專利名稱：食源性致病菌檢測試劑盒及檢測方法
食源性致病菌檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種食源性致病菌檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
人類食用的食品種類繁多，通過食物所傳播的病原體也各種各樣，包括細(xì)菌、病毒、立克次體、產(chǎn)毒藻類、寄生蟲及蕈等大型真菌等不同種類。日常生活中，細(xì)菌，特別是食源性致病菌污染的食品的誤食用，導(dǎo)致的食品中毒事件最為常見。傳統(tǒng)的食源性致病菌的檢測，主要是采用細(xì)菌培養(yǎng)的方法，這種方法檢測結(jié)果較準(zhǔn)確，但是耗費(fèi)時間長，操作步驟繁瑣；此外，還可以采用實(shí)時熒光PCR法檢測，此方法特異性強(qiáng)，但是一次實(shí)驗只能檢測一種病原目標(biāo)物，同時檢測大量的病原菌則不能很好地應(yīng)付。 這兩種方法在檢測多種食源性致病菌時，往往都需要耗費(fèi)較長的時間，這也延誤了診斷和治療的最佳時機(jī)。

發(fā)明內(nèi)容基于此，有必要提供一種可以在短時間內(nèi)檢測多種食源性致病菌的食源性致病菌檢測試劑盒及采用上述食源性致病菌檢測試劑盒的食源性致病菌檢測方法。一種食源性致病菌檢測試劑盒，包括選自如下12組引物中的至少一組第1組引物用于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段；第2組引物用于擴(kuò)增沙門氏菌的如SEQ ID NO. 2所示的核酸片段；第3組引物用于擴(kuò)增大腸桿菌0157:H7的如SEQ ID NO. 3所示的核酸片段；第4組引物用于擴(kuò)增志賀桿菌的如SEQ ID NO. 4所示的核酸片段；第5組引物用于擴(kuò)增單增李斯特菌的如SEQ ID NO. 5所示的核酸片段；第6組引物用于擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌的如SEQ ID N0. 6所示的核酸片段；第7組引物用于擴(kuò)增小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的如SEQ ID N0. 7所示的核酸片段；第8組引物用于擴(kuò)增弧菌屬的如SEQ ID N0. 8所示的核酸片段；第9組引物用于擴(kuò)增副溶血弧菌的如SEQ ID N0. 9所示的核酸片段；第10組引物用于擴(kuò)增霍亂弧菌的如SEQ ID NO. 10所示的核酸片段；第11組引物用于擴(kuò)增梭狀芽孢桿菌屬的如SEQ ID NO. 11所示的核酸片段；第12組引物用于擴(kuò)增彎曲桿菌的如SEQ ID N0. 12所示的核酸片段。優(yōu)選的，所述第1組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 13所示，下游引物序列如 SEQ ID N0. 25 所示；所述第2組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 14所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 26所示；所述第3組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 15所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 27所示；
所述第4組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 16所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 28所示；所述第5組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 17所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 29所示；所述第6組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 18所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 30所示；所述第7組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 19所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 31所示；所述第8組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 20所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 32所示；所述第9組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 21所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 33所示；所述第10組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 22所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 34所示；所述第11組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 23所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 35所示；所述第12組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 24所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 36所示。優(yōu)選的，還包括探針，所述探針為如下12個與所述12組引物對應(yīng)的核酸片段至少一種第1個探針與如SEQ ID NO. 1所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0· 37 所示；第2個探針與如SEQ ID N0. 2所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 38 所示；第3個探針與如SEQ ID N0. 3所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 39 所示；第4個探針與如SEQ ID N0. 4所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 40 所示；第5個探針與如SEQ ID N0. 5所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 41 所示；第6個探針與如SEQ ID N0. 