專利名稱：一種植物抗病調(diào)控基因uep及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種植物抗病調(diào)控基因(UEP)及其用途。
背景技術(shù)：
1、植物基因克隆技術(shù)
植物基因克隆方法很多，隨著多種植物基因組序列的測定完成，基于數(shù)據(jù)庫序列的植物基因克隆方法得到越來越廣泛的應(yīng)用。該方法操作步驟主要包括基于保守序列的引物設(shè)計(jì)，目的植物組織RNA提取，反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，PCR產(chǎn)物與載體的連接， 連接產(chǎn)物的細(xì)菌轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒提取，酶切檢驗(yàn)，測序分析等。2、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)
用于將外源基因?qū)肽康闹参?，從而獲取攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。包括基因槍法， 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法包括將目的基因克隆入植物表達(dá)載體，表達(dá)載體對農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化，攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌對目的植物組織的感染，轉(zhuǎn)基因植株的再生以及植株中基因轉(zhuǎn)化和表達(dá)情況的檢測分析等步驟。3、植物抗病性檢測分析技術(shù)
植物病原物包括卵菌、真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等多種類型。不同類型病原物的接種方法各不相同。對于卵菌，一般先在培養(yǎng)皿中濕潤的濾紙上，18°C左右培養(yǎng)4 5d使產(chǎn)生大量抱子囊。后將收集到的抱子囊放在滅菌的蒸餾水中G00(T6000個/mL)，4°C下培養(yǎng)2 4h， 使之釋放游動孢子，以游動抱子懸浮液接種植物。對于真菌，能產(chǎn)生分生孢子的，通常以分生孢子懸浮液噴霧接種植物。不產(chǎn)生分生孢子的，則以菌絲塊等接種植物。對于細(xì)菌，常以菌體懸浮液剪葉、針刺、注射等法接種植物。對于病毒，常以提純的病毒粒子或人工體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物摩擦、注射、或通過昆蟲等傳播媒介接種植物。對于線蟲，常以一定數(shù)量的二齡幼蟲接觸植物根部莖基部或根圍土壤中接種植物。多數(shù)情況下，接種后需要保持較高的相對濕度，合適的溫度和光照條件。接種后按不同時間點(diǎn)連續(xù)觀察病害發(fā)生癥狀，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率，發(fā)病嚴(yán)重度，計(jì)算病情指數(shù)。通過與感病對照植物發(fā)病情況的對比分析，明確目標(biāo)植物的抗病性。4、植物抗病育種技術(shù)
主要可以分為傳統(tǒng)抗病育種和通過基因工程抗病育種兩大類。傳統(tǒng)抗病育種因?yàn)橛刑烊贿z傳隔離現(xiàn)象使抗病資源可用范圍受到顯著限制，只能應(yīng)用遺傳關(guān)系較近的抗病資源， 而且需要多次雜交和回交等，因此選育周期長，且需要大量人力物力。而基因工程育種方法是通過將外源的抗病調(diào)控基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法等技術(shù)導(dǎo)入植物，使其獲得原來不具有的抗病性。因此，基因工程育種方法打破了天然遺傳隔離現(xiàn)象的限制，拓寬了抗病資源可用范圍，而且具有操作相對簡單方便、培育周期短、無需大量人工物力的特點(diǎn)。另外，可以導(dǎo)入一個廣譜抗病調(diào)控基因，或者一種植物中可導(dǎo)入多個抗病調(diào)控基因，因此具有特別適宜培育廣譜、持久抗病品種等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物抗病調(diào)控基因，命名為UEP，其核苷酸序列如SEQ ID 1所示，該基因的開放閱讀框(ORF)長471bp，編碼一種泛素延伸蛋白(WDiquitin extension protein)，由156個氨基酸組成，其序列如SEQ ID:2所示。該基因編碼產(chǎn)物N端為76個氨基酸的泛素分子，C端則是80個氨基酸的40S核糖體蛋白s27a。