專利名稱：一種同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和PX02的方法。
背景技術(shù)：
炭疽桿菌是一種桿狀、能形成芽胞的革蘭氏陽性桿菌，能夠引起人畜的炭疽病，如果不及時(shí)治療，死亡率極高。炭疽桿菌含有兩個(gè)致病相關(guān)的毒力大質(zhì)粒pX01(181. 6kb)和pX02(96. 2kb)。質(zhì)粒pXOl編碼保護(hù)性抗原、致死因子和水腫因子等炭疽毒素蛋白及他們的調(diào)控基因。質(zhì)粒PX02編碼參與莢膜形成和降解的基因。這兩個(gè)質(zhì)粒對(duì)于炭疽桿菌的致病性至關(guān)重要，丟失任何一個(gè)質(zhì)粒都會(huì)導(dǎo)致炭疽菌的毒力極大的減低。因此對(duì)于炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒的研究一直是研究的熱點(diǎn)。構(gòu)建驅(qū)除毒力質(zhì)粒的突變菌株對(duì)于研究質(zhì)粒在炭疽桿菌致病中的作用及染色體的相關(guān)調(diào)控非常重要。 驅(qū)除細(xì)菌的大質(zhì)?？梢允褂抿?qū)除化學(xué)試劑、高溫培養(yǎng)或紫外照射等方法。Sterne等在1937-1939年期間，用含50%動(dòng)物血清的培養(yǎng)基上，于20% CO2條件下培養(yǎng)，挑選粗糙型集落，選育出無莢膜之弱毒菌株(PX02_)，廣泛用于世界各國制備獸用炭疽芽胞苗。我國楊叔雅、莊漢瀾等人1953年，采用人工紫外線照射定向變異方法，選育出人用弱毒菌苗株A16R(其為ρΧ01+ρΧ02_)，經(jīng)檢定證明安全性和免疫原性較好，1960年正式用于制備人用炭疽活菌苗。2004年王秉翔采用在42. 5°C高溫培養(yǎng)篩選出一株pXOl丟失的突變炭疽菌，該菌株完全喪失了形成芽胞的能力。2006年展德文等采用42°C高溫培養(yǎng)法，驅(qū)除了炭疽桿菌人用減毒疫苗株A16R(pX01+pX02_)中的大質(zhì)粒pXOl，獲得一株無質(zhì)粒的炭疽菌A16RP(pX0rpX02_)，該菌株芽胞形成能力正常；2007年韓國的Sung-Ha Park等人，采用42°C高溫培養(yǎng)法從炭疽桿菌H9401 (pX01+pX02+)株中驅(qū)除了大質(zhì)粒pXOl，獲得了一株衍生菌H9401 (ρΧ0ΓρΧ02+)。這些驅(qū)除大質(zhì)粒的方法中，毒力大質(zhì)粒的丟失是隨機(jī)的，在驅(qū)除一個(gè)目的質(zhì)粒的時(shí)候，很可能同時(shí)驅(qū)除另一個(gè)質(zhì)粒，因而必須經(jīng)過大量的篩選過程，有時(shí)甚至得不到所需要的菌株，另外，在篩選的過程中可能導(dǎo)致宿主菌染色體的隨機(jī)突變，這必將使后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋復(fù)雜化，因而需要建立一種用于炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒驅(qū)除的特異、安全和有效方法。質(zhì)粒不相容是指兩個(gè)不同的但是相關(guān)的質(zhì)粒不能穩(wěn)定地在同一個(gè)細(xì)胞中遺傳。這種不相容性主要是由于互相競爭相同的復(fù)制位點(diǎn)或分離位點(diǎn)，或者是由于復(fù)制起始的抑制。使用這個(gè)原理可以模擬自然機(jī)制使用一個(gè)小的、高拷貝的質(zhì)粒來去除毒力大質(zhì)粒。這種方法驅(qū)除質(zhì)?？梢蕴禺惖臉?gòu)建質(zhì)粒缺失菌株而避免了誘導(dǎo)突變的危險(xiǎn)。在一些細(xì)菌中已經(jīng)應(yīng)用質(zhì)粒不相容原理成功的驅(qū)除了目的質(zhì)粒，證明這是一種高效、安全的方法。但是由于對(duì)炭疽桿菌大質(zhì)粒的復(fù)制和分離的還不是很清楚，因而該方法在炭疽桿菌中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。一直以來，人們作了很多努力來解釋pXOl的復(fù)制和分離，但是鑒定質(zhì)粒pXOl的復(fù)制子的研究進(jìn)展很慢，這是因?yàn)檫@個(gè)質(zhì)粒不編碼任何與其它質(zhì)粒編碼的已知的復(fù)制起始蛋白有相似性的蛋白。Robertson等人于1990年嘗試這定位pXOl的復(fù)制起始區(qū)，克隆了 pXOl的DNA片段進(jìn)入大腸桿菌的質(zhì)粒然后轉(zhuǎn)化到枯草桿菌中，鑒定到了幾個(gè)克隆，定位在質(zhì)粒pXOl上一個(gè)Ilkb的區(qū)域，這段序列包含10個(gè)開放閱讀框，編碼的產(chǎn)物與已知參與theta復(fù)制的rep蛋白無序列相似性。1999年,Jacques Ravel等人用鳥槍法獲得了 pXOl質(zhì)粒的全序列，pXOl質(zhì)粒不含有已知的革蘭氏陽性菌復(fù)制和分離相關(guān)的序列及復(fù)制蛋白。在2009年，Andrei P等人應(yīng)用Cre-IoxP重組系統(tǒng)鑒定到一個(gè)不同于以前鑒定到的pXOl復(fù)制起始區(qū)，這段序列長約5. 95kb。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種DNA分子。