專利名稱：基于易錯(cuò)pcr技術(shù)提高內(nèi)切葡聚糖酶的活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種基于易錯(cuò)PCR技術(shù)提高內(nèi)切葡聚糖酶的活性的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
資源和環(huán)境問題是人類在21世紀(jì)面臨的最主要的挑戰(zhàn)。而纖維素是地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生資源。纖維素這一巨大可再生資源的有效利用對(duì)解決環(huán)境污染、食品短缺、能源危機(jī)具有重大現(xiàn)實(shí)意義，利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶來分解和轉(zhuǎn)化纖維素則是纖維素利用的有效途徑。但目前纖維素酶的高成本和低酶活，影響了纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。因此通過基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行改造具有重要的科學(xué)和實(shí)用價(jià)值。芽孢桿菌能產(chǎn)生中性或偏堿性內(nèi)切葡聚糖酶，它不同于以往絕大多數(shù)的真菌產(chǎn)生的酸性內(nèi)切葡聚糖酶，能夠應(yīng)用于棉紡織品水洗整理工藝及洗滌劑工業(yè)中，對(duì)其的研究是目前的熱點(diǎn)。然而，自然界篩選出來的菌株都有酶活較低，且表達(dá)量不太穩(wěn)定。易錯(cuò)PCR技術(shù)是定向進(jìn)化研究最早采用的一種構(gòu)建基因文庫的方法。首次提出易錯(cuò)PCR是Leimg等人。易錯(cuò)PCR是指通過改變PCR的反應(yīng)條件，如調(diào)整反應(yīng)體系中4種 dNTP的濃度、增加Mg2+的濃度、加入Mn2+或使用低保真度Taq酶等，使堿基在一定程度上隨機(jī)錯(cuò)配而引入多點(diǎn)突變，構(gòu)建突變庫，篩選出所需的突變體。易錯(cuò)PCR的關(guān)鍵是控制DNA的突變頻率。如果DNA的突變頻率太高，產(chǎn)生的絕大多數(shù)酶將失去活性；如果突變頻率太低， 野生型的背景太高，樣品的多樣性則較少。對(duì)于每一 DNA序列來說，合理的堿基突變數(shù)是 1-3個(gè)。理想的堿基置換率和易錯(cuò)PCR的最佳條件則依賴于隨機(jī)突變的目標(biāo)DNA片段的片段長度。在該方法中，遺傳變化只發(fā)生在單一分子內(nèi)部，所以屬于無性進(jìn)化。由于它較為費(fèi)力、 耗時(shí)，一般多用于較小基因片段(< 800bp)的改造。在通常情況下，經(jīng)一輪的易錯(cuò)PCR、定向篩選，很難獲得令人滿意的結(jié)果，由此發(fā)展出了連續(xù)易錯(cuò)PCR(Sequential error-prone PCR)，該方法是將一次PCR擴(kuò)增得到的有益突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)進(jìn)行隨機(jī)誘變，使得每一次獲得的少量突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前堿性內(nèi)切葡聚糖酶酶活低、難以滿足工業(yè)生產(chǎn)需要的缺點(diǎn)，對(duì)來源于枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因進(jìn)行定向進(jìn)化，篩選出酶活顯著提高的突變體，為內(nèi)切葡聚糖酶工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的具體實(shí)施步驟如下1、獲得突變內(nèi)切葡聚糖酶基因(1)接種一環(huán)含有pMD19-T_Cen質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α于IOmL LB (Amp)液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒提取試劑盒按說明提取pMD19-T-Cen質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒通過 Bgl II，Sph I雙酶切對(duì)其進(jìn)行檢測，檢測正確后作為易錯(cuò)PCR的模板。(2)調(diào)整反應(yīng)參數(shù)和反應(yīng)體系，通過引物