本氏煙(Mco tiana ben thamiana ) 基因的過量表達(dá)增強(qiáng)煙草對黑脛病QPhytoph thora parasitica var. nicotianae)>Sf^i^Pl (.Pseudomonas syringae pv. ia辦aei)以及病毒病 {Tobacco rattle rir^s)等多種病害的抗性(具體見實(shí)施例2中的說明)。本發(fā)明的另一個目的是提供所述基因在通過創(chuàng)制轉(zhuǎn)UEP基因植物來獲取廣譜抗病材料中的應(yīng)用。通過以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1) 基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲取
將UEP基因ORF插入一個植物表達(dá)載體，使其受強(qiáng)啟動子的驅(qū)使表達(dá)。(2)轉(zhuǎn)化汲廠基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌的獲取
將 ^基因表達(dá)結(jié)構(gòu)通過電擊等方法轉(zhuǎn)化對植物具有強(qiáng)侵染能力的農(nóng)桿菌菌株。(3)轉(zhuǎn)基因植物的創(chuàng)制和獲取
通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將UEP基因?qū)肽康闹参?，獲取轉(zhuǎn)基因的植物。(4)轉(zhuǎn)汲廠基因植物純合系的獲取
分別以抗生素抗性和 ’/7基因表達(dá)為觀察指標(biāo)，檢測轉(zhuǎn)基因植株后代的性狀分離情況，獲取后代性狀不再分離的、并能穩(wěn)定遺傳的含單位點(diǎn)整合的轉(zhuǎn) ’/7基因的植物純合系。(5 )高抗、持久、廣譜抗病的轉(zhuǎn)UEP基因植物純合系的篩選鑒定和獲取
以轉(zhuǎn) ^基因植物純合系為材料，檢測分析對由卵菌、真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等各類病原物引起的病害的抗性，獲取廣譜抗病的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明提供的UEP基因是優(yōu)質(zhì)抗病調(diào)控基因資源，利用UEP基因獲取的抗病材料具有抗性強(qiáng)烈，抗病譜廣，并同時促進(jìn)植物生長等優(yōu)點(diǎn)。抗病育種經(jīng)常面臨獲取的材料和品種抗病性不夠強(qiáng)烈，抗病對象過于單一或狹窄，抗病性增強(qiáng)的同時伴隨植物生長發(fā)育受到抑制等問題的困擾。本發(fā)明提供的 ’/7基因是一個由N端泛素分子和C 端40S核糖體蛋白s27a組成的泛素延伸蛋白(Ubiquitin extension protein)基因。該基因通過對各類靶標(biāo)蛋白翻譯和翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，廣泛參與對各類病原物引起的多種病害的抗性的調(diào)控，而且參與對植物生長發(fā)育的調(diào)控，煙草基因的過量表達(dá)顯著增強(qiáng)煙草 XiH ^ iPhytophthora parasitica var. nico tianae ) > Sf^i^Pl (.Pseudomonas syringae pv. tabaci) VXBiM毒病(Jobacco rattle rii^s)等多種病害的抗性。而且過量表達(dá)
基因的轉(zhuǎn)基因植株生長和發(fā)育比對照更好。因此， P基因適用于創(chuàng)制抗性水平高，抗病對象廣，并能促進(jìn)植物生長的抗病植物材料和品種的創(chuàng)制和選育。(2)獲取抗病材料周期短。 獲取抗病植物材料和品種的方法主要有常規(guī)的傳統(tǒng)育種方法和利用抗病調(diào)控基因的基因工程育種方法。傳統(tǒng)育種方法具有可用抗病資源范圍受天然遺傳隔離限制，選育周期長，需要大量人工物力等缺點(diǎn)。而基因工程育種方法則具有可用抗病資源范圍廣、操作相對簡單方便、培育周期短、無需大量人工物力、特別適宜培育廣譜、持久抗病品種等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明利用抗病調(diào)控基因UEP,采用基因工程方法，創(chuàng)制培育廣譜、持久抗病植物材料，具有周期短， 選育快速等特點(diǎn)。