本發(fā)明提供的一種DNA分子，為如下(I)或⑵或(3)(I)序列表中序列I所示的DNA分子； (2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子；(3)與⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。含有所述DNA分子的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體為將所述的DNA分子插入穿梭質(zhì)粒的HindIII和EcoRI識(shí)別位點(diǎn)間得到的載體。所述穿梭質(zhì)粒為溫敏型穿梭質(zhì)粒，所述溫敏型穿梭質(zhì)粒具體為pKSV7。所述重組載體在同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟將所述重組載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌，得到重組菌；將所述重組菌傳代培養(yǎng)，至所述重組菌中的炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和PX02被驅(qū)除，得到同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和PX02的重組菌。所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02的方法中，將所述重組載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌前，還包括將所述重組載體去甲基化的步驟，所述去甲基化的方法包括如下步驟I)、將所述重組載體轉(zhuǎn)入甲基化酶缺陷的大腸桿菌中，得到重組菌I ;2)、提取步驟I)得到的所述重組菌I的質(zhì)粒，得到去甲基化的重組載體；所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02的方法中，在所述傳代培養(yǎng)后，還包括將所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和PX02的重組菌去除所述重組載體的步驟，
將所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02的重組菌去除所述重組載體的方法包括如下步驟將所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02的重組菌分別接種在無所述重組載體抗性篩選標(biāo)記物培養(yǎng)基和含所述重組載體抗性篩選標(biāo)記物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選取在無所述重組載體抗性篩選標(biāo)記物培養(yǎng)基生長且在含所述重組載體抗性篩選標(biāo)記物的培養(yǎng)基上不生長的菌，得到驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pX01、pX02和所述重組載體的重組菌。所述出發(fā)菌為炭疽桿菌(Bacillus anthracis)；所述甲基化酶缺陷的大腸桿菌為大腸桿菌SCSllO ；所述抗性篩選標(biāo)記物為氯霉素；所述傳代培養(yǎng)的溫度為不高于30°C，所述傳代培養(yǎng)的溫度具體為30°C ； 所述將同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02的重組菌去除所述重組載體的方法中，所述培養(yǎng)溫度為37°C -42°C，所述培養(yǎng)溫度具體為37°C。由所述方法制備的驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02的重組菌和/或驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl、pX02和所述重組載體的重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述的DNA分子、所述重組載體、所述的驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02的重組菌和/或驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pX01、pX02和所述重組載體的重組菌在制備疫苗中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述疫苗具體為炭疽疫苗；一種炭疽疫苗，其活性成分為所述的驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02的重組菌和/或驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl、pX02和所述重組載體的重組菌。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明根據(jù)質(zhì)粒不相容的原理，把來自于pXOl的一段序列和來自于pX02的一段序列串聯(lián)起來,與一個(gè)溫敏型質(zhì)粒連接起來構(gòu)建成一個(gè)不相容質(zhì)粒，該質(zhì)粒能夠特異地從炭疽桿菌A16 (pX01+pX02+)中驅(qū)除毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02，得到構(gòu)建炭疽桿菌的質(zhì)粒缺失株，該方法對(duì)于研究毒力大質(zhì)粒與染色體的相互作用具有極其重要的意義，必將加深目前對(duì)于炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒復(fù)制和分離的認(rèn)識(shí)，同時(shí)對(duì)于構(gòu)建新的疫苗株提供了新的實(shí)驗(yàn)手段，為炭疽桿菌的防治提供了新的思路。