Pl :5’ -TAATCCAACCCGGAATTCGCAGAGACAAAAACGCCAGTAGC-3，P2 :5’ TAGGAAAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAAA-3’進(jìn)行易錯(cuò)PCR。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用純化試劑盒對(duì)易錯(cuò)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。2、內(nèi)切葡聚糖酶大腸桿菌突變體庫的構(gòu)建(1)將回收的易錯(cuò)PCR突變的內(nèi)切葡聚糖酶基因庫經(jīng)EcoR I，NotI雙酶切后，連入同樣經(jīng)過EcoR I，NotI雙酶切的含有T71ac啟動(dòng)子和氨芐青霉素抗性基因的表達(dá)載體 pET-32a(+)中。(2)大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備方法為將E. coli BL21劃線接種LB 平板，37°C培養(yǎng)直至長出單菌落；挑取一個(gè)單菌落，接種至含有IOmL LB培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，37°C，170rpm培養(yǎng)過夜；將上述培養(yǎng)液按接種量接種到50mL LB液體培養(yǎng)基中， 37°C，170rpm振蕩培養(yǎng)1. 5-2小時(shí)；將培養(yǎng)后的菌液置冰浴中，使培養(yǎng)物冷卻到0°C，IOmin 后轉(zhuǎn)移到無菌的50mL離心管中，40C，4300rpm離心5min，倒掉上清液；向管中加入30mL無菌預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2-MgCl2溶液重新懸浮菌體，4°C，4300rpm離心8min，去掉上清液； 向管中加入2mL無菌預(yù)冷的0. ImoVLCaCl2溶液重新懸浮菌體；(3)取一支裝有100 μ L Ε. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，置冰浴中解凍；將過夜連接產(chǎn)物全部加入到上述Ep管中，并用加樣器輕輕混合均勻；將Ep管冰浴30min ；將Ep管放入 42°C恒溫水浴中熱擊90-120秒；迅速將Ep管置冰浴中靜置5min ；向Ep管中加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基置37°C搖床培養(yǎng)60min，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因；取培養(yǎng)后的菌液200 μ L用玻棒涂布在LB (Amp)平板上，將平板置37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)直至液體被吸收后，將平板倒置繼續(xù)培養(yǎng)12-1 后直至單個(gè)菌落出現(xiàn)，即為含有突變內(nèi)切葡聚糖酶基因Cerfp的突變體庫。3、高酶活菌株的篩選(1)將LB(Amp)平板上長出的菌落(構(gòu)建好的突變體庫，平板上每個(gè)菌落就是一個(gè)克隆子)一一對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)入LB (Amp)平板和LB (Amp、IPTG、CMC-Na)平板上，轉(zhuǎn)板后將平板置37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，LB(Amp)平板培養(yǎng)他后取出放入4°C冰箱保存，LB(Amp, IPTG、 CMC-Na)平板繼續(xù)培養(yǎng)36h，然后采用剛果紅染色法觀察水解圈的大小，同時(shí)每個(gè)平板分別以原始菌和不含有內(nèi)切葡聚糖酶基因的空載體作為陽性和陰性對(duì)照?？此馊Φ拇笮『Y選出目的菌株，再對(duì)應(yīng)從氨芐青霉素平板上找出目的克隆菌株。(2)將初步篩選得到的酶活性提高的陽性克隆子接種IOmL LB(Amp)液體培養(yǎng)基，37°C、170rpm培養(yǎng)過夜，再以的接種量接種到20mL LB(Amp)液體培養(yǎng)基中，37°C， 170rpm振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期(0D值0. 6 0. 8)，補(bǔ)加終濃度為lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 他，破碎細(xì)胞測其上清液酶活。4、高酶活菌株突變基因的分析復(fù)篩出來的酶活提高的菌株用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α， 用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證導(dǎo)入基因的正確性，并挑取陽性菌株送^witrogen 公司測序。對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析，找出突變堿基位點(diǎn)和氨基酸位點(diǎn)，并對(duì)催化結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和比較。SDS-PAGE分析表達(dá)量的變化。本發(fā)明利用易錯(cuò)PCR技術(shù)和常規(guī)的突變體庫構(gòu)建技術(shù)，對(duì)來源于枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因進(jìn)行體外定向進(jìn)化，并在大腸桿菌中構(gòu)建突變體庫，篩選出一株酶活顯著提高的菌株，為堿性內(nèi)切葡聚糖酶的工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。


