專利名稱：一種人源性無血清培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)實驗用品，尤其是涉及一種人源性無血清培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
自建立組織和細胞培養(yǎng)技術(shù)起，就一直用含有動物或人血清的細胞培養(yǎng)基。在七十年代，生物學(xué)家就擔(dān)心動物或人血清中的不確定物質(zhì)對培養(yǎng)細胞的影響，特別是動物或人血清中病原體所帶來的危險。隨著干細胞研究的進一步發(fā)展，現(xiàn)已經(jīng)可以將體外培養(yǎng)擴增的干細胞輸入或移植于人體進行細胞替代治療，因而非常有必要進行人源性無血清培養(yǎng)基的研制。我們在2007年就對人源性廣細胞譜無血清培養(yǎng)基進行了查新并開始進行研允。目前，國內(nèi)外均無正式生產(chǎn)人源性無血清培養(yǎng)基的廠家。國外市售的無血清培養(yǎng)基均是含有動物來源的成分(如牛血清白蛋白等)的無血清培養(yǎng)基(簡稱動物源無血清培養(yǎng)基)，種類繁多，但一種無血清培養(yǎng)基僅針對某一、二種特殊類型的細胞，而且國外所有無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品在說明書的標簽上均注明“僅供研究用”，國外還有培養(yǎng)人胚胎干細胞和人成體干細胞的培養(yǎng)基，如StemPro-SFM，StemSpan H3000和KN0K0UT血清替代物，以及培養(yǎng)人造血干(祖)細胞和淋巴細胞的無血清培養(yǎng)基，如AIM-V和X-VIV0，但其中都含有動物源成分，沒有藥物級成分。雖然國內(nèi)已有無血清無蛋白培養(yǎng)基(雙無培養(yǎng)基)，其用植物種子蛋白水解產(chǎn)物代替動物源蛋白，但僅用于動物細胞培養(yǎng)，如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、雜交瘤細胞等，不適用或不能用于人體細胞培養(yǎng)。隨著細胞治療的開展和臨床應(yīng)用，國內(nèi)外在無血清培養(yǎng)基研發(fā)上的發(fā)展趨勢是制備人源性無血清培養(yǎng)基，應(yīng)不含有動物源蛋白質(zhì)或其它物質(zhì)，可供臨床使用。動物源無血清培養(yǎng)基不宜用來培養(yǎng)用于臨床治療細胞的原因是動物源無血清培養(yǎng)基中含有從牛或其他動物血清或組織中分離純化的物質(zhì)，可能含有動物病原體，如牛血清中含有牛病毒，這就造成這些動物病毒引起疾病的危險。近年來發(fā)現(xiàn)牛海綿型腦病(BSE)，即一種可傳染的由牛病毒引起的牛神經(jīng)變性性疾病，具有很長的潛伏期或培養(yǎng)時間，這一發(fā)現(xiàn)進一步使人們增加了在生物活性產(chǎn)品生產(chǎn)過程中使用動物血清的擔(dān)心。為此，研制人源性無血清培養(yǎng)基勢在必行，目前國內(nèi)外尚無商品化的人源性無血清培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種所添加的蛋白質(zhì)和脂類，均來源于人的血漿、 血清或組織、為藥物級或高度純化的人源蛋白或人重組蛋白、不含任何動物源成份，其它成分均符合美國藥典或《國家標準化學(xué)試劑》或《中華人民共和國藥典》2010年版第二部的超純或分析純試劑，并經(jīng)細胞培養(yǎng)檢測合格，用于臨床安全合理的人源性無血清培養(yǎng)基。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種人源性無血清培養(yǎng)基的制備方法。本發(fā)明的第一個目的是這樣實現(xiàn)的—種人源性無血清培養(yǎng)基，特征是配方含有以終濃度計的治療用人血清白蛋白溶液l—10mg/ml、人重組胰島素溶液4—40 μ g/ml、人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液30—60 μ g/ml、人膽固