圖I為外源重組質(zhì)粒pKORT示意2為外源重組質(zhì)粒pKORT的PCR鑒定3為重組質(zhì)粒pKORT導(dǎo)入炭疽桿菌A16中鑒定引物示意4為驅(qū)除pXOl和pX02的初步篩選圖5為驅(qū)除pXOl和pX02的PCR方法鑒定圖6為Western Blotting方法檢測PA蛋白圖7為野生株炭疽桿菌A16和驅(qū)除質(zhì)粒炭疽菌PK0RT/A16莢膜形成檢測圖8為外源重組質(zhì)粒pKORT從A16中驅(qū)除鑒定
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例I、驅(qū)除pXOl的重組菌的獲得及鑒定I、驅(qū)除質(zhì)粒構(gòu)建I. I溫敏型質(zhì)粒線性化將溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKSV7(6. 9Kb)用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoR I雙酶切線性化(HindIII和EcoR I是pKSV7的多克隆位點(diǎn))，之后O. 6%瓊脂糖凝膠電泳分離，從凝膠上切下目標(biāo)條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收線性化載體PKSV7片段，操作步驟按照說明書進(jìn)行。骨架質(zhì)粒pKSV7質(zhì)粒(其上既沒有轉(zhuǎn)座子也沒有插入序列)Smith K, YoungmanP. Use of a new integrational vector to investigate compartment-specificexpression of the Bacillus subtilis spoIIM gene[J]· Biochimie，1992，74 :705-711.，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所獲得。I. 2.驅(qū)除片段的PCR獲得 以炭疽桿菌(Bacillus anthracis) A16 (既有pXOl+又有pX02_,記載在自國內(nèi)強(qiáng)毒炭疽桿菌中一株變異疫苗株的獲得，楊叔雅等，軍事醫(yī)學(xué)雜志，第I卷，第4期，288，1958，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所獲得。)基因組為模板，分別使用弓丨物對(duì)0R1_F/0R1_FR、0R2_F/0R1_FR(序列見表I)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到PCR產(chǎn)物ORl和PCR產(chǎn)物0R2。PCR 的體系為 100uL(l μ L Pyrobest DNA polymerase, 10 μ L IOX PolymeraseBuffer, 8 μ L dNTP mixture, 2 μ L模板DNA, 2 μ L primer F, 2 μ L primer R,用去離子水補(bǔ)足IOOuL體系)；PCR的條件為先94°C變性5min，接著進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)94°C變性40s，56°C退火40s，72°C延伸6min，最后在結(jié)束前在在72°C延伸5min。之后用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(博邁德公司)分別回收ORl和0R2，操作按照說明書進(jìn)行。I. 3驅(qū)除片段與線性化載體連接、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定使用CloneEZ連接試劑盒(南京金斯瑞公司)進(jìn)行I. I得到的線性化載體pKSV7與I. 2得到的ORl和0R2連接反應(yīng)。30 μ L體系連接體系6 μ L質(zhì)粒載體pKSV7，8 μ L ORl片段，7 μ L 0R2片段，酶與buffer各3yL，滅菌純水3yL。具體方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。取連接體系IOyL轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞DH5a，之后在ImL不含抗生素的LB培養(yǎng)基中在200rpm搖床上30°C培養(yǎng)3小時(shí)；在含氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB瓊脂板上涂布，在30°C孵箱中培養(yǎng)12小時(shí)。