圖la :pMD19-T-Cen質(zhì)粒酶切電泳檢測泳道2、3依次為，Bgl Il.Sph I雙酶切后回收的pMD19-T載體，目的基因片段；圖Ib 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測泳道1為易錯(cuò)PCR后回收的目的基因片段。圖2 易錯(cuò)PCR產(chǎn)物、pET32a(+)質(zhì)粒酶切電泳檢測泳道1_2依次為易錯(cuò)PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，pET32a(+)質(zhì)粒雙酶切后回收；圖3 :目的克隆菌株8號(hào)為原始菌株，12號(hào)為篩選出來的突變菌株；圖如突變菌株質(zhì)粒酶切電泳檢測泳道1、2依次為，EcoR I、NotI，雙酶切，EcoR I單酶切；圖4b 突變前后核苷酸序列比對(duì)突變位點(diǎn)用黑色方框標(biāo)出圖如突變前后氨基酸序列比對(duì)突變位點(diǎn)用黑色方框標(biāo)出圖4d 突變酶和原始酶三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)突變酶212位天冬氨酸(ASP)突變?yōu)槔i氨酸(VAL)圖如=SDS-PAGE分析泳道1，2，3，4依次為轉(zhuǎn)入pET3h(+)空質(zhì)粒不含內(nèi)切葡聚糖酶基因的BL21菌株破壁產(chǎn)物，原始酶，突變酶。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但實(shí)施例不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中，所用的試驗(yàn)材料及其來源包括1、菌株和質(zhì)粒；大腸桿菌DH5a和BL21 (DE3)均為本實(shí)驗(yàn)室保存，含Cen基因的克隆載體 pMD19-T-Cen由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，大腸桿菌表達(dá)載體ρΕΤ3^ι(+)購自hvitrogen公司，內(nèi)切葡聚糖酶大腸桿菌工程菌PET-C36 (原始酶表達(dá)菌株)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。2、化學(xué)試劑和酶制劑；Bgl II>Sph I>EcoR I、Not I、氨芐青霉素、T4 DNA Ligase^Taq DNA Polymerase、 dNTP購自Takara Biotechnology, DNA Maker購自天根生化科技有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA。NaCl、Na0H、HCl、K2HPO4 · 3H20、KH2P04、MgCl2、MnCl2、冰乙酸、蛋白胨、酵母抽提物、 葡萄糖、瓊脂粉、甘油、瓊脂糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tris、十二烷基硫酸鈉(SDS)、考馬斯亮藍(lán)R250、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、N，N，N’ N’ -四甲基乙二胺(TEMED)等。3、引物合成；本發(fā)明涉及的引物由hvitrogen公司合成。下述實(shí)施例中常規(guī)的基因操作方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)。實(shí)施例1 突變內(nèi)切葡聚糖酶基因的獲得；(一 )實(shí)驗(yàn)方法
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1、突變模板的準(zhǔn)備接種一環(huán)含有pMD19-T_Cen質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α于IOmL LB (Amp)液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒提取試劑盒按說明提取pMD19-T-Cen質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒通過 BglII, Sph I雙酶切對(duì)其進(jìn)行檢測，檢測正確后作為易錯(cuò)PCR的模板。2、易錯(cuò)PCR方法易錯(cuò)PCR 體系中 Mg2+ 濃度為 7mmol/L，Mn2+ 濃度為 0. lmmol/L ；dCTP, dTTP 和 dATP， dGTP的比例為5 1。加樣完畢后混勻，然后進(jìn)入PCR循環(huán)。3、易錯(cuò)PCR突變，以pMD19-T-Cen質(zhì)粒作為模板，以Pl :5，TAATCCAACCCGGAATTCGCAGAGACAAAAACGCCAGTAGC-3，禾口P2 :5’ -FAGGAAAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAAA-3'作為引物進(jìn)行易錯(cuò)PCR，得到長度為1.4Kb左右的內(nèi)切葡聚糖酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物。 PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性％iin，94°C變性lmin，51°C退火lmin，72°C延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠純化試劑盒對(duì)易錯(cuò)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，取1 μ L回收產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測其含量。(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、培養(yǎng)含pMD19-T-Cen質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a并提取質(zhì)粒，通過Bgl II，Sph I雙酶切對(duì)其進(jìn)行了檢測，證明該質(zhì)粒含有內(nèi)切葡聚糖酶基因，可以作為內(nèi)切葡聚糖酶定向進(jìn)化的模板(圖la)。2、PCR循環(huán)完成后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠純化試劑盒對(duì)易錯(cuò)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收產(chǎn)物，得到大小約為1.4Kb的片段，此片段即為經(jīng)易錯(cuò)PCR突變后得到的內(nèi)切葡聚糖酶基因(圖lb)。實(shí)施例2 內(nèi)切葡聚糖酶大腸桿菌突變體庫的構(gòu)建(一 )實(shí)驗(yàn)方法1、突變內(nèi)切葡聚糖酶基因pET_32a(+)表達(dá)載體的構(gòu)建1)質(zhì)粒載體pET_32a(+)的準(zhǔn)備pET-32a(+)帶有T71ac啟動(dòng)子和氨芐青霉素抗性基因，培養(yǎng)含有pET_32a (+)質(zhì)粒的大腸桿菌DH5ci于IOmL LB (Amp)液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒提取試劑盒按說明書提取pET-32a(+)質(zhì)粒。2)易錯(cuò)PCR產(chǎn)物、pET-32a (+)質(zhì)粒的雙酶切處理分別取上述易錯(cuò)PCR產(chǎn)物(內(nèi)切葡聚糖酶基因)、pET_32a(+)質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I、 Not I雙酶切，酶切方法如下
IOxH buffer5μ LBSA5μ L
EcoR I1 μ L
權(quán)利要求
1.基于易錯(cuò)PCR技術(shù)提高內(nèi)切葡聚糖酶的活性的方法，其特征在于，包含以下步驟 Al，獲得突變內(nèi)切葡聚糖酶基因；突變模板的準(zhǔn)備接種一環(huán)含有pMD19-T-Cen(構(gòu)建載體酶切位點(diǎn)為Bgl II,Sph I)質(zhì)粒的大腸桿菌DH5ci于IOmL LB (Amp)液體培養(yǎng)基中37 °C 培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒提取試劑盒按說明提取pMD19-T-Cen質(zhì)粒；提取的質(zhì)粒通過Bgl II， Sph I雙酶切對(duì)其進(jìn)行檢測，檢測正確后作為易錯(cuò)PCR的模板；通過引物Pl :5’-TAATCCAAC CCGGAATTCGCAGAGACAAAMCGCCAGTAGC-3，P2 5，-TAGGMAGGAAAMAGCGGCCGCCTMTTTGGTTCTG TTCCCCAAA-3’進(jìn)行易錯(cuò)PCR ；反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用純化試劑盒對(duì)易錯(cuò)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化回收；A2，內(nèi)切葡聚糖酶大腸桿菌突變體庫的構(gòu)建；將步驟Al回收的所述易錯(cuò)PCR產(chǎn)物經(jīng) EcoR I、NotI雙酶切后，連接入經(jīng)過同樣EcoR I、NotI雙酶切的含有T71ac啟動(dòng)子和氨芐青霉素抗性基因的表達(dá)載體pET-32a(+)中；使用化學(xué)熱擊轉(zhuǎn)化的方法，將含有突變的內(nèi)切葡聚糖酶基因庫的表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE!3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布至LB(Amp)平板，即得構(gòu)建好的突變體庫；A3，高酶活菌株的篩選；將LB (Amp)平板上長出的菌落一一對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)入的LB (Amp)平板和 LB (Amp、IPTG、CMC-Na)平板上，轉(zhuǎn)板后將平板置37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，LB (Amp)平板培養(yǎng)他后取出放入4°C冰箱保存，LB(Amp、IPTG、CMC-Na)平板繼續(xù)培養(yǎng)36h，然后采用剛果紅染色法觀察水解圈的大小，同時(shí)每個(gè)平板分別以原始菌和不含有內(nèi)切葡聚糖酶基因的空載體作為陽性和陰性對(duì)照；根據(jù)水解圈的大小篩選出目的菌株，再對(duì)應(yīng)從LB(Amp)平板上找出目的克隆菌株；初篩出來的陽性克隆子，通過擴(kuò)大誘導(dǎo)培養(yǎng)，破壁后測定酶活。