專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)牛腸道病毒的核苷酸序列和檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)牛腸道病毒的核苷酸序列和試劑盒，尤指熒光RT-PCR方法檢測(cè)牛腸道病毒的檢測(cè)核苷酸序列和試劑盒，不僅適用于對(duì)動(dòng)物組織樣本的準(zhǔn)確檢測(cè)，還可適用于動(dòng)物活體樣本(咽喉拭子、肛門(mén)拭子、糞便、血清、皰疹皮、皰疹液、眼結(jié)膜分泌物等)的檢測(cè)，可用于牛腸道病毒的國(guó)內(nèi)篩查和出入境檢疫，屬于動(dòng)物疫病檢測(cè)、檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
牛腸道病毒是小RNA病毒科、腸道病毒屬成員。小RNA病毒是一個(gè)極為繁雜的病毒科，可分為鼻病毒屬、口蹄疫病毒屬、腸道病毒屬、心病毒屬和甲肝病毒屬等5個(gè)屬，共200 多種病毒，能引起人和動(dòng)物的多種疾病，如甲肝、口蹄疫等，在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)研究中均具有重大意義。腸道病毒是脊椎動(dòng)物腸道中原有的棲居者，病原性不明顯，通常引起輕度或不顯性感染，但常因侵犯 其他器官而引起各種臨床綜合征，或者在一定條件下引發(fā)顯著癥狀，例如牛腸道病毒、豬腸道病毒、禽腸道病毒、人腸道病毒等等。2005年初北京的牛場(chǎng)中發(fā)生牛腸道病毒感染，嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)生產(chǎn)。部分牛場(chǎng)的產(chǎn)奶牛普遍(約80%)出現(xiàn)了嚴(yán)重腹瀉癥狀水樣腹瀉，有泡沫，少數(shù)(10-15%)嚴(yán)重的還有鮮血，體溫變化不明顯，食欲下降，基本沒(méi)有死亡，但產(chǎn)奶量大幅下降(約30%)。約兩周后康復(fù)，康復(fù)后大多數(shù)奶牛的產(chǎn)奶量不能恢復(fù)到病前的水平，特別是日產(chǎn)35千克以上高產(chǎn)奶牛。嚴(yán)重降低了生產(chǎn)性能，并且還有污染奶制品的可能。據(jù)跟蹤調(diào)查，該病兩年發(fā)生一次。 我們?cè)诎l(fā)病的牛場(chǎng)中已經(jīng)分離到了牛腸道病毒。隨著豬鏈球菌2型病和高致病性藍(lán)耳病的相繼爆發(fā)，條件性致病菌/病毒對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生安全方面的威脅，或者說(shuō)潛在的危險(xiǎn)也逐漸為人們所認(rèn)識(shí)。因此我們認(rèn)為隨著人們對(duì)牛腸道病毒認(rèn)識(shí)的加深和對(duì)公共衛(wèi)生安全的重視日益加強(qiáng)，牛腸道病毒很有可能在將來(lái)被列為法檢項(xiàng)目，在這種情況下我們提前針對(duì)牛腸道病毒建立快速、準(zhǔn)確、敏感的診斷方法，進(jìn)行技術(shù)儲(chǔ)備顯得格外重要，因此開(kāi)展了牛腸道病毒快速檢測(cè)技術(shù)研究。Taqman熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)病原的技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速診斷、高通量、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高、易標(biāo)準(zhǔn)化操作和試驗(yàn)的生物安全性高等突出優(yōu)點(diǎn)， 靈敏度比普通PCR靈敏度高100倍以上，最大限度的避免了交叉污染，是國(guó)際上公認(rèn)的快速準(zhǔn)確技術(shù)之一，可檢測(cè)到很微量的病毒核酸。我們已經(jīng)將其應(yīng)用到了禽流感病毒、新城疫病毒、豬鏈球菌以及口蹄疫病毒亞洲1型的檢測(cè)領(lǐng)域，取得了很好的技術(shù)效果。TaqMan技術(shù)的要點(diǎn)是在普通PCR原有一對(duì)特異性引物基礎(chǔ)上增加特異性的熒光雙標(biāo)記探針。該探針結(jié)合部位位于引物結(jié)合區(qū)域的中間。探針的5’端和3’端分別標(biāo)記不同的熒光素，如5’端標(biāo)記的熒光素，它發(fā)出的熒光能夠被檢測(cè)儀器接收，稱(chēng)為報(bào)告熒光基團(tuán) (用R表示)，3’端標(biāo)記的熒光素，在近距離內(nèi)能吸收5’端報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)，稱(chēng)為淬滅熒光基團(tuán)(用Q表示)。當(dāng)PCR反應(yīng)在退火階段時(shí)，引物和探針同時(shí)與目的基因片段結(jié)合，此時(shí)探針上R基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被Q基團(tuán)所吸收，儀器檢測(cè)不到R所發(fā)出的熒光信號(hào)；PCR反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq酶在引物的引導(dǎo)下，沿著模板鏈合成新鏈；當(dāng)鏈的延伸進(jìn)行到探針結(jié)合部位時(shí)，此時(shí)的Taq酶發(fā)揮它的5’ 一 3’外切核酸酶的功能，將探針切成單核苷酸，與此同時(shí)標(biāo)記在探針上的R基團(tuán)游離出來(lái)，R所發(fā)出的熒光再不為Q所吸收而被檢測(cè)儀所接收。