之后用10毫升冰冷的0. 1摩爾/升 CaCl2懸浮菌體。③4000轉(zhuǎn)/分，4°C離心10分鐘，收集菌體。之后用10毫升冰冷的0. 1摩爾/升 CaCl2懸浮菌體，置于冰上放置30分鐘。④4000轉(zhuǎn)/分，4°C離心10分鐘，收集菌體。加入1毫升冰冷的0. 1摩爾/升 CaCl2-甘油溶液懸浮菌體。⑤將菌液以100微升/管分裝入1. 5毫升無菌離心管中，放置于-70°C凍存?zhèn)溆?。II)質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌轉(zhuǎn)化①取100微升貯存于_70°C的大腸桿菌QW102感受態(tài)細(xì)胞，冰浴使之成為液態(tài)。②加入連接產(chǎn)物10微升，輕輕混勻，冰浴30分鐘。③在42°C水浴中熱激90秒，之后迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2 3分鐘。④加入LB液體培養(yǎng)基900微升，于37°C緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘。⑤取適量培養(yǎng)液涂于1. 5%瓊脂LB的氨芐霉素抗性平板，37°C正面向上培養(yǎng)lh， 之后再倒置培養(yǎng)至菌落長出。III)同源重組片斷的克隆設(shè)計引物pKD-ptal與pKD_pta2，以質(zhì)粒pKD4為模板，通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 體外擴增獲得帶有氯霉素抗性的重組片斷。其中，上述pKD-ptal、pKD_pta2引物序列為pKD-ptal
10
5' -GTGGCCGCTTGCCTGGCAGCCATGAACGGCGTAGAAATCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3‘pKD-pta2 5' -TTACTGCTGCTGTGCAGACTGAATCGCAGTCAGCGCGATATGGGAATTAGCCATGGTCC-3‘PCR反應(yīng)體系如下(引物濃度為20微摩爾/升)IOX緩沖液 5微升；25mmol/L MgCl2 4 微升；IOmmol/L四種dNTP混合液 1微升；引物pKD-ptal 與 pKD_pta2 各 1 微升；Taq DNA 聚合酶 0. 5 微升；模板DNA 1微升，加水補至50微升；PCR反應(yīng)條件97°C預(yù)變性10分鐘，94°C變性60秒，58°C退火30秒，72°C延伸90 秒，30個循環(huán)后72°C延伸10分鐘，4°C保存。通過DpnI內(nèi)切酶消化后，回收純化濃縮同源
重組片斷。IV)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備①挑取已轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌QW100，轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)OD6tltl至0. 6 ；②冰浴15分鐘，離心菌體，然后利用10%的甘油洗滌三次；③加入10 %的甘油，濃縮50倍，分裝感受態(tài)細(xì)胞。V)電轉(zhuǎn)化，篩選重組子①吸取7 10微升的上述(I)獲得的同源重組片斷，加入100微升的上述感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。調(diào)節(jié)電穿孔儀，2. 5千伏，電擊；②加入900微升的LB培養(yǎng)基，37°C，100轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)1小時；③涂布氯霉素抗性平板培養(yǎng)，挑取重組子，以引物pta-testF和pta-testR進行 PCR檢測，挑取pta缺陷型的大腸桿菌菌株。其中，pta-testF、pta-testR 引物序列為pta-testF 5' -GTGCCGTGGAGCTTTGACCT-3‘pta-testR 5' -TTACTGCTGCTGTGCAGACT-3‘VI)質(zhì)粒pKD46的消除將上述得到的大腸桿菌菌株在42°C培養(yǎng)16-30小時后，劃線挑取單菌落分別涂布含有100 μ g/mL的氨芐霉素和20 μ g/mL的氯霉素的LB平板，挑取在氨芐霉素平板上不能生長而在氯霉素平板上可以生長的菌落，即為消除質(zhì)粒PKD46的大腸桿菌菌株。VII)氯霉素抗性的消除將上述消除pKD46的大腸桿菌菌株按照上述I)中的方法制備成感受態(tài)細(xì)胞，然后按照上述II)中的方法將質(zhì)粒PCP20轉(zhuǎn)入VI)所述消除質(zhì)粒PKD46的大腸桿菌。然后，將該菌株30°C培養(yǎng)8-10小時后，轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中42°C培養(yǎng)2_4小時后劃線挑取單菌落，然后分別涂布氯霉素平板和無抗性LB平板，獲得去除氯霉素抗性的大腸桿菌prpC、 scpC和pta缺陷型菌株Qff 103ο(d)蘇氨酸脫氨酶及PHBV合成酶表達載體的構(gòu)建