6所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 42 所示；第7個探針與如SEQ ID N0. 7所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 43 所示；第8個探針與如SEQ ID N0. 8所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 44 所示；第9個探針與如SEQ ID N0. 9所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 45 所示；第10個探針與如SEQ ID NO. 10所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQID N0. 46所示；第11個探針與如SEQ ID NO. 11所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 47 所示；第12個探針與如SEQ ID NO. 12所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQID NO. 48 所示。優(yōu)選的，還包括固相載體，所述固相載體包括基體和固定在所述基體上的附著層， 所述探針固定在所述附著層上。優(yōu)選的，所述探針的5'端連接有15個胸腺嘧啶。優(yōu)選的，還包括PCR陽性質(zhì)控探針、與所述PCR陽性質(zhì)控探針互補(bǔ)的PCR陽性檢測探針、用于擴(kuò)增所述PCR陽性檢測探針的PCR陽性檢測探針引物對、雜交陽性質(zhì)控探針以及與所述雜交陽性質(zhì)控探針互補(bǔ)的雜交陽性檢測探針；所述PCR陽性質(zhì)控探針序列如SEQ ID NO. 49所示，所述PCR陽性檢測探針的序列如SEQ ID NO. 50所示，所述PCR陽性檢測探針引物對的上游引物序列如SEQ ID N0. 51所示，所述PCR陽性檢測探針引物對的下游引物序列如SEQID N0. 52所示，所述雜交陽性質(zhì)控探針的序列如SEQ ID N0. 53所示，所述雜交陽性檢測探針的序列如SEQ ID N0. 54所示。一種食源性致病菌的檢測方法，包括下述步驟步驟一、提取待測樣品中的核酸；步驟二、擴(kuò)增待測樣品中的核酸得到核酸片段，所述核酸片段為如下核酸片段中的至少一種金黃色葡萄球菌的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段；沙門氏菌的如SEQ ID N0. 2所示的核酸片段；大腸桿菌0157 :H7的如SEQ ID N0. 3所示的核酸片段；志賀桿菌的如SEQ ID N0. 4所示的核酸片段；單增李斯特菌的如SEQ ID N0. 5所示的核酸片段；蠟樣芽孢桿菌的如SEQ ID N0. 6所示的核酸片段；小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的如SEQ ID N0. 7所示的核酸片段；弧菌屬的如SEQ ID N0. 8所示的核酸片段；副溶血弧菌的如SEQ ID N0. 9所示的核酸片段；霍亂弧菌的如SEQ ID NO. 10所示的核酸片段；梭狀芽孢桿菌屬的如SEQ ID NO. 11所示的核酸片段；彎曲桿菌的如SEQ ID N0. 12所示的核酸片段；步驟三、用探針進(jìn)行檢測，所述探針與步驟二中的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交。優(yōu)選的，步驟二使用如下12組寡核苷酸片段的至少一組作為引物進(jìn)行擴(kuò)增所述第1組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 13所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 25所示；所述第2組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 14所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 26所示；所述第3組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 15所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 27所示；
所述第4組引物上游引物序列如SEQID N。．16所示，下游引物序列如SEQIDN。．28所示；
所述第5組引物上游引物序列如SEQID N。．17所示，下游引物序列如SEQIDN。．29所示；
所述第6組引物上游引物序列如SEQID N。．18所示，下游引物序列如SEQIDN。．30所示；
所述第7組引物上游引物序列如SEQID N。．19所示，下游引物序列如SEQIDN。．3l所示；
所述第8組引物上游引物序列如SEQID N。．20所示，下游引物序列如SEQIDN。．32所示；
所述第9組引物上游引物序列如SEQID N。．2l所示，下游引物序列如SEQIDN。．33所示；
所述第lo組引物上游引物序列如SEQID N。．22所示，下游引物序列如SEQIDN。．34所示；
所述第11組引物上游引物序列如SEQID N。．23所示，下游引物序列如SEQIDN。．35所示；
所述第12組引物上游引物序列如SEQID N。．24所示，下游引物序列如SEQIDN。．36所示。
優(yōu)選的，步驟三中所述探針為具有如下序列的12個核酸片斷中的至少一個
第1個探針與如SEQID N。．1所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDNO．37所示；
第2個探針與如SEQID N。．2所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDNO．38所示；
第3個探針與如SEQID N。．3所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDNO．39所示；
第5個探針與如SEQID N。．5所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDNO．41所示；
第6個探針與如SEQID NO．6所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDNO．42所示；
第7個探針與如SEQID N。．7所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDNO．43所示；
第8個探針與如SEQID N。．8所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDNO．44所示；
第9個探針與如SEQID NO．9所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDNO．45所示；