圖1為轉(zhuǎn)基因煙草植株接種黑脛病菌(J%ytoph thora parasi tica var. nicotianae)菌絲塊接種后2天的癥狀圖。圖2為轉(zhuǎn)基因煙草植株接種野火病菌G^ei/i/offloaas SjTifl^ae pv. tabaci) 菌體懸浮液(0D·為0. 1)后2天的癥狀圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1
本發(fā)明建立了一套利用發(fā)明人克隆的一個優(yōu)質(zhì)抗病調(diào)控基因采用基因工程技術(shù)創(chuàng)制和獲取抗性水平高，抗病對象廣，并同時促進(jìn)植物生長發(fā)育的抗病植物材料的技術(shù)體系。主要步驟包括
1)本氏煙OVicoiiaft3知基因的克隆和保存
本發(fā)明提供的本氏煙OVicoiiaaa知基因通過以下步驟克隆獲得。先根據(jù)核酸數(shù)據(jù)庫中煙草和番茄泛素延伸蛋白EST序列設(shè)計(jì)了引物NWbi-F(5’- gc ggatcc atg cag ate ttc gtg aaa acc_3，，斜體部分為召a H I酶切位點(diǎn))(序列如SEQ ID :3所示)，以及 NbRlp-R (5，- gc gtcgac tea ate ggc acc ggc ctt gtt g _3，，斜體部分為 Sal I酶切位點(diǎn))(序列如SEQ ID :4所示)。采用TRIZOL試劑提取本氏煙葉片總RNA，采用 RT-PCR方法擴(kuò)增獲取UEP cDNA,通過1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠純化回收PCR產(chǎn)物，隨后與 PGEM-T載體連接，熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在LB培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，采用 BamW I / Sal I酶切和利用NWbi-F/NbRlp-R的PCR檢驗(yàn)所提取的質(zhì)粒是否包含基因，最后送公司測序驗(yàn)證，從而成功克隆和獲取本氏煙UEP基因cDNA全長序列。轉(zhuǎn)化了攜帶有本氏煙 ^基因序列的載體的大腸桿菌，保存于一 80°C冰箱。因此， 可隨時通過活化菌株，提取質(zhì)粒，通過PCR擴(kuò)增和酶切，將本氏煙UEP基因亞克隆至目的載體中，用于轉(zhuǎn)基因等研究。2) 基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲取
對攜帶有本氏煙 /7基因序列的載體進(jìn)行I / Sal I雙酶切，通過電泳和割膠回收汲廠基因ORF序列，亞克隆入植物表達(dá)載體中的強(qiáng)啟動子——花椰菜花葉病毒(CaMO35S 啟動子之后，獲取能強(qiáng)烈表達(dá) ’/7基因的植物表達(dá)結(jié)構(gòu)。3)轉(zhuǎn)化 )0基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌的獲取
將基因表達(dá)結(jié)構(gòu)通過電擊等方法轉(zhuǎn)化對植物具有強(qiáng)侵染能力的農(nóng)桿菌菌株，獲取攜帶 ^基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌。4)轉(zhuǎn) /7基因植物的創(chuàng)制和獲取
通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將汲廠基因?qū)肽康闹参铩Ｏ纫詳y帶基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌感染目的植物組織外植體。再通過抗性芽的篩選，生根，抗性植株的獲取和鑒定等步驟，獲取再生的轉(zhuǎn)汲廠基因植物Ttl代。5)轉(zhuǎn) )0基因植物純合系的篩選鑒定和獲取
分別以抗生素抗性和 ’/7基因表達(dá)為觀察指標(biāo)，檢測轉(zhuǎn)基因植株后代的性狀分離情況，獲取后代性狀不再分離的、并能穩(wěn)定遺傳的單位點(diǎn)整合的轉(zhuǎn) ’/7基因植物純合系。6)廣譜抗病的轉(zhuǎn)基因植物純合系的篩選鑒定和獲取
以轉(zhuǎn) ^基因植物純合系為材料，檢測分析對由真菌、細(xì)菌和病毒等各類病原物引起的病害的抗性，獲取廣譜抗病的轉(zhuǎn)基因植物。實(shí)施例2高水平、持久、廣譜抗病的轉(zhuǎn) )0基因煙草植株的獲取主要操作步驟包括
1) 基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲取