I)將含有phbCAB基因簇的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes eutropha和含有ilvA基因的谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum分別接種于LB培養(yǎng)基中，利用通用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組；II)根據(jù)Genbank公布的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌和谷氨酸棒桿菌的基因組序列，分別設(shè)計引物 PHB1、PHB2、ilvAl 禾Π ilvA2。其中，上述PHB1、PHB2、ilvAl和ilvA2，引物序列如下PHBl 5' -ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3‘PHB2 5‘ -ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC-3‘ilvAl 5' -ATTAAGCTTTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGGAAACAGAATGCATATGAGTGAAACATACGTG-3‘ilvA2 5' -ATTCTCGAGTTAGGTCAAGTATTCGTACTCAGGG-3‘III)克隆PHBV合成酶基因和蘇氨酸脫氨酶基因分別以含有PhbCAB基因簇的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌和含有iIvA基因的谷氨酸棒桿菌為模板，PCR擴增phbCAB基因簇和ilvA基因。PCR反應(yīng)體系如下(引物濃度為20微摩爾/升)IOX緩沖液 5微升；25mmol/LMgCl2 4 微升；IOmmol/L四種dNTP混合液 1微升；上下游引物各1微升；I^aqDNA 聚合酶 0. 5 微升；模板DNAl微升，加水補至50微升；PCR反應(yīng)條件97°C預(yù)變性10分鐘，94°C變性60秒，58°C退火30秒，72°C延伸5. 5 分鐘(ptibCAB基因簇)或1. 5分鐘(ilvA基因)，30個循環(huán)后72°C延伸10分鐘，4°C保存。IV) PHBV合成酶表達載體的構(gòu)建將pBluescript SIT和上述PCR產(chǎn)物(phbCAB基因簇)通過SmaI和EcoRI雙酶切反應(yīng)，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，然后利用T4連接酶連接，16°C反應(yīng)16小時，獲得PHBV 合成酶表達載體PBHR68。V) PHBV合成酶和蘇氨酸脫氨酶雙表達載體的構(gòu)建將上述得到的pBHR68和PCR獲得的IivA基因通過HindIII和XhoI雙酶切反應(yīng)， 利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，然后利用T4連接酶連接，16°C反應(yīng)16小時，獲得PHBV合成酶和蘇氨酸脫氨酶雙表達載體pHB-ilvA。(e)蘇氨酸合成酶表達載體的構(gòu)建I)thrA基因的定點突變以大腸桿菌MG1655的基因組為模板，分別利用兩對引物thrAl/thrA2和thrA3/ thrA4進行PCR擴增，分別得到大小為1061bp和1441bp的兩條片段。將這兩條片段純化后混合，并以其為模板，以thrAl和thrA4為引物，進行PCR擴增，得到定點突變后的片段
thrAcl034To其中所述引物序列如下thrAl 5‘ -ACGCATGCATCGAGTGTTGAAGTTCGGCGGTA-3‘
thrA2 5 ‘ -GATTGCGTAATCAGCACCACGAAAATACGGGCGCGTGACATCG-3‘thrA3 5' -CGATGTCACGCGCCCGTATTTTCGTGGTGCTGATTACGCAATC-3‘thrA4 5 ‘ -CACGCTCGAGTCAGACTCCTAACTTCCATGAG-3‘II)thrA基因表達載體的構(gòu)建將pCL1920和上述定點突變的thrAG1°34T片段通過通過NsiI和SacII雙酶切反應(yīng)， 利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，然后利用T4連接酶連接，16°C反應(yīng)16小時，獲得thrA基因表達載體pCL-thrA。IIDthrABC表達載體的構(gòu)建將pCL-thrA和從大腸桿菌MG1655中利用引物thrBl和thrC2克隆得到的thrBC 基因通過SacII和B10I雙酶切反應(yīng)，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，然后利用T4連接酶連接，16°C反應(yīng)16小時，獲得thrABC基因表達載體pCL_thrABC。 (f) PHBV生產(chǎn)菌株QW103PT的構(gòu)建將上述得到的QW103按照前述(a)_I中方法制成感受態(tài)細(xì)胞后，分別將質(zhì)粒 pHB-ilvA和pCL-thrABC轉(zhuǎn)化進入菌株QW103，得到PHBV生產(chǎn)菌株重組大腸桿菌QW103PT。上述重組大腸桿菌(Escherichia coli) QW103PT外形呈桿狀，大小為0. 4 0. 7微米Xl 3微米，無芽胞。有普通菌毛與性菌毛，屬于革蘭氏陰性桿菌。此菌合成代謝能力強，在含無機鹽、胺鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37°C，在42-44°C 條件下仍能生長，生長溫度范圍為15-46°C。實施例2.重組大腸桿菌QW103PT利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)PHBV，其中加入的總糖濃度為
