專利名稱：一種基于恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)診斷結(jié)核病的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)診斷結(jié)核病的試劑盒。
背景技術(shù)：
分枝桿菌屬(Mycobacterium)是一類細(xì)長(zhǎng)略彎曲的微生物,有時(shí)有分枝或出現(xiàn)絲狀體。本屬細(xì)菌的主要特點(diǎn)是細(xì)胞壁含有大量 脂質(zhì)，主要是分枝菌酸。這和其染色性、生長(zhǎng)特性、致病性、抵抗力等密切相關(guān)。一般不易著色，若經(jīng)加溫或延長(zhǎng)染色時(shí)間而著色后能抵抗強(qiáng)脫色劑鹽酸乙醇的脫色，故又稱抗酸桿菌(acid-fast bacilli)。該菌屬無(wú)鞭毛、無(wú)芽胞、不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素，其致病性和菌體成分有關(guān)。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽腫。分枝桿菌屬種類較多，其中的致病菌主要有M. tuberculosis、M. bovis、M. africanum和M. microti,稱為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,是結(jié)核病的病原菌。目前結(jié)核病的診斷還存在很多問(wèn)題。痰涂片抗酸染色在肺結(jié)核診斷上有比較高的特異性，但敏感性低，約為15^-30 ^結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)需要2-6周，技術(shù)較復(fù)雜、費(fèi)用高、時(shí)間長(zhǎng)。X線檢查在結(jié)核病的診斷上有比較重要的參考價(jià)值，但通常而言缺乏特異性，在很多情況下與其他疾病的鑒別診斷比較困難，特別是不典型病變。血清學(xué)診斷方法(如ELISA)具有簡(jiǎn)單快速的優(yōu)點(diǎn)，易于推廣應(yīng)用，是目前研究比較多的結(jié)核病診斷方法之一，但該方法在結(jié)核病診斷的特異性和敏感性方面還有待提高。對(duì)血清學(xué)診斷方法的系統(tǒng)分析顯示，現(xiàn)有商品化血清學(xué)試劑診斷肺結(jié)核的敏感性在10%到90%之間，特異性介于47%至100% ;菌陽(yáng)病人診斷的敏感性和特異性明顯高于菌陰患者；肺外結(jié)核診斷的敏感性在0%到100%之間，特異性為59% -100%;說(shuō)明這些血清學(xué)診斷試劑對(duì)肺結(jié)核，特別是肺外結(jié)核的診斷價(jià)值有限?；诩?xì)胞免疫反應(yīng)的ELISPOT(enzyme-linked immunospot assay)主要通過(guò)檢測(cè)抗原誘導(dǎo)的IFN-Y分泌來(lái)診斷結(jié)核病及潛伏感染，同以往方法相比具有較好的特異性和敏感性。但該方法基于單一細(xì)胞因子的分泌，受影響因素比較多，有報(bào)道顯示，其診斷活動(dòng)性結(jié)核病的敏感性只有64%。突光實(shí)時(shí)定量PCR (polymerase chain reaction)技術(shù)雖然在結(jié)核病診斷上具有較高的敏感性和特異性，但需要專用設(shè)備，費(fèi)用高，使用受到很大限制。環(huán)介導(dǎo)基因恒溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技術(shù)是一種新型恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)敏感性和特異性高，而且擴(kuò)增只需單一的恒定溫度，可以在簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)條件下開(kāi)展，不需要專門(mén)的擴(kuò)增和檢測(cè)儀器，具有比常規(guī)PCR技術(shù)更廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)診斷結(jié)核病的試劑盒。本發(fā)明提供了一種輔助鑒定致病性分枝桿菌的專用引物，由序列表的序列I所示DNA(IS1081-F3)、序列表的序列2所示DNA (IS1081-B3)、序列表的序列3所示DNA(IS1081-FIP)和序列表的序列4所示DNA組成(IS1081-BIP)。所述致病性分枝桿菌可為M. tuberculosis (如 ATCC 27294)、M. bovis (如ATCC19210)、Mafricanum(如 ATCC 25420)和 M. microti (如 ATCC 19422)中的一種或幾種。M.為 Mycobacterium 的縮寫(xiě)。M. tuberculosis、M. bovis、M. africanum 和 M. microti,稱為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，是結(jié)核病的病原菌。所述專用引物可用于制備如下(a)和/或(b)和/或(C)(a)輔助鑒定致病性分枝桿菌的試劑盒；(b)輔助鑒定肺結(jié)核患者的試劑盒；