A4，高酶活菌株突變基因的分析復(fù)篩出來的酶活提高的菌株用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證導(dǎo)入基因的正確性，并挑取陽性菌株送hvitrogen公司測序；對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析，找出突變堿基位點(diǎn)和氨基酸位點(diǎn)，并對(duì)催化結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和比較；SDS-PAGE分析表達(dá)量的變化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟Al中的PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C 預(yù)變性％iin，94°C變性lmin，5rC退火lmin，72°C延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸10min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A2中的酶切方法如下
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A2中的大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備方法為將E. coli BL21劃線接種LB平板，37°C培養(yǎng)直至長出單菌落；挑取一個(gè)單菌落，接種至含有IOmL LB培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，37°C，170rpm培養(yǎng)過夜；將上述培養(yǎng)液按1 %接種量接種到50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C，170rpm振蕩培養(yǎng)1. 5-2小時(shí)；將培養(yǎng)后的菌液置冰浴中，使培養(yǎng)物冷卻到0°C，IOmin后轉(zhuǎn)移到無菌的50mL離心管中，4°C， 4300rpm離心5min，倒掉上清液；向管中加入30mL無菌預(yù)冷的0. lmol/L CaC12_MgC12溶液重新懸浮菌體，4°C，4300rpm離心8min，去掉上清液；向管中加入2mL無菌預(yù)冷的0. Imol/ LCaCl2溶液重新懸浮菌體，得到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A2中所述化學(xué)熱擊轉(zhuǎn)化的方法為取一支裝有100 μ L Ε. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞的Ep管，置冰浴中解凍；將所述過夜連接產(chǎn)物全部加入到上述Ep管中，并用加樣器輕輕混合均勻；將Ep管冰浴30min ；將Ep管放入 42°C恒溫水浴中熱擊90-120秒；迅速將Ep管置冰浴中靜置5min ；向Ep管中加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基置37°C搖床培養(yǎng)60min，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因；取培養(yǎng)后的菌液200 μ L用玻棒涂布在LB (Amp)平板上，將平板置37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)直至液體被吸收后，將平板倒置繼續(xù)培養(yǎng)12-1 后直至單個(gè)菌落出現(xiàn)，即為含有突變內(nèi)切葡聚糖酶基因Cerfp的突變體庫。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于易錯(cuò)PCR技術(shù)提高內(nèi)切葡聚糖酶的活性的方法，包括以下步驟A1，獲得突變內(nèi)切葡聚糖酶基因；A2，內(nèi)切葡聚糖酶大腸桿菌突變體庫的構(gòu)建；A3，高酶活菌株的篩選；A4，高酶活菌株突變基因的分析；實(shí)現(xiàn)了對(duì)來源于枯草芽孢桿菌C-36的內(nèi)切葡聚糖酶基因進(jìn)行體外定向進(jìn)化，并在大腸桿菌中構(gòu)建突變體庫，篩選出一株酶活顯著提高的菌株，為堿性內(nèi)切葡聚糖酶的工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102206659SQ20111008910
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日
發(fā)明者吳琦, 姚友旭, 廖 燕, 李春梅, 李雨霏, 阮景軍, 陳惠 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)