5克/升。(1)菌種選擇大腸桿菌(Escherichia coli)QW103PT ；(2)平板培養(yǎng)將菌種接種于含有質(zhì)量百分比為1. 5%的瓊脂并加有終濃度為50 微克/毫升的氨芐霉素和25微克/毫升的壯觀霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，25°C條件下， 靜置培養(yǎng)8小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于20毫升并加有終濃度為50微克/毫升的氨芐霉素和25微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，25°C條件下，150轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)8小時，制得種子液；(4)擴大培養(yǎng)以5%的體積比的接種量，將種子液接種于200mL并加有終濃度為 50微克/毫升的氨芐霉素和25微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，25°C條件下， 150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)8小時，制得擴大培養(yǎng)菌液；(5)發(fā)酵培養(yǎng)以5%的體積比的接種量，將步驟(4)所述擴大培養(yǎng)菌液接種于培養(yǎng)基工作體積為2. 5升的5升發(fā)酵罐中，其中發(fā)酵培養(yǎng)基是加有終濃度為50微克/毫升氨芐霉素和25微克/毫升的壯觀霉素的M9培養(yǎng)基；然后向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入IPTG (異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)并使其終濃度達到0. 2毫摩爾/升；在25°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)1小時使菌體0D_達到1. 0，之后向菌液中加入木糖(按照前述的換算公式木糖濃度應(yīng)為6克/ 升)，使菌液中的總糖含量達到5克/升(以葡萄糖計)，維持pH值在5. 5，攪拌轉(zhuǎn)速為100 轉(zhuǎn)/分鐘，25 °C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)M小時；(6)收集細(xì)胞發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在5，000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞2 3次后，5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘收集細(xì)胞；
(7)PHBV提取取步驟(6)所得的細(xì)胞置于_70°C冰箱中12小時，然后在凍干機中凍干；向獲得的干菌體中加入其8 10倍體積的丙酮，50°C處理20 60分鐘后，過濾除去丙酮，烘干；然后加入干菌體8倍體積的氯仿，40°C浸提1小時后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氯仿，獲得PHBV產(chǎn)物。(8)樣品檢測取步驟(7)所得的PHBV樣品，加入100微升的濃硫酸，沸水浴中加熱45分鐘，然后利用10%的氨水調(diào)節(jié)pH至2 3，經(jīng)微孔濾膜過濾后，GC檢測PHBV含量。(9)結(jié)果分析由步驟(7)、⑶中獲得的數(shù)據(jù)知在發(fā)酵開始后的18小時菌體達到最大濃度7. 62克/升；發(fā)酵M小時后PHBV占細(xì)胞干重的8. 16%，其中3HV摩爾分?jǐn)?shù)為 7. 55%。實施例3.重組大腸桿菌QW103PT利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)PHBV，其中加入的總糖濃度為
20克/升。(1)菌種選擇大腸桿菌(Escherichia coli)QW103PT ；(2)平板培養(yǎng)將菌種接種于含有質(zhì)量百分比為2. 0%的瓊脂并加有終濃度為150 微克/毫升的氨芐霉素和75微克/毫升的壯觀霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，42°C條件下， 靜置培養(yǎng)16小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于100 毫升并加有終濃度為150微克/毫升的氨芐霉素和75微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，42°C條件下，250轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)16小時，制得種子液；(4)擴大培養(yǎng)以15%的體積比的接種量，將種子液接種于1000毫升并加有終濃度為150微克/毫升的氨芐霉素和75微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，42°C條件下，250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)16小時，制得擴大培養(yǎng)菌液；(5)發(fā)酵培養(yǎng)以15%的體積比的接種量，將步驟(4)所述擴大培養(yǎng)菌液接種于培養(yǎng)基工作體積為3. 5升的5升發(fā)酵罐中，其中發(fā)酵培養(yǎng)基是加有終濃度為150微克/毫升氨芐霉素和75微克/毫升的壯觀霉素的M9培養(yǎng)基；然后向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入IPTG(異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)并使其終濃度達到0. 6毫摩爾/升；在40°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時使菌體0D_達到2. 