PCR進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，合成了 N條新鏈的同時(shí)，就水解了 N條探針，亦釋放了相應(yīng)數(shù)量的熒光基團(tuán)。儀器所接收到熒光信號(hào)的強(qiáng)度與PCR反應(yīng)產(chǎn)物的量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)往復(fù)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)形式增長(zhǎng)，熒光信號(hào)也相應(yīng)增長(zhǎng)。如果以每一個(gè)PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)所測(cè)得的熒光值為縱坐標(biāo)，以PCR循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，即可得到一條連接每一個(gè)循環(huán)后熒光值的曲線(xiàn)一稱(chēng)為擴(kuò)增曲線(xiàn)。當(dāng)檢測(cè)標(biāo)本中含有所要檢測(cè)病原體的核酸序列時(shí)，所得到的曲線(xiàn)呈“S”型；而當(dāng)標(biāo)本中不含病原體，則PCR過(guò)程不發(fā)生，探針不被水解，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，其擴(kuò)增曲線(xiàn)為一水平線(xiàn)。PCR擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的最下限，通常設(shè)定在S型擴(kuò)增曲線(xiàn)的增長(zhǎng)拐點(diǎn)處附近，稱(chēng)為閾值線(xiàn)(Threshold)；而擴(kuò)增曲線(xiàn)與閾值線(xiàn)交叉點(diǎn)的循環(huán)數(shù)稱(chēng)為Ct值。樣本中病原體的濃度越高，Ct值就越小。以此方法測(cè)定
未知標(biāo)本中的病原體核酸，不僅能快速定性，還因?yàn)闊晒釶CR本身先進(jìn)的熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和強(qiáng)大的信息處理能力，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體核酸的定量。因此我們利用這種檢測(cè)方法，針對(duì)牛腸道病毒基因建立牛腸道病毒特異熒光 RT-PCR快速檢測(cè)技術(shù)，用于牛腸道病毒的普查和檢測(cè)。這種檢測(cè)方法的建立將為我國(guó)出入境牛腸道病毒的檢驗(yàn)檢疫奠定良好的技術(shù)基礎(chǔ)，可在各口岸和各養(yǎng)殖企業(yè)推廣應(yīng)用，以及時(shí)檢出牛腸道病毒，保障公共衛(wèi)生安全，保障我國(guó)牛及其產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易的正常進(jìn)行，推動(dòng)外貿(mào)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，與病毒分離培養(yǎng)相比，1、熒光RT-PCR更快、更便捷，病毒分離培養(yǎng)方法至少需要21天，而熒光RT-PCR僅需4小時(shí)；2、有些牛腸道病毒毒株對(duì)細(xì)胞的吸附能力較弱，導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞的感染力下降，病毒產(chǎn)量降低甚至低至很難發(fā)現(xiàn)細(xì)胞病變的現(xiàn)象，因此用病毒分離培養(yǎng)法分離牛腸道病毒可能會(huì)失敗；而熒光RT-PCR直接針對(duì)病原的基因進(jìn)行檢測(cè)；3、有些地方不具備病毒分離培養(yǎng)的條件，病毒分離培養(yǎng)還有擴(kuò)散病毒的危險(xiǎn)；4、 熒光RT-PCR更靈敏，病毒分離培養(yǎng)方法檢測(cè)極限在10_6，而熒光RT-PCR檢測(cè)極限在10_7，比病毒分離培養(yǎng)方法更靈敏。本發(fā)明在我國(guó)首次將熒光RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于牛腸道病毒檢測(cè)領(lǐng)域，提供了針對(duì)牛腸道病毒的特異性引物序列、探針序列、試劑盒和檢測(cè)方法。與國(guó)外已報(bào)道熒光RT-PCR 檢測(cè)牛腸道病毒方法相比，我們?cè)谠O(shè)計(jì)引物時(shí)新加入了牛腸道病毒國(guó)內(nèi)分離株序列作為參考，所能檢出的牛腸道病毒毒株更多，靈敏度更高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第 一個(gè)目的是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)牛腸道病毒的核苷酸序列，包括引物序列和探針序列。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供快速、準(zhǔn)確、使用方便的檢測(cè)牛腸道病毒的熒光 RT-PCR檢測(cè)試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案選擇牛腸道病毒5’ -非編碼區(qū)基因序列作為靶區(qū)域，在多重序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)。弓丨物長(zhǎng)度為20個(gè)堿基左右，GC含量為50%—60%，引物內(nèi)無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5°C。探針的長(zhǎng)度在29個(gè)堿基，Tm值比引物Tm值高5°C左右。一組檢測(cè)牛腸道病毒的核苷酸序列，如下