挑取單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR，引物分別為0R1_F/0R1_R、引物0R2_F/0R2_R、0R1_F/0R2_R，結(jié)果見圖 2 所示，圖中 I 為引物 0R1_F/0R1_R，2 為引物 0R2_F/0R2_R，3為0R1_F/0R2_R的擴(kuò)增條帶，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)。從圖中看出，分別得到4869bp、3857bp、8685bp的片段為陽性質(zhì)粒，將陽性質(zhì)粒送去測序，結(jié)果為該陽性質(zhì)粒中含有序列表中的序列1，該質(zhì)粒為將序列表中的序列I同源重組到PKSV7的HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為PK0RT，pKORT的結(jié)構(gòu)示意圖如圖I所示。序列表的序列I由8685個(gè)核苷酸組成。2.驅(qū)除炭疽炭疽A16中的pXOl和pX02質(zhì)粒A、轉(zhuǎn)化將I得到的質(zhì)粒pKORT先電轉(zhuǎn)入大腸桿菌SCSllO (購自TransGen公司，電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備參照Shatalin KY, Neyfakh AA(2005)Efficient gene inactivation inBacillus anthracis. FEMS Microbiol Lett 245:315-319)去甲基化后(將電轉(zhuǎn)化的菌株再次提取質(zhì)粒后，電轉(zhuǎn)入A16，因?yàn)榉侨ゼ谆馁|(zhì)粒進(jìn)入炭疽后，將會(huì)被降解，影響質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化)，再將其電轉(zhuǎn)入炭疽桿菌A16感受態(tài)細(xì)胞中(制備參照Shatalin KY, NeyfakhAA(2005)Efficient gene inactivation in Bacillus anthracis. FEMS Microbiol Lett245 :315-319),電轉(zhuǎn)化炭疽桿菌時(shí)的電擊條件是電壓，0.6kv ;電阻，500 Ω ;電容，25yF ;所用電擊儀為產(chǎn)自美國的Bio-RAD GenePulser II electroporator ;電擊杯規(guī)格為0. 1cm。B、篩選過程電轉(zhuǎn)完畢后加ImL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，在200rpm搖床上30°C培養(yǎng)3小時(shí)；在含氯霉素(5μ g/mL)的LB瓊脂平板上涂布(炭疽芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，在革蘭氏陽性菌中使用氯霉素進(jìn)行篩選)，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)。然后對(duì)平板上長出的單克隆進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物采用0RTid_F/0RTid_R(序列見表1，PCR示意圖如圖3所示)，得到約645bp (序列表中序列I的第4512-5156位核苷酸)的片段為陽性克隆，提取陽性克隆的質(zhì)粒送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為PK0RT，將含有該質(zhì)粒的克隆命名為pK0RT/A16。C、鑒定結(jié)果 I)菌落PCR初步篩選將pK0RT/A16接入含氯霉素(5 μ g/mL)的Luria-Bertani (LB)液體培養(yǎng)基中，在30°C搖床上225rpm培養(yǎng)12小時(shí)，吸取4uL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到4mL新鮮的LB肉湯中(含氯霉素5 μ g/mL)，在30°C搖床上225rpm培養(yǎng)12小時(shí)，如此轉(zhuǎn)接和培養(yǎng)5次，吸取部分菌液適當(dāng)稀釋后，涂LB平板(含氯霉素5 μ g/mL)。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR，對(duì)質(zhì)粒pXOl上的特異的幾個(gè)基因(pagA, lef, cya和atxA)以及pX02上的特異基因(capA, capB, capC)進(jìn)行PCR檢測，以菌落為模板，pagA的特異引物pag_F、pag_R，Ief的特異引物lef_F、lef_R,cya的特異引物cya_F、cya_R, atxA的特異引物atxA_F、atxA_R分別作為引物，capA的特異引物為CapA-F和CapA-R，capB特異引物為CapB-F和CapB_R，capC特異引物為CapC-F和CapC-R(引物的序列均見表1)，結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出，pK0RT/A16菌株單菌落都沒有陽性擴(kuò)增條帶，表明PXOl和pX02質(zhì)?？赡芤呀?jīng)丟失。