第lo個探針與如SEQID N。．10所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQID NO．46所示；
第11個探針與如SEQ ID NO. 11所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 47 所示；第12個探針與如SEQ ID NO. 12所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQID NO. 48 所示。優(yōu)選的，步驟三中所述探針與所述擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交在固相載體上進(jìn)行；所述固相載體包括基體和固定在所述基體上的附著層，所述探針固定在所述附著層上。根據(jù)多種食源性致病菌的基因保守區(qū)設(shè)計PCR擴(kuò)增引物和探針，提取待測樣品中的核酸片段并通過PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，最后使用探針與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性結(jié)合， 檢測樣品中是否含有待檢測的12種食源性致病菌中一種或幾種，這種檢測方法通量高、快速、靈敏以及特異性強(qiáng)。

圖1為一實(shí)施方式的食源性致病菌的檢測方法的流程圖；圖2為一實(shí)施方式的食源性致病菌的檢測點(diǎn)陣示意圖；圖3為圖2示檢測點(diǎn)陣檢測梭狀芽孢桿菌屬的檢測結(jié)果示意圖；圖4為圖2示檢測點(diǎn)陣檢測梭狀芽孢桿菌屬和弧菌屬的檢測結(jié)果示意圖；圖5為圖2示檢測點(diǎn)陣檢測弧菌屬、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌0157:H7的檢測結(jié)果示意圖；圖6為圖2示檢測點(diǎn)陣檢測沙門氏菌、副溶血弧菌、弧菌屬和大腸桿菌0157:H7的檢測結(jié)果示意圖；圖7為圖2示檢測點(diǎn)陣檢測彎曲桿菌、沙門氏菌、梭狀芽孢桿菌屬、弧菌屬和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施方式下面主要結(jié)合附圖和實(shí)施例對食源性致病菌檢測試劑盒及檢測方法做進(jìn)一步的解釋說明。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1設(shè)計和制備引物、探針通過對常見的12種食源性致病菌基因序列進(jìn)行分析，選擇相對保守的序列為靶向擴(kuò)增序列，并根據(jù)該靶向擴(kuò)增序列設(shè)計用于擴(kuò)增該靶向擴(kuò)增序列的PCR擴(kuò)增引物和與該靶向擴(kuò)增序列特異性結(jié)合的探針。12個靶向擴(kuò)增序列及其對應(yīng)的12組PCR擴(kuò)增引物和12個探針如下所示第1個靶向擴(kuò)增序列為金黃色葡萄球菌的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段，對應(yīng)的上游引物序列如SEQ ID NO. 13所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 25所示，探針序列如 SEQ ID N0. 37 所示。第2個靶向擴(kuò)增序列為沙門氏菌的如SEQ ID N0. 2所示的核酸片段，對應(yīng)的上游引物序列如SEQ ID NO. 14所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 26所示，探針序列如SEQ ID NO. 38所示。第3個靶向擴(kuò)增序列為大腸桿菌0157:H7的如SEQ ID NO. 3所示的核酸片段，對應(yīng)的上游引物序列如SEQ ID NO. 15所示，下游引物序列如SEQ IDN0. 27所示，探針序列如 SEQ ID NO. 39 所示。第4個靶向擴(kuò)增序列為志賀桿菌的如SEQ ID N0. 4所示的核酸片段，對應(yīng)的上游引物序列如SEQ ID N0. 16所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 28所示，探針序列如SEQ ID N0. 40所示。第5個靶向擴(kuò)增序列為單增李斯特菌的如SEQ ID N0. 5所示的核酸片段，對應(yīng)的上游引物序列如SEQ ID N0. 17所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 29所示，探針序列如SEQ ID N0. 41 所示。第6個靶向擴(kuò)增序列為蠟樣芽孢桿菌的如SEQ ID N0. 6所示的核酸片段，對應(yīng)的上游引物序列如SEQ ID N0. 18所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 30所示，探針序列如SEQ ID N0. 42 所示。第7個靶向擴(kuò)增序列為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的如SEQ ID N0. 7所示的核酸片段，對應(yīng)的上游引物序列如SEQ ID N0. 19所示，下游引物序列如SEQ IDN0. 31所示，探針序列如SEQ ID N0. 43所示。第8個靶向擴(kuò)增序列為弧菌屬的如SEQ ID N0. 8所示的核酸片段，對應(yīng)的上游引物序列如SEQ ID N0. 20所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 32所示，探針序列如SEQ ID N0. 44所示。第9個靶向擴(kuò)增序列為副溶血弧菌的如SEQ ID N0. 9所示的核酸片段，對應(yīng)的上游引物序列如SEQ ID N0. 21所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 33所示，探針序列如SEQ ID N0. 45所示。第10個靶向擴(kuò)增序列為霍亂弧菌的如SEQ ID NO. 10所示的核酸片段，對應(yīng)的上游引物序列如SEQ ID N0. 22所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 34所示，探針序列如SEQ ID N0. 46所示。第11個靶向擴(kuò)增序列為梭狀芽孢桿菌屬的如SEQ ID NO. 11所示的核酸片段，對應(yīng)的上游引物序列如SEQ ID N0. 23所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 35所示，探針序列如 SEQ ID N0. 47 所示。第12個靶向擴(kuò)增序列為彎曲桿菌的如SEQ ID N0. 12所示的核酸片段，對應(yīng)的上游引物序列如SEQ ID N0. 24所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 36所示，探針序列如SEQ ID N0. 48所示。12個下游引物5'端標(biāo)記有生物素，用于后續(xù)的呈色反應(yīng)。12個檢測探針5'端連接有15個胸腺嘧啶(T)，使得檢測探針能夠更好的伸展開來，有利于檢測探針和擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交。上述引物和探針通過廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司合成。實(shí)施例2 食源性致病菌檢測試劑盒及檢測方法