對發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室擁有的攜帶本氏煙基因序列的載體進(jìn)行I / Sal I雙酶切，通過電泳和割膠回收基因ORF序列，亞克隆入植物表達(dá)載體pCHF3中的強(qiáng)啟動子——花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子之后，獲取能強(qiáng)烈表達(dá)基因的植物表達(dá)結(jié)構(gòu) pCHF3\UEP。2)轉(zhuǎn)化 )0基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌的獲取
吸取廣2 μ 1 基因表達(dá)結(jié)構(gòu)pCHF3: :"￡Ρ,加入40 μ 1 ΕΗΑ105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，迅速混勻，以Bio-fcid Gene Pulser II電激儀在電壓12. 5kV/cm、電容25 μ F和電阻 400 Ω條件下電激約9ms，迅速加入Iml YEP培養(yǎng)基，下180rpm搖動恢復(fù)培養(yǎng)lh。吸取 100 μ 1菌液均勻涂布含100mg/L鏈霉素和100mg/L壯觀霉素的YEP培養(yǎng)基，獲取可能轉(zhuǎn)化子，以PCR進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)載體和目的基因UEP的存在。獲取攜帶UEP基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的 EHA105農(nóng)桿菌。3)轉(zhuǎn) /7基因煙草植株的創(chuàng)制和獲取
攜帶基因表達(dá)結(jié)構(gòu)pCHF3 UEP的EHA105農(nóng)桿菌對煙草組織外植體的感染——煙草種子經(jīng)表面消毒后，播于不含激素的1/2MS培養(yǎng)基上，發(fā)芽生長后的無菌苗的葉片切成 0. 5^1 cm大小，作為無菌外植體。先置于含1.0mg/L 6-BA的分化培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2_3d，再轉(zhuǎn)入終濃度為OD6J). 2^0. 5的農(nóng)桿菌菌液中，浸泡纊15min，吸干后將外植體重新轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2d，洗凈后置于含100mg/L卡那霉素和500mg/L頭孢霉素的轉(zhuǎn)基因選擇培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)以少基因煙草植株的再生——待轉(zhuǎn)基因選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)的外植體上長出的不定芽長2 3cm時，將不定芽轉(zhuǎn)入含100mg/L卡那霉素和250mg/L頭孢霉素的生根培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)至長出主根后，將無菌苗開蓋煉苗，最后移入土壤正常培育，獲取種子。同時對抗性植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測目的基因UEP的存在，以及Southern和Northern分析轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)和表達(dá)。獲取再生的轉(zhuǎn)汲廠基因煙草Ttl代。4)轉(zhuǎn) )0基因煙草純合系的篩選鑒定和獲取
將Ttl代轉(zhuǎn)基因煙草植株上收獲的種子進(jìn)行表面消毒，播種于加有200mg/L卡那霉素的 1/2MS培養(yǎng)基上，篩選出抗性苗，同時對抗性苗采用PCR檢測基因的存在和表達(dá)。收獲種子后，播種于同樣抗性培養(yǎng)基上，選擇抗性與非抗性呈接近3 :1比例分離的后代，對該代苗進(jìn)行同樣篩選和分析。選擇獲取后代沒有產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因分離現(xiàn)象、并能穩(wěn)定遺傳的單位點(diǎn)整合的轉(zhuǎn) ’/7基因煙草純合系。5)高水平、持久、廣譜抗病的轉(zhuǎn)基因煙草純合系的篩選鑒定和獲取
以轉(zhuǎn)基因煙草純合系為材料，分別接種各類病原物，檢測分析轉(zhuǎn)基因煙草對這些病害的抗性。檢測分析的病原物包括卵菌類一煙草黑脛病菌(/^FioMiAoraparasitica var. nicotianae) ；^lif^-煙草赤星病菌(Jyieraaria alternaia)> jfl