菌落鑒定沒有擴(kuò)增條帶的菌株為陽性pK0RT/A16。傳代5次，即可篩選出陽性菌株，傳代10次，篩選率可達(dá)到92%。2)使用另外18對(duì)引物進(jìn)一步確定的結(jié)果為了進(jìn)一步確認(rèn)pXOl和pX02的丟失情況，提取初步篩選為陽性pK0RT/A16的基因組DNA，對(duì)pXOl和pX02上質(zhì)粒上的各9個(gè)特異基因進(jìn)行檢測(具體見表I)，pX01_07的特異引物為 pX01_07F 和 pX01_07R、pX01_13 的特異引物為 pX01_13F 和 pX01_13R、pX01_16的特異引物為pX01_16F和pX01_16R、pX01_23的特異引物為pX01_23F和pX01_23R、pX01_70的特異引物為pX01_70F和pX01_70R、pX01_90的特異引物為pX01_90F和pX01_90R、pX01_95 的特異引物為 pX01_95F 和 pX01_95R、pX01_98 的特異引物 pX01_98F和 pX01_98R、pX01_116 的特異引物 pX01_116F 和 pX01_116R、pX02_007 的特異引物pX02_007F 和 pX02_007R、pX02_039 的特異引物 pX02_039F 和 pX02_039R、pX02_060 的特異引物 pX02_060F 和 pX02_060R、pX02_084 的特異引物 pX02_084F 和 pX02_084R、pX02_089的特異引物 pX02_089F 和 pX02_089R、pX02_094 的特異引物 pX02_094F 和 pX02_094R、pX02_097 的特異引物 pX02_097F 和 pX02_097R、pX02_107 的特異引物 pX02_107F 和pX02_107R、pX02_lll的特異引物pX02_lllF和pX02_lllR ;引物具體序列如下表I中所示，以A16D1 (pX01-/pX02+)和A16R(購自蘭州生物制品研究所，其為pX01+/pX02_)為對(duì)照；結(jié)果如圖5 所示，圖中的 1，2，3 分別代表 A16Dl(pX01-/pX02+)、A16R和 pK0RT/A16三個(gè)菌株；A和B圖為pXOl質(zhì)粒丟失情況鑒定結(jié)果，C和D圖為pX02質(zhì)粒丟失情況鑒定結(jié)
果O A16D1 (ρΧ0Γ/ρΧ02+)通過如下方法制備以炭疽桿菌(Bacillus anthracis)A16R(購自蘭州生物制品研究所，其為pX01+/pX02_)基因組為模板，使用引物對(duì)5K_F和5K_R(表I)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物(炭疽桿菌質(zhì)粒pXOl (GenBank accessionno. AF065404)上的一段序列，范圍包括第19072到23919位)，將溫度敏感型穿梭質(zhì)粒PKSV7 (6. 9Kb)用限制性內(nèi)切酶SmaI酶切線性化，使用CloneEZ連接試劑盒(南京金斯瑞公司)將線性化載體PKSV7與PCR片段連接，得到重組質(zhì)粒pKS5K。將pKS5K先電轉(zhuǎn)入大腸桿菌SCSI 10 (購自TransGen公司)去甲基化后，再將其電轉(zhuǎn)入炭疽桿菌A16感受態(tài)細(xì)胞中，用氯霉素(5 μ g/mL)的LB瓊脂平板篩選，得到重組菌pKS5K/A16。將pKS5K/A16接入含氯霉素(5 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基，在30°C搖床上225rpm培養(yǎng)12小時(shí)，吸取50uL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到5mL新鮮的LB肉湯中(含氯霉素5 μ g/mL)，在30°C搖床上225rpm培養(yǎng)12小時(shí)，如此轉(zhuǎn)接和培養(yǎng)8次，吸取部分菌液適當(dāng)稀釋后，涂LB平板(含氯霉素5 μ g/mL)。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR，對(duì)質(zhì)粒pXOl上的特異的幾個(gè)基因(pagA，lef，cya和atxA)行PCR檢測，PCR檢測結(jié)果顯示PXOl已經(jīng)去除的單菌落命名為PKS5K/A16D1，將pKS5K/A16Dl，接5m無抗性LB液體培養(yǎng)基在37°C的搖床上培養(yǎng)10h，然后按I %轉(zhuǎn)接到另一 5mL無抗性LB液體培養(yǎng)中于37°C搖床上培養(yǎng)12h，反復(fù)按I %轉(zhuǎn)接多次后，對(duì)菌液進(jìn)行梯度稀釋，取10_4、10_5兩個(gè)稀釋度的菌液，涂布無抗平板。次日，挑取平板上的單克隆進(jìn)行點(diǎn)板，每一個(gè)單克隆分別點(diǎn)板于LB無抗板和含氯霉素(Cm濃度為5μ g/mL)的LB瓊脂平板，將點(diǎn)板后的平板置30C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日，挑取在無抗性平板上生長而在Cm抗性瓊脂平板上不生長的單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定(pKSV7P3_F 和 pKSV7P3_R，pKSV7P6_F 和 pKSV7P6_R)和 Cm 抗性試管(5 μ g/mL)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)(30°C，225rpm搖床培養(yǎng))，確定其在Cm抗性試管中不長，并用PCR鑒定，以pKSV7P3的特異引物為 pKSV7P3_F 和 pKSV7P3_R、pKSV7P6 的特異引物為 pKSV7P6_F 和 pKSV7P6_R，PCR結(jié)果沒有相應(yīng)的特異性條帶的為正確的菌株，將該克隆命名為A16D1 (pX01-/pX02+)。