檢測試劑盒包括上述12組引物和12個探針。
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在優(yōu)選的實(shí)施例中，檢測試劑盒還包括PCR陽性質(zhì)控探針、與PCR陽性質(zhì)控探針互補(bǔ)的PCR陽性檢測探針、用于擴(kuò)增PCR陽性檢測探針的PCR陽性檢測探針引物對、雜交陽性質(zhì)控探針以及與雜交陽性質(zhì)控探針互補(bǔ)的雜交陽性檢測探針。PCR陽性質(zhì)控探針序列如SEQ ID NO. 49所示，PCR陽性檢測探針的序列如SEQ ID NO. 50所示，PCR陽性檢測探針引物對的上游引物序列如SEQ IDN0. 51所示，PCR陽性檢測探針引物對的下游引物序列如SEQ ID NO. 52所示，雜交陽性質(zhì)控探針的序列如SEQ ID NO. 53 所示，雜交陽性檢測探針的序列如SEQ ID NO. 54所示。PCR陽性檢測探針引物對的下游引物和雜交陽性檢測探針5'端標(biāo)記有生物素， 用于后續(xù)的呈色反應(yīng)。PCR陽性質(zhì)控探針和雜交陽性質(zhì)控探針5'端連接有15個胸腺嘧啶(T)，使得探針在96微孔板表面能夠更好的伸展開來，有利于探針和擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交。如圖1所示的食源性致病菌的檢測方法包括如下步驟S10、提取待測樣品中的核酸根據(jù)檢測樣品的不同，待測微生物培養(yǎng)擴(kuò)增操作具體如下若是固態(tài)檢體，先適當(dāng)切碎、混合均勻后，取25g添加到已滅菌的培養(yǎng)基，充分混合后進(jìn)行培養(yǎng)。若是粉狀、粒狀或其它易于粉碎的檢體，可用已滅菌的藥勺或其它方便使用的工具加以粉碎，并取25g添加到已滅菌的培養(yǎng)基，充分混合后進(jìn)行培養(yǎng)。若是液態(tài)檢體，可用振搖方式，使充分混合均勻后，取25g添加到已滅菌的培養(yǎng)基，充分混合后進(jìn)行培養(yǎng)。若是冷凍檢體，需解凍者，最好放置于冷藏溫度下解凍，待檢體解凍后，再予以適當(dāng)切碎、混合均勻后，取25g添加到已滅菌的培養(yǎng)基，充分混合后進(jìn)行培養(yǎng)。若是凝態(tài)或濃稠液態(tài)檢體，經(jīng)適當(dāng)攪拌均勻后，取25g添加到已滅菌的培養(yǎng)基，充分混合后進(jìn)行培養(yǎng)。參照 FDA(Food Sampling and Preparation of Sample Homogenate， BacterialAnalytical Manual Online，Chapter 1，http://www. cfsan. fda. gov/ ebam/
bam-l. html)，不同病原菌采用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件如下
權(quán)利要求
1.一種食源性致病菌檢測試劑盒，其特征在于，包括選自如下12組引物中的至少一組第1組引物用于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段； 第2組引物用于擴(kuò)增沙門氏菌的如SEQ ID NO. 2所示的核酸片段； 第3組引物用于擴(kuò)增大腸桿菌0157:H7的如SEQ ID NO. 3所示的核酸片段； 第4組引物用于擴(kuò)增志賀桿菌的如SEQ ID NO. 4所示的核酸片段； 第5組引物用于擴(kuò)增單增李斯特菌的如SEQ ID NO. 5所示的核酸片段； 第6組引物用于擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌的如SEQ ID NO. 6所示的核酸片段； 第7組引物用于擴(kuò)增小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的如SEQ ID NO. 7所示的核酸片段； 第8組引物用于擴(kuò)增弧菌屬的如SEQ ID NO. 8所示的核酸片段； 第9組引物用于擴(kuò)增副溶血弧菌的如SEQ ID NO. 9所示的核酸片段； 第10組引物用于擴(kuò)增霍亂弧菌的如SEQ ID NO. 10所示的核酸片段； 第11組引物用于擴(kuò)增梭狀芽孢桿菌屬的如SEQ ID NO. 11所示的核酸片段； 第12組引物用于擴(kuò)增彎曲桿菌的如SEQ ID NO. 12所示的核酸片段。
2.如權(quán)利要求1所述的食源性致病菌檢測試劑盒，其特征在于，所述第1組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 13所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 25 所示；所述第2組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 14所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 26 所示；所述第3組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 15所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 27 所示；所述第4組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 16所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 28 所示；所述第5組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 17所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 29 所示；所述第6組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 18所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 30 所示；所述第7組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 19所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 