3醇溶液20—50 μ g/ml、人過氧化氫酶溶液20—50 μ g/ml、2-巰基乙醇溶液0. 5-5.0 μ g/ml, 抗壞血酸溶液25—100 μ g/ml、亞油酸溶液1. 5—25 μ g/ml、乙醇胺溶液10-60 μ g/ml、人玻連蛋白溶液1. 0-10 μ g/ml、L-谷胺酰胺溶液10. 0—100 μ g/ml。本發(fā)明的第二個目的是這樣實現(xiàn)的一種人源性無血清培養(yǎng)基的制備方法，特征是A.按常規(guī)方法配制濃度分別為的治療用人血清白蛋白溶液50-500mg/ml、人重組胰島素溶液500-2000 μ g/ml、人過氧化氫酶溶液1000-2500 μ g/ml、2_巰基乙醇溶液 25-250 μ g/ml、抗壞血酸溶液1250—5000 μ g/ml、乙醇胺溶液500-3000 μ g/ml、人玻連蛋白溶液 50-500 μ g/ml、L-谷胺酰胺溶液 500-5000 μ g/ml ；B、制備鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液(1)、先將 16. 22—27. 30mg 的 FeCl3 用 10—20ml 的 ImM HCl 溶解，配成儲存液，然后分裝、冷凍保存于-20°C，得到1號儲存液；(2)、稱取120—200mg的人轉(zhuǎn)鐵蛋白，溶于未加碳酸氫鈉的4. 0—10. Oml刀比科氏改良伊格氏(DMEM)中，再加入270-400 μ 1的1號儲存液，攪拌均勻，即得濃度為 1500—3000 μ g/ml的鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液；C、制備人膽固醇溶液稱取50—100mg的人膽固醇粉末，將50—100mg的人膽固醇粉末加入到50-100ml未加碳酸氫鈉的DMEM中，用2cm直徑肽探頭的超聲波振蕩器振蕩， 在4°C冰箱內(nèi)以最大振幅振蕩1小時，使之完全乳化，先后用1. 2 μ m和0. 45 μ m的濾膜過濾除菌，即得濃度為1000-2500 μ g/ml的人膽固醇溶液，保存在_30°C ；D.制備亞油酸溶液稱取0. 015-0. 03g亞油酸溶于IOOml標準乙醇中，充分振蕩溶解，即得濃度為75-1250 μ g/ml的亞油酸溶液，保存在8°C ；E、將治療用人血清白蛋白溶液、人重組胰島素溶液、人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液、人膽固醇溶液、人過氧化氫酶溶液、2-巰基乙醇溶液、抗壞血酸溶液、亞油酸溶液、乙醇胺溶液、人玻連蛋白溶液和L-谷胺酰胺溶液混合在一起，攪拌均勻，再用伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基 (Iscove's modified Dulbecco，smedia，縮寫IMDM)稀釋至IL/瓶，達到配方中的終濃度， 即得人源性無血清培養(yǎng)基。人源性無血清培養(yǎng)基在誘導(dǎo)培養(yǎng)免疫活性細胞(如CIK)和造血干(祖)細胞中的應(yīng)用。(一 )細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞(CIK)的體外培養(yǎng)通過FicolI-Hypaque密度梯度離心法從正常人、人臍帶血、患者自身外周血或骨髓分離單個核細胞(MNCs)，也用流式細胞分選系統(tǒng)或免疫磁珠法直接分離CD34細胞(CD34 陽性細胞)。將MNCs細胞懸液注入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，在細胞濃度為2-3x IO6的高細胞密度下，加入添加特異性細胞因子的人源性無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CIK細胞。根據(jù)臨床治療需要，分別收獲培養(yǎng)5天和10天的細胞，分別用苔盼蘭計數(shù)細胞，MTT法檢測細胞增殖活性，經(jīng)流式細胞術(shù)檢測CIK細胞表型⑶3+⑶56+雙陽性細胞百分率，用CFSE標記K562靶細胞4小時， 按效應(yīng)細胞(CIK)和靶細胞(K562)之比例為10 1混合培養(yǎng)4小時，洗滌細胞3次，上機前加PI染料經(jīng)流式細胞術(shù)檢測DC/CIK細胞對K562靶細胞的細胞毒作用。用本培養(yǎng)基、國外同類無血清培養(yǎng)基AIM-V及含10% FCS的IMDM培養(yǎng)基(有血清培養(yǎng)基)同時分別培養(yǎng) CIK細胞，培養(yǎng)5和10天后，對其細胞形態(tài)、細胞增殖(用MTT法檢測)、CIK細胞表型和細胞毒作用(用流式細胞術(shù)檢測)進行檢測和比較。(1)本培養(yǎng)基在CIK細胞形態(tài)上(飽滿度和折光度等方面)與AIM-V和有血清培