0，之后向菌液中加入木糖，使菌液中的總糖含量達到20克/升(以葡萄糖計)，維持PH值在9. 0，攪拌轉(zhuǎn)速為500轉(zhuǎn)/分鐘，42 °C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)72小時；(6)收集細(xì)胞發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在5，000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞2 3次后，5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘收集細(xì)胞；(7)PHBV提取取步驟(6)所得的細(xì)胞置于_70°C冰箱中30小時，然后在凍干機中凍干；向獲得的干菌體中加入其10倍體積的丙酮，60°C處理60分鐘后，過濾除去丙酮，烘干；然后加入干菌體10倍體積的氯仿，60°C浸提3小時后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氯仿，獲得 PHBV產(chǎn)物。(8)樣品檢測取步驟(7)所得的PHBV樣品，加入100微升的濃硫酸，沸水浴中加熱45分鐘，然后利用10%的氨水調(diào)節(jié)pH至2 3，經(jīng)微孔濾膜過濾后，GC檢測PHBV含量。(9)結(jié)果分析由步驟(7)、⑶中獲得的數(shù)據(jù)知在發(fā)酵開始后的20小時菌體達到最大濃度8. 44克/升；發(fā)酵72小時后PHBV占細(xì)胞干重的9. 37%，其中3HV摩爾分?jǐn)?shù)為 10. 88%。實施例4.重組大腸桿菌QW103PT利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)PHBV，其中加入的總糖濃度為15克/升。(1)菌種選擇大腸桿菌(Escherichia coli)QW103PT ；(2)平板培養(yǎng)將菌種接種于含有質(zhì)量百分比為1. 6%的瓊脂并加有終濃度為100 微克/毫升的氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，37°C條件下， 靜置培養(yǎng)12小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于50毫升并加有終濃度為100微克/毫升的氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C條件下，200轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)12小時，制得種子液；(4)擴大培養(yǎng)以10%的體積比的接種量，將種子液接種于400毫升并加有終濃度為100微克/毫升的氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C條件下，200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)12小時，制得擴大培養(yǎng)菌液；(5)發(fā)酵培養(yǎng)以10%的體積比的接種量，將步驟(4)所述擴大培養(yǎng)菌液接種于培養(yǎng)基工作體積為3升的5升發(fā)酵罐中，其中發(fā)酵培養(yǎng)基是加有終濃度為100微克/毫升氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的M9培養(yǎng)基；然后向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入IPTG (異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)并使其終濃度達到0. 4毫摩爾/升；在40°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時使菌體0D_達到1.5，之后向菌液中加入木糖，使菌液中的總糖含量達到15克/升(以葡萄糖計)，維持PH值在7. 0，攪拌轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘，37 °C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)48小時；(6)收集細(xì)胞發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在5，000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞2 3次后，5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收集細(xì)胞；(7)PHBV提取取步驟(6)所得的細(xì)胞置于_70°C冰箱中20小時，然后在凍干機中凍干；向獲得的干菌體中加入其10倍體積的丙酮，55°C處理60分鐘后，過濾除去丙酮，烘干；然后加入干菌體10倍體積的氯仿，55°C浸提3小時后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氯仿，獲得 PHBV產(chǎn)物。(8)樣品檢測取步驟(7)所得的PHBV樣品，加入100微升的濃硫酸，沸水浴中加熱45分鐘，然后利用10%的氨水調(diào)節(jié)pH至2 3，經(jīng)微孔濾膜過濾后，GC檢測PHBV含量。(9)結(jié)果分析由步驟(7)、⑶中獲得的數(shù)據(jù)知在發(fā)酵開始后的20小時菌體達到最大濃度10. 78克/升；發(fā)酵72小時后PHBV占細(xì)胞干重的11. 1%，其中3HV摩爾分?jǐn)?shù)為 17. 5%。實施例5.重組大腸桿菌QW103PT利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)PHBV，其中加入的總糖濃度為