具體結(jié)果如下以A16R基因組DNA為模板時(shí)，pXOl上的9對(duì)特異引物都能擴(kuò)增出特異條帶，pX01_07(1104bp，AF065404 第 8352 到 6544) ;pX01_13 (787bp，AF065404 第 19002到 15040) ；pX01_16(742bp, AF065404 第 22188 到 23897) ；pX01_23 (1286bp, AF065404 第33006 到 31621) ;pX01_70 (757bp，AF065404 第 84298 到 85611) ；pX01_90 (1250bp, AF065404第 106772 到 108730) ；pX01_95 (1076bp, AF065404 第 113430 到 114761) ；pX01_98 (767bp,AF065404 第 118950 到 117718) ;pX01_116 (799bp，AF065404 第 143333 到 146110)(這里的位置是閱讀框全長的位置，標(biāo)示的長度為實(shí)際擴(kuò)增的閱讀框中的一部分序列，引物的位置見引物列表)；而當(dāng)以A16D1 (ρΧ0Γ/ρΧ02+)、pK0RT/A16的基因組DNA為模板時(shí)，以pXOl上的9對(duì)特異引物都沒有擴(kuò)增出特異條帶，這進(jìn)一步確定了 pXOl確實(shí)從炭疽桿菌A16中丟失了。以A16D1 (ρΧ0Γ/ρΧ02+)基因組DNA為模板時(shí)，pX02上的9對(duì)特異引物都能擴(kuò)增出特異條帶，pX02_007(689bp, NC_007323 第 4731 到 3589)、pX02_039 (918bp, NC_007323第 33625 到 32087)、pX02_060 (620bp, NC_007323 第 50376 到 48928)、pX02_084 (855bp,NC_007323 第 68439 到 69890)、 pX02_089(783bp， NC_007323 第 74581 到 73022)、pX02_094(948bp, NC_007323 第 76444 到 77709)、pX02_097 (866bp, NC_007323 第 80259 到78745)、pX02_107(645bp, NC_007323 第 89625 到 88591)、pX02_lll (625bp, NC_007323 第93097到91328)(這里的位置是閱讀框全長的位置，標(biāo)示的長度為實(shí)際擴(kuò)增的閱讀框中的一部分序列，引物的位置見引物列表)；而當(dāng)以A16R和pKORT/A16的基因組DNA為模板時(shí)，9對(duì)特異弓I物都沒有擴(kuò)增出特異條帶，這進(jìn)一步確定了 PX02確實(shí)從炭疽桿菌A16中丟失了。結(jié)果顯示炭疽桿菌野生株A16的兩個(gè)毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02已經(jīng)被驅(qū)除，該菌株為 pK0RT/A16。3)表型鑒定因?yàn)閜XOl上有編碼保護(hù)性抗原(PA)的基因，驅(qū)除了 pXOl后的菌株一定不能產(chǎn)生 PA,所以通過Western Blotting來檢測PA的表達(dá)情況來進(jìn)一步確認(rèn)pXOl的丟失情況。pK0RT/A16在含0. 9%碳酸氫鈉的LB瓊脂平板上劃線，在37°C，15 % CO2條件下培養(yǎng)12h，從平板上刮去菌苔制成菌懸液，加上樣緩沖液(配方參見科學(xué)出版社《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版)沸水浴煮lOmin，離心，取上清，SDS-PAGE上樣，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，做WB檢測。一抗為PA抗體，二抗為IgG-HRP。醫(yī)用膠片，顯影液，定影液購自柯達(dá)公司。以A16(樣品制備方法同上)和PA蛋白(大腸桿菌表達(dá)的PA蛋白，PA蛋白的genbank號(hào)為PID :2820165)為對(duì)照?？贵w購自Santa Cruz公司，一抗PA抗體貨號(hào)sc-52123，二抗羊抗小鼠 IgG-HRP sc-2031。結(jié)果如圖6所示，從圖中看出，顯示A16的菌體蛋白能夠與PA抗體產(chǎn)生特異的Western雜交帶，而pK0RT/A16的菌體蛋白與PA抗體沒有特異的Western雜交帶,這再次說明pXOl已經(jīng)從A16中驅(qū)除。因?yàn)镻X02上有編碼炭疽桿菌芽孢莢膜的基因，驅(qū)除了 PX02后的菌株一定不能產(chǎn)生莢膜，所以通過墨汁負(fù)染在光鏡下觀察莢膜的形成情況，以進(jìn)一步確認(rèn)PX02的丟失情況。