31 所示；所述第8組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 20所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 32 所示；所述第9組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 21所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 33 所示；所述第10組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 22所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 34 所示；所述第11組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 23所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 35 所示；所述第12組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 24所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 36 所示。
3.如權(quán)利要求1或2所述的食源性致病菌檢測試劑盒，其特征在于，還包括探針，所述探針為如下12個與所述12組引物對應(yīng)的核酸片段中的至少一個第1個探針與如SEQ ID NO. 1所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 37所示; 第2個探針與如SEQ ID NO. 2所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 38所示; 第3個探針與如SEQ ID NO. 3所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 39所示; 第4個探針與如SEQ ID NO. 4所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 40所示; 第5個探針與如SEQ ID NO. 5所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 41所示; 第6個探針與如SEQ ID NO. 6所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 42所示; 第7個探針與如SEQ ID NO. 7所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 43所示; 第8個探針與如SEQ ID NO. 8所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 44所示; 第9個探針與如SEQ ID NO. 9所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 45所示； 第10個探針與如SEQ ID NO. 10所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQID NO. 46所示；第11個探針與如SEQ ID NO. 11所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 47所示；第12個探針與如SEQ ID NO. 12所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQID NO. 48所
4.如權(quán)利要求3所述的食源性致病菌檢測試劑盒，其特征在于，還包括固相載體，所述固相載體包括基體和固定在所述基體上的附著層，所述探針固定在所述附著層上。
5.如權(quán)利要求3所述的食源性致病菌檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測探針的5'端連接有15個胸腺嘧啶。
6.如權(quán)利要求1所述的食源性致病菌檢測試劑盒，其特征在于，還包括PCR陽性質(zhì)控探針、與所述PCR陽性質(zhì)控探針互補(bǔ)的PCR陽性檢測探針、用于擴(kuò)增所述PCR陽性檢測探針的PCR陽性檢測探針引物對、雜交陽性質(zhì)控探針以及與所述雜交陽性質(zhì)控探針互補(bǔ)的雜交陽性檢測探針；所述PCR陽性質(zhì)控探針序列如SEQ ID NO. 49所示，所述PCR陽性檢測探針的序列如 SEQ ID NO. 50所示，所述PCR陽性檢測探針引物對的上游引物序列如SEQ ID N0. 51所示， 所述PCR陽性檢測探針引物對的下游引物序列如SEQID N0. 52所示，所述雜交陽性質(zhì)控探針的序列如SEQ ID N0. 53所示，所述雜交陽性檢測探針的序列如SEQ ID N0. 54所示。
7.一種食源性致病菌的檢測方法，其特征在于，包括下述步驟 步驟一、提取待測樣品中的核酸；步驟二、擴(kuò)增待測樣品中的核酸得到核酸片段，所述核酸片段為如下核酸片段中的至少一種金黃色葡萄球菌的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段； 沙門氏菌的如SEQ ID N0. 2所示的核酸片段； 大腸桿菌0157:H7的如SEQ ID N0. 3所示的核酸片段； 志賀桿菌的如SEQ ID N0. 4所示的核酸片段； 單增李斯特菌的如SEQ ID N0. 5所示的核酸片段； 蠟樣芽孢桿菌的如SEQ ID N0. 6所示的核酸片段；小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的如SEQ ID NO. 7所示的核酸片段；弧菌屬的如SEQ ID NO. 8所示的核酸片段；副溶血弧菌的如SEQ ID NO. 9所示的核酸片段；霍亂弧菌的如SEQ ID NO. 10所示的核酸片段；梭狀芽孢桿菌屬的如SEQ ID NO. 11所示的核酸片段；彎曲桿菌的如SEQ ID NO. 12所示的核酸片段；步驟三、用探針進(jìn)行檢測，所述探針與步驟二中的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交。