草白星病菌(Cercospora nico tianae )、煙草炭疽病菌trichum des true turn )、 煙草立枯病菌O^izoc■so/a/ji)、煙草猝倒病菌O0FiAi腫spp.)、煙草菌核病菌
{ScIerotinia sclerotiorum)；細(xì)菌類-煙草青才古病菌(TfeyiSioflia soIanacearum)>jfl
草里予火病菌(/^ewoWftas syringae pv. iaAaci)；病毒類-煙草花葉病病毒(TbAacco
mosaic virus, Cucumber mosaic rir"5·)、煙草脈帶病病毒(/biaio virus 10、煙草脆裂病病毒(Tobacco rattle virus)、煙草曲葉病病毒(Tobacco leaf curl virus)；以及線蟲類——煙草根結(jié)線蟲病incognita)等。通過檢測分析對由卵菌、真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等各類病原物引起病害的抗性， 獲取抗性水平高、廣譜持久抗病的轉(zhuǎn) ’/7基因煙草。有關(guān)轉(zhuǎn) ^基因煙草純合系表現(xiàn)對煙草黑脛病和煙草野火病的強(qiáng)烈抗性的檢測結(jié)果參見圖1和圖2。圖1為 /7轉(zhuǎn)基因煙草植株接種黑脛病菌(/^FioMiAora parasitica var. nico tianae)菌絲塊接種后2天的癥狀圖。A和B為UEP轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片；C 和D為只轉(zhuǎn)空載體的對照植株的葉片；對照植株的葉片(C，D)已經(jīng)表現(xiàn)十分嚴(yán)重的病害癥狀，大半葉已經(jīng)壞死，而UEP轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片(A，B)還只表現(xiàn)微弱的壞死癥狀。表明 UEP轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)了對黑脛病的強(qiáng)烈抗性。圖2為轉(zhuǎn)基因煙草植株接種野火病菌G^ewi/offloaas SjTiz^ae pv. tabaci) 菌體懸浮液(006(1(1為0. 1)后2天的癥狀圖。A和B為UEP轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片；C和D為只轉(zhuǎn)空載體的對照植株的葉片；對照植株的葉片(C，D)已經(jīng)表現(xiàn)十分嚴(yán)重的病害癥狀，接種部位已經(jīng)嚴(yán)重壞死，而UEP轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片(A，B)沒有表現(xiàn)明顯的壞死癥狀。表明UEP轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)了對野火病的強(qiáng)烈抗性。實(shí)施例3高水平、持久、廣譜抗病的轉(zhuǎn) )0基因番茄植株的獲取主要操作步驟包括
1) 基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲取
對發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室擁有的攜帶本氏煙基因序列的載體進(jìn)行I / Sal I雙酶切，通過電泳和割膠回收基因ORF序列，亞克隆入植物表達(dá)載體pCHF3中的強(qiáng)啟動子——花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子之后，獲取能強(qiáng)烈表達(dá)基因的植物表達(dá)結(jié)構(gòu) pCHF3\UEP。2)轉(zhuǎn)化 /7基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌的獲取
吸取廣2 μ 1 基因表達(dá)結(jié)構(gòu)pCHF3: :"￡Ρ,加入40 μ 1 ΕΗΑ105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，迅速混勻，以Bio-fcid Gene Pulser II電激儀在電壓12. 5kV/cm、電容25 μ F和電阻 400 Ω條件下電激約9ms，迅速加入Iml YEP培養(yǎng)基，下180rpm搖動恢復(fù)培養(yǎng)lh。吸取 100 μ 1菌液均勻涂布含100mg/L鏈霉素和100mg/L壯觀霉素的YEP培養(yǎng)基，獲取可能轉(zhuǎn)化子，以PCR進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)載體和目的基因UEP的存在。獲取攜帶UEP基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的 EHA105農(nóng)桿菌。3)轉(zhuǎn) /7基因番茄植株的創(chuàng)制和獲取