養(yǎng)基相似。(2)在細胞培養(yǎng)增殖速度方面，臍血單個核細胞植入濃度為IxlO6時，用本培養(yǎng)基誘導(dǎo)CIK細胞增殖5天，OD值(平均數(shù)士標準差)為0. 614士0. 036，AIM_V為0. 517 士0. 04， 有血清培養(yǎng)基為0. 289士0. 021 ；本培養(yǎng)基和AIM-V與有血清培養(yǎng)基比較，P值均< 0. 001。 用本培養(yǎng)基誘導(dǎo)CIK細胞增殖10天，OD值為0. 894士0. 072，AIMV-V為0. 701 士0. 088，有血
清培養(yǎng)基為0.621 士0.028，本培養(yǎng)基與有血清培養(yǎng)基比較，P值<0.04。本培養(yǎng)基優(yōu)于有
血清培養(yǎng)基。(3)在細胞表型方面，CD3+CD56+雙陽性細胞百分率本培養(yǎng)基誘導(dǎo)10天時為 29% ；AIM-V為34. 45% ；有血清培養(yǎng)基為30. 74% ；在CIK細胞對K562白血病細胞的殺傷率方面，誘導(dǎo)5天的CIK細胞，在效靶比為10 1情況下，CIK細胞對K562白血病細胞的殺傷率(CFSE和PI染色，流式細胞儀檢測)本培養(yǎng)基為11.35%，AIM-V為8. 83 %，有血清培養(yǎng)基為11. 77%。本培養(yǎng)基在誘導(dǎo)⑶3+⑶56+雙陽性細胞和所誘導(dǎo)的CIK細胞對K562 白血病細胞的殺傷率方面與AIM-V和有血清培養(yǎng)基相似。( 二 )造血干(祖)細胞的體外培養(yǎng)用于造血干(祖)細胞培養(yǎng)的本培養(yǎng)基的所有配方濃度均適于造血干(祖)細胞的增殖和分化，用于治療輻射暴露損傷、免疫缺陷和造血系統(tǒng)腫瘤的干細胞移植以及基因治療。本培養(yǎng)基中加入SCF和IL-6作用于早期造血干細胞(如CD34陽性細胞)的擴增和分化，加入TPO和GM-CSF則作用于造血祖細胞(如巨核祖細胞和粒單祖細胞)擴增和分化。 通過FicolI-Hypaque密度梯度離心法從人外周血、骨髓或臍帶血分離單個核細胞(MNCs)， 收獲白膜層細胞，洗滌細胞后計數(shù)。IxIO6MNCs細胞培養(yǎng)于加有上述細胞因子人源性無血清培養(yǎng)基中，每3天換液1次，第14天收獲細胞，用于干細胞治療。本發(fā)明所用的十一種原料治療用人血清白蛋白溶液、人重組胰島素溶液、人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液、人膽固醇溶液、人過氧化氫酶溶液、2-巰基乙醇溶液、抗壞血酸溶液、亞油酸溶液、乙醇胺溶液、人玻連蛋白溶液和L-谷胺酰胺溶液，其中蛋白質(zhì)和脂類來源于人的血漿、 血清或組織，即為藥物級或高度純化的人源蛋白或人重組蛋白，不含任何動物源成份，其它成分均符合美國藥典或《國家標準化學(xué)試劑》或《中華人民共和國藥典》2010年版第二部的超純或分析純試劑，并經(jīng)細胞培養(yǎng)檢測合格，用于臨床是安全合理的。用其培養(yǎng)的細胞可用于冶療人體腫瘤及其它難治性疾病。本發(fā)明培養(yǎng)和誘導(dǎo)的CIK細胞的增殖率優(yōu)于有血清培養(yǎng)基，細胞⑶3+⑶56+細胞百分率和對K562白血病細胞的殺傷率與有血清培養(yǎng)基相似。本發(fā)明有助于提高國內(nèi)細胞治療的安全性和標準化。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施例1 人源性無血清培養(yǎng)基的制備A.制備鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液(1)、先將16. 22mg的FeCl3用IOml的ImM HCl溶解，配成儲存液，然后分裝、冷凍保存于-20°C，得到1號儲存液；(2)、稱取120mg的人轉(zhuǎn)鐵蛋白，溶于未加碳酸氫鈉的4.0ml DMEM中，再加入 270 μ 1的1號儲存液，攪拌均勻，即為鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液；B.制備人膽固醇溶液稱取50mg的人膽固醇粉末，再加入50ml未加碳酸氫鈉的 DMEM中，用2cm直徑肽探頭的超聲波振蕩器振蕩，在4°C冰箱內(nèi)以最大振幅振蕩1小時，使之完全乳化，先后用1. 2 μ m和0. 45 μ m的濾膜過濾除菌，即得人膽固醇溶液，保存在-30°C;C.制備亞油酸溶液稱取0.02g亞油酸溶于IOOml標準乙醇中，充分振蕩溶解，即得亞油酸溶液，保存在8°C。D.