莢膜培養(yǎng)條件為含0.9% (質(zhì)量百分含量)碳酸氫鈉，5% (體積百分含量)馬血清的LB培養(yǎng)基上劃線接菌。37°C，15%二氧化碳下培養(yǎng)14小時(shí)。以A16為對(duì)照。結(jié)果如圖7所示，圖A為野生株A16形成莢膜情況；圖B為雙質(zhì)粒驅(qū)除株pKORT/A16莢膜形成情況，可以看出，A16的菌體能正常形成莢膜，而PK0RT/A16的菌體不能形成莢膜，這再次說明PX02已經(jīng)從A16中驅(qū)除。3、把不相容質(zhì)粒pKORT從炭疽桿菌A16中驅(qū)除的過程篩選因?yàn)闃?gòu)建的外源質(zhì)粒的骨架質(zhì)粒pKSV7為溫敏性質(zhì)粒，在37°C _42°C下丟失，而37°C為炭疽桿菌的最佳生長溫度，為了避免炭疽菌在過高的溫度生長傳代，所以選擇在37°C丟外源重組質(zhì)粒。挑取驅(qū)除pXOl和pX02質(zhì)粒的單克隆pK0RT/A16接5mL無抗性LB液體培養(yǎng)基在37°C的搖床上培養(yǎng)10h，然后按I %轉(zhuǎn)接到另一 5mL無抗性LB液體培養(yǎng)中于37°C搖床上培養(yǎng)12h，反復(fù)按I %轉(zhuǎn)接多次后，對(duì)菌液進(jìn)行梯度稀釋，取10-4、10-5兩個(gè)稀釋度的菌液，涂布無抗平板。次日，挑取平板上的單克隆進(jìn)行點(diǎn)板，每一個(gè)單克隆分別點(diǎn)板于LB無抗板和含氯霉素(Cm濃度為5 μ g/mL)的LB瓊脂平板,將點(diǎn)板后的平板置30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日，挑取在無抗性平板上生長而在Cm抗性瓊脂平板上不生長的單克隆進(jìn)行菌落PCR 鑒定(pKSV7P3_F 和 pKSV7P3_R，pKSV7P6_F 和 pKSV7P6_R)和 Cm 抗性試管(5 μ g/mL)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)(30°C，225rpm搖床培養(yǎng))，確定其在Cm抗性試管中不長，由此選出陽性克隆A。對(duì)選出的陽性克隆A進(jìn)行接種于無抗性試管培養(yǎng)，然后提取它的基因組，以基因組做模板，以 PKSV7P3 的特異引物為 pKSV7P3_F 和 pKSV7P3_R，pKSV7P6_F 和 pKSV7P6_R(pKSV7P3和pKSV7P6為pKSV7載體的特異片段，進(jìn)行PCR鑒定，以pK0RT/A16為對(duì)照，結(jié)果如圖8所示，其中，I為pK0RT/A16，2為陽性克隆A，可以看出，2陽性克隆A中均未有片段擴(kuò)增，而pK0RT/A16分別得到843bppKSV7P3和535bppKSV7P6的片段。將PCR鑒定無片段的陽性克隆命名為A16QT。該菌株A16QT為pXOl和pX02質(zhì)粒都缺失同時(shí)又不含外源質(zhì)粒的突變株。表I為實(shí)驗(yàn)中使用的弓丨物序列

權(quán)利要求
1.一種DNA分子，為如下(I)或⑵或(3) (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
2.含有權(quán)利要求I所述DNA分子的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于 所述重組載體為將權(quán)利要求I所述的DNA分子插入穿梭質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組載體，其特征在于 所述穿梭質(zhì)粒為溫敏型穿梭質(zhì)粒， 所述溫敏型穿梭質(zhì)粒具體為PKSV7。
5.權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體在同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02中的應(yīng)用。
6.一種同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02的方法，包括如下步驟 將權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌，得到重組菌；將所述重組菌傳代培養(yǎng)，至所述重組菌中的炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和pX02被驅(qū)除，得到同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和pX02的重組菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于 所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和PX02的方法中，在將權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌前，還包括將權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體去甲基化的步驟， 所述去甲基化的方法包括如下步驟 1)、將權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體轉(zhuǎn)入甲基化酶缺陷的大腸桿菌中，得到重組菌I ; 2)、提取步驟I)得到的所述重組菌I的質(zhì)粒，得到去甲基化的重組載體； 所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和pX02的方法中，在所述傳代培養(yǎng)后，還包括將所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和pX02的重組菌去除權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體的步驟， 將所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和pX02的重組菌去除權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體的方法包括如下步驟 將所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和pX02的重組菌分別接種在無所述重組載體抗性篩選標(biāo)記物培養(yǎng)基和含所述重組載體抗性篩選標(biāo)記物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選取在無所述重組載體抗性篩選標(biāo)記物培養(yǎng)基生長且在含所述重組載體抗性篩選標(biāo)記物的培養(yǎng)基上不生長的菌，得到驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pX01、pX02和所述重組載體的重組菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于 所述出發(fā)菌為炭疽桿菌(Bacillus anthracis)； 所述甲基化酶缺陷的大腸桿菌為大腸桿菌SCSllO ；所述抗性篩選標(biāo)記物為氯霉素； 所述傳代培養(yǎng)的溫度為不高于30°C，所述傳代培養(yǎng)的溫度具體為30°C ； 所述將同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和pX02的重組菌去除權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體的方法中，所述培養(yǎng)溫度為37°C _42°C，所述培養(yǎng)溫度具體為37°C。
9.由權(quán)利要求6-8中任一所述方法制備的驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02的重組菌和/或驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl、pX02和所述重組載體的重組菌。
10.權(quán)利要求I所述的DNA分子、權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體、權(quán)利要求9所述的驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和pX02的重組菌和/或驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl、pX02和所述重組載體的重組菌在制備疫苗中的應(yīng)用；所述疫苗具體為炭疽疫苗； 一種炭疽疫苗，其活性成分為權(quán)利要求9所述的驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl和pX02的重組菌和/或驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl、pX02和所述重組載體的重組菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的方法。本發(fā)明提供了一種DNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列1。含有所述DNA分子的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。所述重組載體為將所述的DNA分子插入穿梭質(zhì)粒的HindIII和EcoRI識(shí)別位點(diǎn)間得到的載體。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明根據(jù)質(zhì)粒不相容原理構(gòu)建一個(gè)不相容質(zhì)粒，獲得了一株不含毒力大質(zhì)粒的菌株A16QT。該方法具有簡單、快速、特異性好、安全性高的特點(diǎn)。該方法對(duì)于構(gòu)建炭疽桿菌的質(zhì)粒缺失株，從而研究大質(zhì)粒pXO1和pXO2與染色體的相互作用具有極其重要的意義，對(duì)于構(gòu)建新的疫苗株提供了新的實(shí)驗(yàn)手段，為炭疽桿菌的防治提供了新的思路。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102732510SQ201110086469
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月7日
發(fā)明者馮爾玲, 劉先凱, 王東澍, 王華貴, 王恒樑 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所