專利名稱：一組應(yīng)用于檢測家蠶質(zhì)型多角體病毒的引物及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子診斷和鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組應(yīng)用于檢測家蠶質(zhì)型多角體病毒的引物及快速檢測家蠶質(zhì)型多角體病毒的方法。
背景技術(shù)：
家蠶質(zhì)型多角體病又稱中腸型膿病，病原為桑蠶質(zhì)型多角體病毒力# mori cytoplasmic polyhedrosis virus,簡稱BmCPV)，是呼腸孤病毒科質(zhì)多角體病毒屬的模式種。華東 蠶區(qū)在夏、秋蠶期多發(fā)生本病，華南蠶區(qū)則多發(fā)生在夏秋蠶期高溫季節(jié)，每年的第 3 6造，據(jù)我們調(diào)查中腸型膿病(又簡稱BmCPV病)占廣東第三造蠶總發(fā)病數(shù)的30 50%， 由于該病常與濃核病DNV病并發(fā)，在廣東稱之為“白口仔”病。病蠶主要由家蠶食下污染 BmCPV的桑葉而侵入中腸后發(fā)病所致。致病后的病蠶發(fā)育緩慢，體軀瘦小，呆滯，體色略帶乳白，常排出帶乳白色的軟糞，而后陸續(xù)死亡。從感染到發(fā)病約6 10日。中腸型膿病在氣溫相對(duì)較低的1、2、8造發(fā)病較少；在高溫各蠶造發(fā)病較多。在1986-1987年廣東省西江沿岸的德慶縣、粵北丘陵山地的翁源縣等地的蠶病普查工作發(fā)現(xiàn)，德慶縣王屋村第四造CPV 發(fā)病率8. 12%，有的村甚至高達(dá)11. 91% ；即以3 7造，日平均氣溫為28 31°C，有時(shí)達(dá)到 34°C時(shí)多發(fā)生。目前根據(jù)其多角體的形狀和在細(xì)胞內(nèi)形成的部位分為9個(gè)株系，其中BmCPV-I株的dsRNA基因全序列已被測定，并且報(bào)道了各基因序列的分析及蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測等，但是對(duì)其基因快速檢測BmCPV等方面的研究報(bào)道還較少(呂鴻聲，昆蟲病毒分子生物學(xué)，北京， 中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1998. 411 442)，技術(shù)上尚屬空白，亟需解決方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有家蠶質(zhì)型多角體病毒BmCPV檢測技術(shù)的不足，提供一組應(yīng)用于檢測家蠶質(zhì)型多角體病毒的引物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，基于所述引物，提供一種快速檢測家蠶質(zhì)型多角體病毒的方法。依據(jù)本發(fā)明方法可有效地檢測中腸型膿病病毒，為生產(chǎn)上早期檢測和預(yù)知檢查家蠶中腸型膿病提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明基于(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/AF433660. 1) NCBI 網(wǎng)站上報(bào)道的BmCPV dsRNA基因組第5片段的核苷酸序列資料(AF 433660，gi 1666064)，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異的引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)家蠶質(zhì)型多角體病毒的檢測。所述引物BmCPVf和BmCPVr，上游引物18bp，位于其5’端從2188bp到2205bp，下游引物18bp，位于從2400bp到2417bp之間的序列，兩引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO: 2所示，分別為
BmCPVf 5' CAGAGCCATAATGAAACG 3'； BmCPVr 5' GTTGCTCCTGTTTTGTGG 3，；擴(kuò)增的目的片段為230 bp。同時(shí)，本發(fā)明提供的家蠶質(zhì)型多角體病毒的快速檢測方法包括以下步驟
(1)抽提家蠶質(zhì)型多角體病毒基因組dsRNA;
(2)應(yīng)用所述引物對(duì)提取的家蠶質(zhì)型多角體病毒BmCPV的基因組dsRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(3)取5μ L步驟(2) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用核酸染料 Goldview進(jìn)行染色檢測。步驟(2)所述PCR反應(yīng)采用 25 μ L體系2· 5 μ L IOXPCR Buffer, 1 μ L dNTPs, 正反向引物濃度為10 μΜ，各加1 yL，l yL DNA模板，18 yLddH20，0.5 yL Γ即酶(2.5 U/μ L)0 引物擴(kuò)增的 PCR 循環(huán)為94°C 5 min ； 94°C 45 s，50°C 45 s ；72°C 1 min，30 循環(huán)；72°C 10 min，4°C保存。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明提供了一對(duì)特異的引物BmCPVf/ BmCPVr，采用所述特異性引物可以有效地?cái)U(kuò)增檢測出家蠶中腸型膿病病毒，本發(fā)明方法特異性強(qiáng)，檢測快速準(zhǔn)確，適于小量樣本操作，操作簡單，為生產(chǎn)上早期檢測和預(yù)知檢查家蠶中腸型膿病提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。