權(quán)利要求
1.一組檢測(cè)牛腸道病毒的核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :3，其中序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2分別為檢測(cè)牛腸道病毒的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO :3為檢測(cè)牛腸道病毒的熒光探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)牛腸道病毒的核苷酸序列，其特征在于所述探針序列 SEQ ID NO 3的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3，端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA。
3.—種檢測(cè)牛腸道病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，由以下組分組成1)裂解液；2)RT-PCR反應(yīng)液，包括PCR緩沖液、RT緩沖液、MgCL2、dNTP、正義引物、反義引物和熒光探針；3)反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV；4)Taq DNA聚合酶；5)DEPC 水；6)陰性對(duì)照牛腸道病毒陰性組織樣品，用0.01mol/L pH7. 2 PBS緩沖鹽水制成20% 懸液，70°C作用1小時(shí)；7)陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對(duì)應(yīng)的DNA序列為序列表SEQID No. 4所示的核苷酸序列；其中，正義引物為序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，其5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)牛腸道病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應(yīng)液包括IXPCR緩沖液、IXRT緩沖液、3mM MgCL2、0. 2mM dNTP、0. 2 μΜ正義引物、0.2 μ M 反義引物和0.1 μ M熒光探針。
5.一種檢測(cè)牛腸道病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，由以下組分組成1)裂解液；2)RT-PCR反應(yīng)液，包括正義引物、反義引物和熒光探針；3)RT-PCR酶顆粒；4)DEPC 水；5)陰性對(duì)照牛腸道病毒陰性組織樣品，用0.01mol/L pH7. 2 PBS緩沖鹽水制成20% 懸液，70°C作用1小時(shí)；6)陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對(duì)應(yīng)的DNA序列為序列表SEQID No. 4所示的核苷酸序列；其中，正義引物為序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，其5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)牛腸道病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應(yīng)液包括0.2 μ M正義引物、0.2 μ M反義引物和0.1 μ M熒光探針。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一組檢測(cè)牛腸道病毒的核苷酸序列，該檢測(cè)牛腸道病毒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO3，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分別為檢測(cè)牛腸道病毒的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO3為檢測(cè)牛腸道病毒的熒光探針。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了含有上述引物和探針的檢測(cè)牛腸道病毒的試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒具有快速、靈敏、特異、穩(wěn)定、重復(fù)性好及不易污染的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102154521SQ201110084539
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者喬彩霞, 劉來(lái)福, 吳丹, 吳濤, 周琦, 張偉, 張向東, 張鶴曉, 柏亞鐸, 段向英, 汪琳, 蒲靜, 谷強(qiáng), 郭錚蕾, 高志強(qiáng), 齊瑋 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局