15克/升。1)菌種選擇大腸桿菌(Escherichia coli)QW103PT ；(2)平板培養(yǎng)將菌種接種于含有質(zhì)量百分比為1. 6%的瓊脂并加有終濃度為100 微克/毫升的氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，37°C條件下， 靜置培養(yǎng)12小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于50毫升并加有終濃度為100微克/毫升的氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C條件下，200轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)12小時，制得種子液；(4)擴大培養(yǎng)以10%的體積比的接種量，將種子液接種于400毫升并加有終濃度為100微克/毫升的氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C條件下，200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)12小時，制得擴大培養(yǎng)菌液；(5)發(fā)酵培養(yǎng)以10%的體積比的接種量，將步驟(4)所述擴大培養(yǎng)菌液接種于培養(yǎng)基工作體積為3升的5升發(fā)酵罐中，其中發(fā)酵培養(yǎng)基是加有終濃度為100微克/毫升氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的M9培養(yǎng)基；然后向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入IPTG (異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)并使其終濃度達到0. 4毫摩爾/升；在40°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時使菌體0D_達到1.5，之后向菌液中加入甘油，使菌液中的總糖含量達到15克/升(以葡萄糖計)，維持PH值在7. 0，攪拌轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘，37 °C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)48小時；(6)收集細(xì)胞發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在5，000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞2 3次后，5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收集細(xì)胞；(7)PHBV提取取步驟(6)所得的細(xì)胞置于_70°C冰箱中20小時，然后在凍干機中凍干；向獲得的干菌體中加入其10倍體積的丙酮，55°C處理60分鐘后，過濾除去丙酮，烘干；然后加入干菌體10倍體積的氯仿，55°C浸提3小時后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氯仿，獲得 PHBV產(chǎn)物。(8)樣品檢測取步驟(7)所得的PHBV樣品，加入100微升的濃硫酸，沸水浴中加熱45分鐘，然后利用10%的氨水調(diào)節(jié)pH至2 3，經(jīng)微孔濾膜過濾后，GC檢測PHBV含量。(9)結(jié)果分析由步驟(7)、⑶中獲得的數(shù)據(jù)知在發(fā)酵開始后的20小時菌體達到最大濃度7. 36克/升；發(fā)酵48小時后PHBV占細(xì)胞干重的9. 21%，其中3HV摩爾分?jǐn)?shù)為 9. 89%。實施例6.重組大腸桿菌QW103PT利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)PHBV，其中加入的總糖濃度為15克/升。(1)菌種選擇大腸桿菌(Escherichia coli)QW103PT ；(2)平板培養(yǎng)將菌種接種于含有質(zhì)量百分比為1. 6%的瓊脂并加有終濃度為100 微克/毫升的氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，37°C條件下， 靜置培養(yǎng)12小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于50毫升并加有終濃度為100微克/毫升的氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C條件下，200轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)12小時，制得種子液；(4)擴大培養(yǎng)以10%的體積比的接種量，將種子液接種于400毫升并加有終濃度為100微克/毫升的氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C條件下，200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)12小時，制得擴大培養(yǎng)菌液；(5)發(fā)酵培養(yǎng)以10%的體積比的接種量，將步驟(4)所述擴大培養(yǎng)菌液接種于培養(yǎng)基工作體積為3升的5升發(fā)酵罐中，其中發(fā)酵培養(yǎng)基是加有終濃度為100微克/毫升氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的M9培養(yǎng)基；然后向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入IPTG(異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)并使其終濃度達到0. 