圖1家蠶質(zhì)型多角體病毒基因組dsRNA的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實(shí)施例1
(1)家蠶質(zhì)型多角體病毒的人工繁殖與純化
生物材料家蠶質(zhì)型多角體病毒液由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶桑生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)人工桑葉繼代繁殖(僅為說明本發(fā)明方法使用，也可采用其他實(shí)驗(yàn)室相關(guān)實(shí)驗(yàn)使用的所述家蠶質(zhì)型多角體病毒)；瓊脂糖(Spanish)等購自廣州百康生物技術(shù)有限公司；DL 2000分子量標(biāo)準(zhǔn)核酸為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；Loading Buffer,^ DNA Polymerase,dNTPs,DEPC 購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇由天津大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)； TaKaRa PrimeScript RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自瑞真公司；PCR儀為美國生產(chǎn)的PE Applied Biosystem 9700 ；凝膠成像系統(tǒng)為英國生產(chǎn)的UVP。接種方法取濃度為IO6個(gè)/mL的家蠶質(zhì)型多角體懸浮液于100 mL小燒杯中，桑葉切成2cmX 2cm的小塊，用鑷子夾桑葉于病毒多角體懸浮液中浸泡(正反兩面浸濕)，在小燒杯杯壁上浙掉多余的病原液，然后葉背朝上平鋪于四齡眠起的家蠶上，添毒后6小時(shí)以正常桑葉按常規(guī)方法給桑，每天注意觀察蠶的發(fā)病情況。收集方法從蠶座中挑取病蠶，用剪刀剪開其背部，收集乳白色的中腸于滅菌的三角瓶中，密封后4°C冰箱保存，待純化。純化方法將收集的乳白色中腸加滅菌水在研缽中研磨后，分裝于13 mL的離心管中，經(jīng)平衡后2500 3000 rpm離心20min，棄上清，沉淀加水至13 mL，混勻，平衡后重復(fù)離心洗滌2 3次。棄上清，可見沉淀分為三層，上層淡黃色，中間為乳白色，底部為黑色， 加2 3 mL滅菌水，先用移液槍輕輕刮掉上層淡黃色沉淀，吸出棄掉，再加2 3 mL滅菌水，輕輕刮勻中間乳白色沉淀，小心收集于滅菌的IOmL離心管中，4°C冰箱保存。(2)
(A)家蠶質(zhì)型多角體病毒基因組dsRNA的抽提
步驟(1)所述感染家蠶質(zhì)型多角體病毒BmCPV的基因組dsRNA的提取方法參照常規(guī)， 具體是在EP管中加入1 ml Trizol (總RNA抽提試劑)，再加入200 μ 家蠶質(zhì)型多角體懸浮液，槍頭吹吸混勻1 min，靜置5 min;加入200 μ 氯仿，劇烈振搖15 30s，靜置3 min ；在 4°C預(yù)冷的離心機(jī)中12000 rpm離心5 min，從離心機(jī)取出時(shí)避免晃動(dòng)，破壞水油界面；小心吸取上層水相轉(zhuǎn)入一新的EP管中，為避免吸到中間界面，可適量少吸取一些水相；加入和水相等體積的異丙醇(500 μ 左右)，上下顛倒10次，靜置10 min ；4°C，12000 rmp離心10 min ；小心倒去上清，用槍頭吸去管底殘留的液體；加入-20°C預(yù)冷的75%乙醇，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)EP 管數(shù)次，使乙醇浸潤沉淀和管壁；4°C，7500 rpm離心5 min ；棄上清，用槍頭吸去管底殘留的乙醇，超凈臺(tái)中敞蓋干燥5 min左右至乙醇揮發(fā)完全；加入適量DEPC水20 μ 溶解RNA 沉淀；取5 μ 電泳檢查，其余分裝保存于-70°C，或直接做反轉(zhuǎn)錄。(B)正常家蠶基因組RNA的抽提
將液氮凍存的家蠶放于液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉狀，然后分裝于1. 5 mL的離心管中。抽提正常家蠶基因組RNA的方法同上述抽提BmCPV基因組RNA。(3) RT-PCR 擴(kuò)增
依據(jù)NCBI網(wǎng)站上報(bào)道的BmCPV dsRNA基因組第5片段的核苷酸序列資料(AF 433660， gi 1666064) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF433660. 1)，設(shè)計(jì)合適的 RT— PCR擴(kuò)增引物BmCPVf/ BmCPVr，上游引物18bp，位于其5’端從2188bp到2205bp，下游引物 18bp，位于從2400bp到2417bp之間的序列，兩引物的核苷酸序列分別為 BmCPVf 5' CAGAGCCATAATGAAACG 3'；