8.如權(quán)利要求7所述的食源性致病菌的檢測方法，其特征在于，步驟二使用如下12組寡核苷酸片段的至少一組作為引物進(jìn)行擴(kuò)增所述第1組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 13所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 25 所示；所述第2組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 14所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 26 所示；所述第3組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 15所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 27 所示；所述第4組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 16所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 28 所示；所述第5組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 17所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 29 所示；所述第6組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 18所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 30 所示；所述第7組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 19所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 31 所示；所述第8組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 20所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 32 所示；所述第9組引物上游引物序列如SEQ ID NO. 21所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 33 所示；所述第10組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 22所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 34 所示；所述第11組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 23所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 35 所示；所述第12組引物上游引物序列如SEQ ID N0. 24所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 36 所示。
9.如權(quán)利要求7所述的食源性致病菌的檢測方法，其特征在于，步驟三中所述探針為具有如下序列的12個核酸片斷中的至少一個第1個探針與如SEQ ID NO. 1所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 37所示;第2個探針與如SEQ ID N0. 2所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 38所示;第3個探針與如SEQ ID N0. 3所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 39所示;第4個探針與如SEQ ID N0. 4所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 40所示;第5個探針與如SEQ ID NO. 5所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 41所示第6個探針與如SEQ ID NO. 6所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 42所示第7個探針與如SEQ ID NO. 7所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 43所示第8個探針與如SEQ ID NO. 8所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 44所示第9個探針與如SEQ ID NO. 9所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 45所示第10個探針與如SEQ ID NO. 10所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQID NO. 46所示；第11個探針與如SEQ ID NO. 11所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQ IDN0. 47所示；第12個探針與如SEQ ID NO. 12所示的核酸片斷特異性結(jié)合，序列如SEQID NO. 48所示
10.如權(quán)利要求7 9中任一項所述的食源性致病菌的檢測方法，其特征在于，步驟三中所述探針與所述擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交在固相載體上進(jìn)行；所述固相載體包括基體和固定在所述基體上的附著層，所述探針固定在所述附著層上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種食源性致病菌檢測試劑盒，所述試劑盒包含12組引物及其探針，所述引物中，下游引物5′端均以生物素標(biāo)記。所述試劑盒利用引物對待測樣品中核酸進(jìn)行擴(kuò)增，形成的生物素化產(chǎn)物與固定于芯片表面的探針雜交形成探針-生物素化產(chǎn)物復(fù)合物。堿性磷酸酶-鏈霉親和素偶聯(lián)物與探針-生物素化產(chǎn)物復(fù)合物結(jié)合，再利用顯色底物四唑硝基藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(NBT/BCIP)與堿性磷酸酶發(fā)生呈色(藍(lán)紫色)反應(yīng)。通過判讀在特定位點(diǎn)是否呈色，來檢測樣品中是否含有待檢測的致病菌。該試劑盒檢測通量高、快速、靈敏以及特異性強(qiáng)，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。本發(fā)明還提供一種采用上述檢測試劑盒的食源性致病菌檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK102181545SQ20111009003
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日 公開號201110090034.0
發(fā)明者劉春曉, 史蕾, 孫杰, 莊衛(wèi)東, 張巍, 徐云慶, 李永進(jìn), 楊澤, 楊燕秋, 莫秋華, 趙純中, 趙芳, 顧大勇 申請人:深圳博爾美生物科技有限公司, 深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心