無菌番茄苗和外植體的獲取——取番茄種子，先用水沖洗10 min并漂去干癟種子，用紗布包好，55°C水浴30 min，加吐溫沖洗以增加消毒劑的效果。在超凈工作臺上75%的酒精消毒30 s，再用10%的次氯酸鈉(NaClO)表面滅菌25 min，其間不停的搖晃，并用無菌水沖洗四次，洗凈種子表面的殘留消毒劑。無菌濾紙上吸干，將種子播于1/2MS培養(yǎng)基上，28°C 黑暗條件下培養(yǎng)3 d后，番茄種子破種皮露白。改為光下培養(yǎng)無菌苗(25°C，16/8 h、3000 Ix光照條件下培養(yǎng))，3-4 d后兩片子葉完全展開，真葉尚未長出，即為實(shí)驗(yàn)所需的無菌苗。 取其子葉作為外植體，供農(nóng)桿菌感染所用。攜帶基因表達(dá)結(jié)構(gòu)pCHF3 UEP的EHA105農(nóng)桿菌對番茄組織外植體的感染——將子葉外植體在預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3 d后，用農(nóng)桿菌感染5 10 min，在滅菌濾紙上吸干菌液，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(不加抗生素)上培養(yǎng)2 d，隨后把外植體轉(zhuǎn)入含50 mg/L卡那霉素的選擇分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽，每2周繼代一次直至芽高度達(dá)0.5 cm。轉(zhuǎn) ^基因番茄植株的再生——將不定芽從愈傷組織基部切下，轉(zhuǎn)移至莖伸長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2周。再移至生根培養(yǎng)基，直至梢高度達(dá)3 cm或根達(dá)3 cm;開瓶煉苗，并移栽至營養(yǎng)土中，正常管理至開花結(jié)果，獲取種子。同時對抗性植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測目的基因 UEP的存在，以及Southern和Northern分析轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)和表達(dá)。獲取再生的轉(zhuǎn)UEP基因番茄T0代。4)轉(zhuǎn) )0基因番茄純合系的篩選鑒定和獲取
將Ttl代轉(zhuǎn)基因番茄植株上收獲的種子進(jìn)行表面消毒，播種于加有200mg/L卡那霉素的 1/2MS培養(yǎng)基上，篩選出抗性苗，同時對抗性苗采用PCR檢測基因的存在和表達(dá)。收獲種子后，播種于同樣抗性培養(yǎng)基上，選擇抗性與非抗性呈接近3 :1比例分離的后代，對該代苗進(jìn)行同樣篩選和分析。選擇獲取后代沒有產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因分離現(xiàn)象、并能穩(wěn)定遺傳的單位點(diǎn)整合的轉(zhuǎn) ’/7基因番茄純合系。5)高水平、持久、廣譜抗病的轉(zhuǎn)基因番茄純合系的篩選鑒定和獲取
以轉(zhuǎn) ^基因番茄純合系為材料，分別接種各類病原物，檢測分析轉(zhuǎn)汲廠基因番茄對這些病害的抗性。檢測分析的病原物包括卵菌類——番茄晚疫病菌
iPhytophthorainfestans)-#βlif iBotrytis cinerea)> #
1^iAlternaria solani)>#55 ^ lif iFusarium oxysporium f. sp. lycopersici)># 蓮基腐病菌 iRhizoctonia solani )、番菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)；細(xì)
菌類-番55青才古病菌(/fe/sioflia soIanacearum)；病毒類-番病毒病病毒(Tbfflaici
mosaic virus, Tobacco mosaic virus, Cucumber mosaic；以及線蟲類-番根
(,Meloidogyne incognita)等。通過檢測分析對由卵菌、真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等各類病原物引起病害的抗性， 獲取抗性水平高、廣譜持久抗病的轉(zhuǎn) ’/7基因番茄。實(shí)施例4高水平、持久、廣譜抗病的轉(zhuǎn)汲^基因馬鈴薯植株的獲取主要操作步驟包括