BmCPVr 5，GTTGCTCCTGTTTTGTGG 3，；擴(kuò)增的目的片段為 230 bp。上述引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。所有基因組RNA模板的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用TaKaRa PrimeScript TM RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，然后對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)采用25 yL體系2.5 μ L 10XPCR Buffer, 1 yLdNTPs，正反向引物濃度為 10 μΜ，各加 1 yL，l yL DNA 模板，18 yLddH20，0.5 yLhi 酶(2.5 U/yL)。引物擴(kuò)增的 PCR 循環(huán)為94°C 5 min ； 94 °C 45 s，50°C 45 s ；72°C 1 min，30 循環(huán)；72°C 10 min，4°C保存。取5 μ L PCR產(chǎn)物用1. 2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用核酸染料Goldview進(jìn)行染色檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖1所示，應(yīng)用本發(fā)明方法對(duì)家蠶質(zhì)型多角體病毒基因組dsRNA的 RT-PCR檢測結(jié)果，在250bp的下方有一條清晰的帶，與預(yù)期的結(jié)果一致。泳道M. DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. BmCPV基因組dsRNA的RT-PCR產(chǎn)物；2.健康家蠶基因組RNA的 RT-PCR 產(chǎn)物；3. ddH20。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物，應(yīng)用于所述病毒的RT-PCR擴(kuò)增檢測，可以有效地?cái)U(kuò)增檢測出中腸型膿病，為生產(chǎn)上早期檢測和預(yù)知檢查家蠶中腸型膿病提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
權(quán)利要求
1.一組應(yīng)用于檢測家蠶質(zhì)型多角體病毒的引物，其特征在于分別具有SEQ ID N0:1和 SEQ ID N0:2所示以下核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述引物的應(yīng)用，其特征在于制備應(yīng)用于家蠶質(zhì)型多角體病毒的檢測方面的試劑。
3.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述引物檢測家蠶質(zhì)型多角體病毒的方法，其特征在于包括以下步驟(1)抽提家蠶質(zhì)型多角體病毒基因組dsRNA;(2)應(yīng)用所述引物對(duì)提取的家蠶質(zhì)型多角體病毒BmCPV的基因組dsRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)取步驟(2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測或用核酸染料Goldview 進(jìn)行染色檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)所述PCR擴(kuò)增采用25yL體系 2.5 μ L IOXPCR Buffer, 1 μ L dNTPs，正反向引物濃度為 10 μΜ，各力口 1 μ L，1 μ L DNA 模板，18 μ L ddH20,0. 5 μ L Taq 酶(2.5 U/yL)。
5.引物擴(kuò)增的PCR 循環(huán)條件為94°C 5 min ； 94°C 45 s，50°C 45 s ；72°C 1 min，30 循環(huán)；72°C 10 min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組應(yīng)用于檢測家蠶質(zhì)型多角體病毒的引物及檢測方法。本發(fā)明提供了一對(duì)特異的引物BmCPVf和BmCPVr，設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增程序，實(shí)現(xiàn)對(duì)家蠶質(zhì)型多角體病毒的準(zhǔn)確、快捷的檢測。本發(fā)明方法特異性強(qiáng)，檢測快速準(zhǔn)確，適于小量樣本操作，操作簡單，使用本發(fā)明方法能夠滿足對(duì)家蠶質(zhì)型多角體病毒BmCPV進(jìn)行分子診斷的需要，為生產(chǎn)上早期檢測和預(yù)知檢查家蠶中腸型膿病提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102154522SQ20111008593
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月7日
發(fā)明者劉吉平, 王永賓 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)