(c)輔助鑒定結(jié)核性胸膜炎患者的試劑盒。所述致病性分枝桿菌可為M. tuberculosis (如 ATCC 27294)、M. bovis (如ATCC19210)、Mafricanum(如 ATCC 25420)和 M. microti (如 ATCC 19422)中的一種或幾種。本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，含有所述專用引物；所述試劑盒的功能為如下(a)和/或(b)和/或(C)(a)輔助鑒定致病性分枝桿菌；(b)輔助鑒定肺結(jié)核患者；(c)輔助鑒定結(jié)核性胸膜炎患者。所述致病性分枝桿菌可為M. tuberculosis (如 ATCC 27294)、M. bovis (如ATCC19210)、Mafricanum(如 ATCC 25420)和 M. microti (如 ATCC 19422)中的一種或幾種。所述專用弓I物可用于輔助鑒定致病性分枝桿菌。所述致病性分枝桿菌可為M. tuberculosis (如 ATCC 27294)、M. bovis (如ATCC19210)、Mafricanum(如 ATCC 25420)和 M. microti (如 ATCC 19422)中的一種或幾種。為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每次最好設(shè)立陰性對(duì)照(不含結(jié)核分枝桿菌核酸的液體，如無(wú)菌超純水或TE緩沖液)和陽(yáng)性對(duì)照(結(jié)核分枝桿菌核酸，或確定含有結(jié)核分枝桿菌的樣本)。應(yīng)用所述專用引物輔助鑒定致病性分枝桿菌、輔助鑒定肺結(jié)核患者或輔助鑒定結(jié)核性胸膜炎患者時(shí)，可采用以下方法以待測(cè)樣本的基因組DNA為模板，用所述專用引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)基因恒溫?cái)U(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增情況輔助鑒定。所述環(huán)介導(dǎo)基因恒溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中，所述IS1081-F3的濃度可為0. 2iimol，所述IS1081-B3的濃度可為0. 2iimol，所述IS1081-FIP的濃度可為I. 6 y mol，所述IS1081-BIP 的濃度可為 I. 6 umol o25 ii I所述環(huán)介導(dǎo)基因恒溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系具體可為含12. 5 ii I 2XLAMPreactionbuffer(Eiken Chemical, Tochigi, Japan), I U I Bst DNA 聚合酶(RikenChemical, Tochigi, Japan), I U I Fluorescent Detection Reagent (Eiken Chemical,Tochigi, Japan) ,0. 2umol IS1081_F3、0. 2 y mol IS1081-B3U. 6 u mol IS1081-FIP、I. 6iimolIS1081-BIP 和 I u I 基因組 DNA，其余為水。
所述環(huán)介導(dǎo)基因恒溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件具體可為65°C恒溫孵育60分鐘至90分鐘。為了防止實(shí)驗(yàn)室LAMP反應(yīng)交叉污染，LAMP反應(yīng)完成后不要開(kāi)蓋。本發(fā)明建立了基于結(jié)核分枝桿菌IS1081基因的環(huán)介導(dǎo)基因恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒，該試劑盒靈敏度高、特異性強(qiáng)，且操作簡(jiǎn)便、所需設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉，可用于檢測(cè)致病性分枝桿菌，進(jìn)而輔助結(jié)核病診斷，具有重大應(yīng)用前景。


圖I為IS1081基因部分序列及環(huán)介導(dǎo)基因恒溫?cái)U(kuò)增引物所在的位點(diǎn)。圖2為環(huán)介導(dǎo)基因恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果(濁度觀察)；各反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的LAMP反應(yīng)體系中分別含有l(wèi)ng、100pg、10pg、lpg、IOOfgUOfg結(jié)核分枝桿菌基因組DNA ;NC代表陰性對(duì)照； PC代表陽(yáng)性對(duì)照。圖3為環(huán)介導(dǎo)基因恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果(熒光觀察);各反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的LAMP反應(yīng)體系中分別含有l(wèi)ng、100pg、10pg、lpg、IOOfgUOfg結(jié)核分枝桿菌基因組DNA ;NC代表陰性對(duì)照；PC代表陽(yáng)性對(duì)照。