1) 基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲取
對發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室擁有的攜帶本氏煙基因序列的載體進(jìn)行I / Sal I雙酶切，通過電泳和割膠回收基因ORF序列，亞克隆入植物表達(dá)載體pCHF3中的強(qiáng)啟動子——花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子之后，獲取能強(qiáng)烈表達(dá)基因的植物表達(dá)結(jié)構(gòu) pCHF3\UEP。2)轉(zhuǎn)化 )0基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌的獲取
吸取廣2 μ 1 基因表達(dá)結(jié)構(gòu)pCHF3: : Ρ，加入40 μ 1 ΕΗΑ105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
8中，迅速混勻，以Bio-fcid Gene Pulser II電激儀在電壓12. 5kV/cm、電容25 μ F和電阻 400 Ω條件下電激約9ms，迅速加入Iml YEP培養(yǎng)基，下180rpm搖動恢復(fù)培養(yǎng)lh。吸取 100 μ 1菌液均勻涂布含100mg/L鏈霉素和100mg/L壯觀霉素的YEP培養(yǎng)基，獲取可能轉(zhuǎn)化子，以PCR進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)載體和目的基因UEP的存在。獲取攜帶UEP基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的 EHA105農(nóng)桿菌。3)轉(zhuǎn) )0基因馬鈴薯植株的創(chuàng)制和獲取
無菌馬鈴薯苗和外植體的獲取——以含3%蔗糖的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)無菌馬鈴薯試管苗。 選取苗齡3周的試管苗，剪取不帶腋芽的約0. 5cm莖段作為轉(zhuǎn)化的受體材料。攜帶基因表達(dá)結(jié)構(gòu)pCHF3 UEP的EHA105農(nóng)桿菌對馬鈴薯組織外植體的感染——將莖段外植體培養(yǎng)于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基PH值5. 8，培養(yǎng)溫度為 18-20°C，光照為1500—20001UX，每日光照16小時。3周后在25°C黑暗下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2d。 預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含0. 2 mg/L BA、0. 5 mg/L GA3以及2 mg/L玉米素的MS培養(yǎng)基。外植體在0D_約為0. 5的農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡10 min，取出外植體，用無菌濾紙吸干表面菌液， 然后轉(zhuǎn)入黑暗、28°C條件下共培養(yǎng)2 d，然后將外植體轉(zhuǎn)入含50 mg/L卡那霉素和300mg/L 頭孢霉素的選擇分化培養(yǎng)基上，25°C連續(xù)光照下誘導(dǎo)不定芽分化。每2 3周繼代一次，直至芽高度達(dá)1 1. 5 cm。轉(zhuǎn) ^基因馬鈴薯植株的再生——將不定芽從愈傷組織基部切下，轉(zhuǎn)移至含50 mg/L卡那霉素和250mg/L頭孢霉素的生根培養(yǎng)基，直至梢高度達(dá)3 cm或根達(dá)3 cm ；開瓶煉苗，并移栽至營養(yǎng)土中，正常管理至開花結(jié)果，獲取種子和種薯。同時對抗性植株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測目的基因的存在，以及Southern和Northern分析轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)和表達(dá)。獲取再生的轉(zhuǎn)UEP基因馬鈴薯Ttl代。4)轉(zhuǎn) /7基因馬鈴薯無性系的獲取和繁育