將50mg/ml治療用人血清白蛋白溶液、500 μ g/ml人重組胰島素溶液、1500 μ g/ ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液、1000 μ g/ml人膽固醇溶液、1000 μ g/ml人過氧化氫酶溶液、25ug/ml 2-巰基乙醇溶液、1250 μ g/ml抗壞血酸溶液、75 μ g/ml亞油酸溶液、500 μ g/ml乙醇胺溶液、50 μ g/ml人玻連蛋白溶液和500 μ g/mlL-谷胺酰胺溶液混合在一起，攪拌均勻，再用 IMDM稀釋至IL/瓶，達到配方中的終濃度，即得人源性無血清培養(yǎng)基。實施例2 人源性無血清培養(yǎng)基的制備A、制備鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液(1)、先將27. 30mg的FeCl3用20ml的ImM HCl溶解，配成儲存液，然后分裝、冷凍保存于-20°C，得到1號儲存液；(2)、稱取200mg的人轉(zhuǎn)鐵蛋白，溶于未加碳酸氫鈉的10. Oml DMEM中，再加入 400 μ 1的1號儲存液，攪拌均勻，即為鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液；B、制備人膽固醇溶液稱取IOOmg的人膽固醇粉末，再加入IOOml未加碳酸氫鈉的 DMEM中，用2cm直徑肽探頭的超聲波振蕩器振蕩，在4°C冰箱內(nèi)以最大振幅振蕩1小時，使之完全乳化，先后用1. 2 μ m和0. 45 μ m的濾膜過濾除菌，即得人膽固醇溶液，保存在_30°C ；C.制備亞油酸溶液稱取0. 025g亞油酸溶于IOOml標準乙醇中，充分振蕩溶解， 即得亞油酸溶液，保存在8°C。 D.將100mg/ml治療用人血清白蛋白溶液、800 μ g/ml人重組胰島素溶液、 2000 μ g/ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液、1200 μ g/ml人膽固醇溶液、1300 μ g/ml人過氧化氫酶溶液、 30ug/ml 2-巰基乙醇溶液、2000/ml抗壞血酸溶液、100 μ g/ml亞油酸溶液、1000 μ g/ml乙醇胺溶液、100 μ g/ml人玻連蛋白溶液和1000 μ g/mlL-谷胺酰胺溶液混合在一起，攪拌均勻，再用IMDM稀釋至IL/瓶，達到配方中的終濃度，即得人源性無血清培養(yǎng)基。實施例3 人源性無血清培養(yǎng)基的制備A.制備鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液(1)、先將20mg的FeCl3用15ml的ImM HCl溶解，配成儲存液，然后分裝、冷凍保存于-20°C，得到1號儲存液；(2)、稱取200mg的人轉(zhuǎn)鐵蛋白，溶于未加碳酸氫鈉的10. Oml DMEM中，再加入 400 μ 1的1號儲存液，攪拌均勻，即為鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液；B、制備人膽固醇溶液稱取IOOmg的人膽固醇粉末，再加入IOOml未加碳酸氫鈉的 DMEM中，用2cm直徑肽探頭的超聲波振蕩器振蕩，在4°C冰箱內(nèi)以最大振幅振蕩1小時，使之完全乳化，先后用1. 2 μ m和0. 45 μ m的濾膜過濾除菌，即得人膽固醇溶液，保存在-30°C;C.制備亞油酸溶液稱取0. 025g亞油酸溶于IOOml標準乙醇中，充分振蕩溶解，即得亞油酸溶液，保存在8°C。D、將300mg/ml治療用人血清白蛋白溶液、1000 μ g/ml人重組胰島素、2800 μ g/ ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白液、1500 μ g/ml人膽固醇溶液、1600 μ g/ml人過氧化氫酶、80ug/ml2_巰基乙醇、2500/ml抗壞血酸、90μ g/ml亞油酸、1200 μ g/ml乙醇胺、150μ g/ml人玻連蛋白和 1200 μ g/ml L-谷胺酰胺混合在一起，攪拌均勻，再用IMDM稀釋至IL/瓶，達到配方中的終
濃度，即得人源性無血清培養(yǎng)基。實施例4 人源性無血清培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞(CIK)在人源性無血清培養(yǎng)基中加入以下細胞因子(終濃度)(1)人重組伽瑪干擾素(hrIFN) :30ng/ml(2)人 CD3 單克隆抗體(0KT3) :100ng/ml(3)人重組白細胞介素 2(hrIL-2) :20ng/ml(4)人重組白細胞介素 l(hrlL-l) :55ng/ml。實施例5 人源性無血清培養(yǎng)基用于培養(yǎng)造血干(祖)細胞在人源性無血清培養(yǎng)基中加入以下細胞因子(終濃度)(1)干細胞因子(SCF)100ng/ml(2)粒巨噬細胞刺激因子(GM-CSF) 80ng/ml(3)白細胞介素 6(IL_6)50ng(4)血小板生成素(TPO)20ng/mL·