圖4為環(huán)介導(dǎo)基因恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果(瓊脂糖凝膠電泳觀察)；各泳道對(duì)應(yīng)的LAMP反應(yīng)體系中分別含有l(wèi)ng、lOOpg、10pg、lpg、lOOfg、IOfg結(jié)核分枝桿菌基因組DNA ；NC代表陰性對(duì)照；PC代表陽(yáng)性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。敏感性確診為肺結(jié)核的病人中，LMAP檢測(cè)為陽(yáng)性的病人所占的比例。特異性LMAP檢測(cè)為陽(yáng)性的病人中，確診為肺結(jié)核的病人所占的比例。實(shí)施例I、專用引物的制備合成表I所示的各條引物。專用引物由四條引物(IS1081-F3、IS1081-B3、IS10811-FIP、IS1081-BIP)組成。IS1081-F3、IS1081-B3、IS1081-FIP、IS1081-BIP 的核苷酸序列見(jiàn)表I。表I專用引物中的各條引物的核苷酸序列
引物名稱I引物序列(5’ -3’ )
~IS1081-F3(序列表的序列 I)TCTCATCTTATCGACGCCGA
~IS1081-B3(序列表的序列 2)CGGGTGTCGAAATCACGGT
~IS1081-FIP(序列表的序列 3)GGCGATGAACGTCGAGAGCAGCAGCTTCTGGCTGACCM
~IS1081-BIP(序列表的序列 4)TTGATGGGGGCTGAAGCCGATTGCGCTGATTGGACCG結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株IS1081轉(zhuǎn)座酶基因序列(GenBank BX842575)如序列表的序列5所示，引物所在位點(diǎn)見(jiàn)圖I。專用引物擴(kuò)增IS1801靶基因的部分片段(203bp)。實(shí)施例2、專用引物檢測(cè)致病性分枝桿菌的靈敏度和特異性待測(cè)樣本分別為20種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和3株非分枝桿菌對(duì)照株(見(jiàn)表2)。ATCC即美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection),網(wǎng)址為 http://www.atcc. org/0將待測(cè)樣本分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)I、提取基因組DNA將待測(cè)樣本無(wú)菌處理后加入含5mg/ml溶菌酶的TE緩沖液，37°C過(guò)夜孵育；然后加入蛋白酶A(終濃度為2mg/ml)和SDS (終濃度為1% ;質(zhì)量百分含量)，56°C水浴鍋過(guò)夜孵育；然后采用酚-氯仿法提取基因組DNA，溶于IOmM Tris-HCl緩沖液，_20°C凍存?zhèn)溆谩?2、環(huán)介導(dǎo)基因恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)LAMP 反應(yīng)體系(25 U I)含 12. 5 U I 2 X LAMP reaction buffer (EikenChemical, Tochigi, Japan), I U I Bst DNA 聚合酶(Eiken Chemical, Tochigi,Japan), Iy IFluorescent Detection Reagent(Eiken Chemical, Tochigi, Japan),0. 2 u molIS1081-F3,0. 2 u mo I IS1081-B3U. 6 u mol IS1081-FIPU. 6 u mol IS1081-BIP和I ill基因組DNA，其余為水；采用I ill IOmM Tris-HCl緩沖液作為基因組DNA的陰性對(duì)照;采用lng M. tuberculosis (ATCC 27294)的基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。將含有LAMP反應(yīng)體系的反應(yīng)管在65°C恒溫孵育60分鐘后，在日光下觀察反應(yīng)管內(nèi)液體的濁度，在365nm紫外燈下觀察反應(yīng)管內(nèi)液體的熒光，并用I. 5%瓊脂糖電泳分析 DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明只有 M. tuberculosis (ATCC 27294)、M. bovis (ATCC19210)、M. africanum (ATCC 25420)、M. microti (ATCC 19422)四種致病性分枝桿菌反應(yīng)管內(nèi)的液體在日光下能觀察到渾濁，在紫外燈下有熒光顯示，瓊脂糖電泳可見(jiàn)擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物；其他分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和3株其他細(xì)菌的反應(yīng)管內(nèi)的液體在日光下均不能觀察到渾濁，且在紫外燈下均沒(méi)有熒光顯示。結(jié)果見(jiàn)表2 (反應(yīng)體系中含有Ing基因組DNA)。