繼續(xù)培養(yǎng)經(jīng)過PCR擴(kuò)增、以及Southern和Northern分析UEP轉(zhuǎn)基因后獲取的轉(zhuǎn)UEP 基因馬鈴薯植株，獲取種薯。該種薯可用于無性繁殖。5)高水平、持久、廣譜抗病的轉(zhuǎn)汲廠基因馬鈴薯的篩選鑒定和獲取
以轉(zhuǎn)基因馬鈴薯無性繁殖系為材料，分別接種各類病原物，檢測分析轉(zhuǎn)UEP基因馬鈴薯對這些病害的抗性。檢測分析的病原物包括卵菌類——馬鈴薯晚疫病菌
(,Phytoph thorainfes tans )；真菌類-馬鈴薯早疫病菌ternaria solani )、馬鈴
薯枯萎病菌(/^sariws spp.)、馬鈴薯灰霉病菌(徹iiTiis ci/^rea)、馬鈴薯黑痣病菌
{Rhizoctonia solani )；細(xì)菌類-M'MM (Corynebacterium sepedonicum)；病
毒類——馬鈴薯皺縮花葉病病毒G0Oiaio virus J, Potato virus 7);以及線蟲類——馬鈴薯根腐線蟲病(/"raij^eflt^As coffeae)等。通過檢測分析對由卵菌、真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等各類病原物引起病害的抗性， 獲取抗性水平高、廣譜持久抗病的轉(zhuǎn) ’/7基因馬鈴薯。
權(quán)利要求
1.一種植物抗病調(diào)控基因，命名為UEP，其核苷酸序列如SEQ ID :1所示，該基因的開放閱讀框長471bp，編碼一種泛素延伸蛋白，由156個氨基酸組成，其序列如SEQ ID :2所示，該基因編碼產(chǎn)物N端為76個氨基酸的泛素分子，C端是80個氨基酸的40S核糖體蛋白s27a。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物抗病調(diào)控基因在通過創(chuàng)制轉(zhuǎn)UEP基因植物來獲取廣譜抗病材料中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲取將UEP基因ORF插入一個植物表達(dá)載體，使其受強(qiáng)啟動子的驅(qū)使表達(dá)，(2)轉(zhuǎn)化 ^基因表達(dá)結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌的獲取將 ^基因表達(dá)結(jié)構(gòu)通過電擊方法轉(zhuǎn)化對植物具有強(qiáng)侵染能力的農(nóng)桿菌菌株，(3)轉(zhuǎn)汲廠基因植物的創(chuàng)制和獲取通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將UEP基因?qū)肽康闹参?，獲取轉(zhuǎn)基因的植物，(4)轉(zhuǎn) ^基因植物純合系的獲取分別以抗生素抗性和 ’/7基因表達(dá)為觀察指標(biāo)，檢測轉(zhuǎn)基因植株后代的性狀分離情況，獲取后代性狀不再分離的、并能穩(wěn)定遺傳的含單位點(diǎn)整合的轉(zhuǎn) ’/7基因的植物純合系，(5)高抗、持久、廣譜抗病的轉(zhuǎn)UEP基因植物純合系的篩選鑒定和獲取以轉(zhuǎn) ^基因植物純合系為材料，檢測分析對由卵菌、真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等各類病原物引起的病害的抗性，獲取廣譜抗病的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種植物抗病調(diào)控基因，該基因的開放閱讀框長471bp，編碼一種泛素延伸蛋白，由156個氨基酸組成。該基因編碼產(chǎn)物N端為76個氨基酸的泛素分子，C端是80個氨基酸的40S核糖體蛋白s27a。本發(fā)明提供的基因是優(yōu)質(zhì)抗病調(diào)控基因資源，利用該基因獲取的抗病材料具有抗性強(qiáng)烈，抗病譜廣，并同時促進(jìn)植物生長。該基因通過對各類靶標(biāo)蛋白翻譯和翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，廣泛參與對各類病原物引起的多種病害的抗性的調(diào)控，且參與對植物生長發(fā)育的調(diào)控，煙草UEP基因的過量表達(dá)顯著增強(qiáng)煙草對黑脛病、野火病以及病毒病等多種病害的抗性，適用于創(chuàng)制抗性水平高，抗病對象廣，并能促進(jìn)植物生長的抗病植物材料和品種的創(chuàng)制和選育。
文檔編號C12N15/29GK102191253SQ201110083858
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月3日
發(fā)明者宋嘵毅, 程維舜, 蔡新忠, 賴億玉, 趙媛 申請人:浙江大學(xué)