權(quán)利要求
1.一種人源性無血清培養(yǎng)基，其特征在于配方含有以終濃度計的治療用人血清白蛋白溶液l-10mg/ml、人重組胰島素溶液4-40 μ g/ml、人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液30-60 μ g/ ml、人膽固醇溶液20—50μ g/ml、人過氧化氫酶溶液20—50 μ g/ml、2_巰基乙醇溶液 0. 05—0. 5mM、抗壞血酸溶液25—100 μ g/ml、亞油酸溶液1. 5—25 μ g/ml、乙醇胺溶液 10-60 μ g/ml、人玻連蛋白溶液0. 1—1. 0 μ g/ml、L-谷胺酰胺溶液10. 0—100 μ g/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源性無血清培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于A、按常規(guī)方法配制濃度分別為的治療用人血清白蛋白溶液50-500mg/ml、人重組胰島素溶液500-2000 μ g/ml、人過氧化氫酶溶液1000-2500 μ g/ml、2-巰基乙醇溶液 25-250 μ g/ml、抗壞血酸溶液1250—5000 μ g/ml、乙醇胺溶液500-3000 μ g/ml、人玻連蛋白溶液 50-500 μ g/ml、L-谷胺酰胺溶液 500-5000 μ g/ml ；B、制備鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液(1)、先將16.22—27. 30mg的FeCl3用10—20ml的ImM HCl溶解，配成儲存液，然后分裝、冷凍保存于-20°C，得到1號儲存液；(2)、稱取120-200mg的人轉(zhuǎn)鐵蛋白，溶于未加碳酸氫鈉的4.0-10. Oml刀比科氏改良伊格氏(DMEM)中，再加入270-400μ1的1號儲存液，攪拌均勻，即得濃度為 1500—3000 μ g/ml的鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液；C、制備人膽固醇溶液稱取50-100mg的人膽固醇粉末，將50-100mg的人膽固醇粉末加入到50—100ml未加碳酸氫鈉的DMEM中，用2cm直徑肽探頭的超聲波振蕩器振蕩，在4°C 冰箱內(nèi)以最大振幅振蕩1小時，使之完全乳化，先后用1. 2 μ m和0. 45 μ m的濾膜過濾除菌， 即得濃度為1000-2500 μ g/ml的人膽固醇溶液，保存在_30°C ；D、制備亞油酸溶液稱取0.015-0. 03g亞油酸溶于IOOml標準乙醇中，充分振蕩溶解， 即得濃度為75-1250 μ g/ml的亞油酸溶液，保存在8°C ；E、將治療用人血清白蛋白溶液、人重組胰島素溶液、人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液、人膽固醇溶液、 人過氧化氫酶溶液、2-巰基乙醇溶液、抗壞血酸溶液、亞油酸溶液、乙醇胺溶液、人玻連蛋白溶液和L-谷胺酰胺溶液混合在一起，攪拌均勻，再用伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基稀釋至 IL/瓶，達到配方中的終濃度，即得人源性無血清培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人源性無血清培養(yǎng)基及其制備方法，它用治療用人血清白蛋白溶液、人重組胰島素溶液、人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液、人膽固醇溶液、人過氧化氫酶溶液、2-巰基乙醇溶液、抗壞血酸溶液、亞油酸溶液、乙醇胺溶液、人玻連蛋白溶液和L-谷胺酰胺溶液11種原料，所添加的蛋白質(zhì)和脂類均來源于人的血漿、血清或組織、為藥物級或高度純化的人源蛋白或人重組蛋白、不含任何動物源成份，其它成分均符合美國藥典或國家標準，并經(jīng)細胞培養(yǎng)檢測合格，是用于臨床安全合理的人源性無血清培養(yǎng)基。它培養(yǎng)和誘導(dǎo)的CIK細胞的增殖率優(yōu)于有血清培養(yǎng)基，細胞CD3+CD56+細胞百分率和對K562白血病細胞的殺傷率與有血清培養(yǎng)基相似。本發(fā)明有助于提高細胞治療的安全性和標準化。
文檔編號C12N5/0789GK102191215SQ201110081988
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日
發(fā)明者戴育成 申請人:戴育成