M. tuberculosis (ATCC 27294)的池度觀察見(jiàn)圖2,陽(yáng)性對(duì)照管和加入Ing至Ipg結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的LAMP反應(yīng)管均可見(jiàn)沉淀所致混濁。M. tuberculosis (ATCC 27294)的突光觀察見(jiàn)圖3,陽(yáng)性對(duì)照管和加入Ing至Ipg結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的LAMP反應(yīng)管均可見(jiàn)熒光。M. tuberculosis (ATCC 27294)的瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖4，陽(yáng)性對(duì)照管和加入Ing至IOOfg結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的LAMP反應(yīng)管均可見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR將步驟I得到的基因組DNA分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，作為步驟2的驗(yàn)證。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的引物對(duì)如下5’ -CTGCGCGGGCTGCTCTC-3’ ；5’ -TAGCCGTTGCGCTGATTGG-3’ ；熒光探針5’-CGCTCATCGCTGCGITCGCGGT-3’。結(jié)果見(jiàn)表2 (反應(yīng)體系中含有Ing基因組DNA)。表2專用引物檢測(cè)致病性分枝桿菌的特異性檢測(cè)結(jié)果(M.為Mycobacterium的縮寫(xiě))

權(quán)利要求
1.一種輔助鑒定致病性分枝桿菌的專用引物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。
2.如權(quán)利要求I所述的專用引物，其特征在于所述致病性分枝桿菌為Mycobacteriumtuberculosis、Mycobacterium bovis、Mycobacterium africanum 和 Mycobacteriummicroti中的一種或幾種。
3.權(quán)利要求I所述的專用引物在制備如下(a)和/或(b)和/或(C)中的應(yīng)用 (a)輔助鑒定致病性分枝桿菌的試劑盒； (b)輔助鑒定肺結(jié)核患者的試劑盒； (C)輔助鑒定結(jié)核性胸膜炎患者的試劑盒。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其特征在于:所述至文病性分枝桿菌為Mycobacteriumtuberculosis>Mycobacterium bovis、Mycobacterium africanum 和 Mycobacteriunmicroti 中的一種iJUL種。
5.一種試劑盒，含有權(quán)利要求I所述的專用引物；所述試劑盒的功能為如下(a)和/或(b)和 / 或(C): (a)輔助鑒定致病性分枝桿菌； (b)輔助鑒定肺結(jié)核患者； (C)輔助鑒定結(jié)核性胸膜炎患者。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒,其特征在于:Mycobacteriumtuberculosis ^Mycobacteriumbovis、Mycobacterium africanum 和 Mycobacterium microti 中的一種或幾種。
7.權(quán)利要求I所述專用引物在輔助鑒定致病性分枝桿菌中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述至文病性分枝桿菌為Mycobacteriumtuberculosis>Mycobacterium bovis、Mycobacterium africanum 和 Mycobacteriunmicroti 中的一種iJUL種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)診斷結(jié)核病的試劑盒。本發(fā)明提供了一種輔助鑒定致病性分枝桿菌的專用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。本發(fā)明還保護(hù)含有所述專用引物的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒靈敏度高、特異性強(qiáng)，且操作簡(jiǎn)便、所需設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉，可用于檢測(cè)致病性分枝桿菌，進(jìn)而輔助結(jié)核病診斷，具有重大應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102732601SQ201110092140
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者楊秉芬, 程小星 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三〇九醫(yī)院