4毫摩爾/升；在40°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時使菌體0D_達到1. 5，之后向菌液中加入葡萄糖，使菌液中的總糖含量達到15克/升(以葡萄糖計)，維持PH值在7. 0，攪拌轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘，37 °C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)48小時；(6)收集細(xì)胞發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在5，000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞2 3次后，5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收集細(xì)胞；(7)PHBV提取取步驟(6)所得的細(xì)胞置于_70°C冰箱中20小時，然后在凍干機中凍干；向獲得的干菌體中加入其10倍體積的丙酮，55°C處理60分鐘后，過濾除去丙酮，烘干；然后加入干菌體10倍體積的氯仿，55°C浸提3小時后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氯仿，獲得 PHBV產(chǎn)物。(8)樣品檢測取步驟(7)所得的PHBV樣品，加入100微升的濃硫酸，沸水浴中加熱45分鐘，然后利用10%的氨水調(diào)節(jié)pH至2 3，經(jīng)微孔濾膜過濾后，GC檢測PHBV含量。(9)結(jié)果分析由步驟(7)、⑶中獲得的數(shù)據(jù)知在發(fā)酵開始后的20小時菌體達到最大濃度8. 74克/升；發(fā)酵48小時后PHBV占細(xì)胞干重的8. 75%，其中3HV摩爾分?jǐn)?shù)為 9. 62%。實施例7.重組大腸桿菌DH5ci (pBHR68)利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)PHBV，其中加入的總糖濃度為15克/升。(1)菌種構(gòu)建將質(zhì)粒PBHR68按照實施例1中的方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中， 得到菌株 DH5 α (pBHR68)；(2)平板培養(yǎng)將菌種接種于含有質(zhì)量百分比為1. 6%的瓊脂并加有終濃度為100 微克/毫升的氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，37°C條件下， 靜置培養(yǎng)12小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于50毫升并加有終濃度為100微克/毫升的氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C條件下，200轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)12小時，制得種子液；(4)擴大培養(yǎng)以10%的體積比的接種量，將種子液接種于400毫升并加有終濃度為100微克/毫升的氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C條件下，200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)12小時，制得擴大培養(yǎng)菌液；(5)發(fā)酵培養(yǎng)以10%的體積比的接種量，將步驟(4)所述擴大培養(yǎng)菌液接種于培養(yǎng)基工作體積為3升的5升發(fā)酵罐中，其中發(fā)酵培養(yǎng)基是加有終濃度為100微克/毫升氨芐霉素和50微克/毫升的壯觀霉素的M9培養(yǎng)基；然后向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入IPTG(異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)并使其終濃度達到0. 4毫摩爾/升；在40°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時使菌體0D_達到1.5，之后向菌液中加入木糖，使菌液中的總糖含量達到15克/升(以葡萄糖計)，維持PH值在7. 0，攪拌轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘，37 °C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)48小時；(6)收集細(xì)胞發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在5，000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞2 3次后，5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收集細(xì)胞；(7)PHBV提取取步驟(6)所得的細(xì)胞置于_70°C冰箱中20小時，然后在凍干機中凍干；向獲得的干菌體中加入其10倍體積的丙酮，55°C處理60分鐘后，過濾除去丙酮，烘干；然后加入干菌體10倍體積的氯仿，55°C浸提3小時后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氯仿，獲得 PHBV產(chǎn)物。(8)樣品檢測取步驟(7)所得的PHBV樣品，加入100微升的濃硫酸，沸水浴中加熱45分鐘，然后利用10%的氨水調(diào)節(jié)pH至2 3，經(jīng)微孔濾膜過濾后，GC檢測PHBV含量。(9)結(jié)果分析由步驟(7)、⑶中獲得的數(shù)據(jù)知在發(fā)酵開始后的20小時菌體達到最大濃度10. 78克/升；發(fā)酵48小時后PHBV占細(xì)胞干重的30. 5%，其中3HV摩爾分?jǐn)?shù)為 0. 45%。通過實施例4、5與實施例6的對比可以看出，以重組大腸桿菌QW103PT分別利用木糖、甘油和葡萄糖為碳源生產(chǎn)PHBV，以木糖為碳源得到的PHBV中3HV的摩爾分?jǐn)?shù)明顯高于以葡萄糖和甘油為碳源時的產(chǎn)量，說明以木糖作為碳源合成PHBV具有明顯的優(yōu)勢。通過實施例4與實施例7的對比可以看出，以重組大腸桿菌QW103PT利用單一碳源生產(chǎn)PHBV，與重組菌DH5 α (pBHR68)相比，其3HV的摩爾分?jǐn)?shù)由0. 45%提高到17. 5%，具有很大幅度的提高。鑒于此，重組大腸桿菌QW103PT能夠高效利用單一碳源合成PHBV，對PHBV的商業(yè)
生產(chǎn)具有顯著的意義。本發(fā)明所述應(yīng)用重組大腸桿菌以廉價農(nóng)業(yè)生物質(zhì)為原料生產(chǎn)PHBV的方法中涉及的培養(yǎng)基及其配方是菌體培養(yǎng)使用的液體LB培養(yǎng)基配方為蛋白胨10克/升，酵母粉5克/升，氯化鈉10克/升，pH 7. 0，121°C條件下滅菌 20分鐘。菌體發(fā)酵使用的M9培養(yǎng)基的配方為Na2HPO4 · 12H20 17. 1 克 / 升，KH2P043 克 / 升，NaCl 1 克 / 升，NH4Cl 5 克 / 升，酵母粉2克/升，MgS040. 12克/升，CaCl2O. 011克/升，pH 7. 0,121°C條件下滅菌20分鐘。固體平板LB培養(yǎng)基為液體LB培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量百分比濃度為1. 6%的瓊脂粉。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯(PHBV)的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌名為重組大腸桿菌QW103PT，由如下方法制得，即以基因工程技術(shù)敲除大腸桿菌中的P r ρ C基因，得到大腸桿菌QW10 0 ；再在菌株QW10 0中敲除 scpC基因得到大腸桿菌QW102 ；再進一步在菌株QW102中敲除pta基因，獲得基因型為 E. coli Δ prpC Δ scpC Δ pta的大腸桿菌QW103 ；然后將來源于大腸桿菌MG1655的已將thrA 基因1034位的C堿基突變?yōu)門堿基的thrABC基因簇插入到載體pCL1920中，獲得thrABC 基因表達載體pCL-thrABC，將來源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes eutropha)中的phbCAB 基因簇以及來源于谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中的ilvA基因依次插入到載體pBluescript SK—中，獲得PHBV合成酶和蘇氨酸脫氨酶雙表達載體ρΗΒ-ilvA ；最后將獲得表達載體pCL-thrABC和ρΗΒ-ilvA分別轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌QW103中，得到產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯(PHBV)的重組大腸桿菌菌株QW103PT。
2.如權(quán)利要求1所述產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯(PHBV)的重組大腸桿菌， 其特征在于，所述出發(fā)菌株大腸桿菌選大腸桿菌MG1655、大腸桿菌DH5 α、大腸桿菌JM109、 大腸桿菌W3110或大腸桿菌XLl-Blue。
3.如權(quán)利要求1所述產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯(PHBV)的重組大腸桿菌， 其特征在于，所述出發(fā)菌株大腸桿菌選大腸桿菌DH5 α。
4.權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌在利用單一碳源生產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯(PHBV)中的應(yīng)用，其特征在于，所述重組大腸桿菌應(yīng)用的方法是(1)菌種選擇重組大腸桿菌QW103PT；(2)平板培養(yǎng)將重組大腸桿菌QW103PT菌種接種于含有質(zhì)量百分比為1.5 2. O %的瓊脂并加有終濃度為50 150微克/毫升的氨芐霉素和25 75微克/毫升的壯觀霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，25 42°C條件下，靜置培養(yǎng)8 16小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于20 100 毫升并加有終濃度為50 150微克/毫升的氨芐霉素和25 75微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，25 42°C條件下，150 250轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)8 16小時，制得種子液；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為5 15%的的接種量，將步驟(3)的種子液接種于200 1000毫升并加有終濃度為50 150微克/毫升的氨芐霉素和25 75微克/毫升的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，25 42°C條件下，150 250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)8 16小時，制得擴大量的培養(yǎng)菌液；(5)發(fā)酵培養(yǎng)以5 15%的體積比的接種量，將步驟(4)所述培養(yǎng)菌液接種于含培發(fā)酵養(yǎng)基工作體積為2. 5 3. 5升的5升發(fā)酵罐中，其中發(fā)酵培養(yǎng)基是加有終濃度為50 150微克/毫升氨芐霉素和25 75微克/毫升的壯觀霉素的M9培養(yǎng)基；然后向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)并使其終濃度達到0. 2 0. 6毫摩爾/升； 在25 40°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)1 3小時使菌體0D_達到1 2，之后向菌液中加入碳源，使菌液中的總糖含量達到5 30克/升，維持pH值在5. 5 9. 0，攪拌轉(zhuǎn)速為100-500轉(zhuǎn)/分鐘，25 42 °C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)M 72小時；(6)收集細(xì)胞發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在5，000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心10 30分鐘， 收集沉淀細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞2 3次后，再5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 30分鐘收集細(xì)胞；(7)聚3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯(PHBV)提取取步驟(6)所得的細(xì)胞置于_70°C冰箱中12 30小時，然后在凍干機中凍干；向獲得的干菌體中加入其8 10倍體積的丙酮，50 60°C處理20 60分鐘后，過濾除去丙酮，烘干；然后加入干菌體8 10 倍體積的氯仿，40 60°C浸提1 3小時后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氯仿，獲得聚3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯(PHBV)產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟O)、(3)、(4),(5)中所述的菌體培養(yǎng)溫度是35 40°C ；氨芐霉素的終濃度是80 120微克/毫升，壯觀霉素的終濃度是45 60微克/毫升。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟O)、(3)、(4)中所述的菌體培養(yǎng)時間為10 14小時。
7.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(5)中所述異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入的終濃度為0. 3 0. 5毫摩爾/升，誘導(dǎo)時間為2 3小時。
8.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟( 中所述碳源選葡萄糖、木糖或甘油。
9.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(5)中所述菌液中的總糖含量為10 20克/升。
10.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(5)中所述菌體發(fā)酵時間為36 60 小時，所述PH值維持在7.0 8.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組大腸桿菌QW103PT及其在利用單一碳源生產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯(PHBV)中的應(yīng)用，本發(fā)明的重組大腸桿菌能夠高效利用單一碳源合成PHBV，與重組菌DH5α(pBHR68)相比，其3HV的摩爾分?jǐn)?shù)由0.45％提高到17.5％，對PHBV的商業(yè)生產(chǎn)具有顯著的意義。本發(fā)明解決了丙酸作為輔助碳源成本過高及生產(chǎn)過程中控制策略過于復(fù)雜的問題，開創(chuàng)了利用簡單碳源合成PHBV的新思路。
文檔編號C12R1/19GK102212501SQ20111007989
公開日2011年10月12日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者王倩, 祁慶生, 陳泉, 魏國清 申請人:山東大學(xué)