專(zhuān)利名稱(chēng)：基于小麥est序列的黑麥1r～7r染色體特異的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及基于小麥表達(dá)序列標(biāo)簽 (expressed sequence tag, EST)序列設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記，以及這些分子標(biāo)記在跟蹤檢測(cè)黑麥染色體方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥的近緣種黑麥cereale L.)具有許多優(yōu)良的性狀，如根系發(fā)達(dá)、分蘗強(qiáng)、抗旱、耐瘠薄、耐寒、耐鹽堿和酸性土壤，尤其是抗多種病害，如小麥白粉病 graminis f. sp. tri tici ) > ^r M {Puccinia graminis f. sp. triiici )、口十繡病(/"· triticina Eriks.)、禾干繡病(/"· graminis Pers. f. sp. triiici )、月星黑種病(Tilletia Controversa Kuhn, TCK)和大麥黃矮病(Barley yellow dwarf virus, BYDV)等。因此，黑麥?zhǔn)菍?duì)小麥進(jìn)行遺傳改良，拓寬小麥遺傳基礎(chǔ)，增加小麥栽培品種遺傳變異的重要基因源。黑麥中優(yōu)異基因向小麥中轉(zhuǎn)移的途徑主要是創(chuàng)制一系列小麥/黑麥雙二倍體、附加系、代換系和易位系。通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交和染色體工程等手段將黑麥染色體導(dǎo)入到小麥背景中，之后，還需要對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，才能有效地加以利用。與細(xì)胞學(xué)技術(shù)和生化標(biāo)記法相比，分子標(biāo)記法簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確的特點(diǎn)使其廣泛地用于檢測(cè)、跟蹤導(dǎo)入小麥背景中的黑麥染色體。然而，目前開(kāi)發(fā)的黑麥染色體的特異標(biāo)記，多集中在黑麥的IRS染色體上，如 SSRfeid Bmac0213 Φ^Χ^ Schneider A and Molnar-Lang Μ. 2008. Polymorphism analysis using IRS-specific molecular markers in rye cultivars {Secale cereale L.) of various origin. Cereal Res Commun, 36: 11-19), SSAP 標(biāo)記 S10, S20, S17 (參考文獻(xiàn):Nagy ED and Lelley Τ. 2003. Genetic and physical mapping of sequence specific amplified polymorphic (SSAP) markers on the IRS chromosome arm in a wheat background. Theor Appl Genet, 107: 1271-1277)，EST-STS 標(biāo)記 STSwe3 和 STSwel26 (參考文獻(xiàn)Wang CM, Li LH, Zhang XT, Gao Q, Wang RF, andAn DG. 2009. Development and application of EST-STS markers specific to chromosome IRS ofSecale cereale. Cereal Research Communications 37: 13—21)等。Zhuang 等(2008) 艮道了 1R，4R，5R， 7R 染色體特異的 EST-SSR 標(biāo)記(參考文獻(xiàn)Zhuang LF, Song LX, Feng YG, Qian BL, Xu HB, Pei ZY, Qi ZJ. 2008. Development and chromosome mapping of new wheat EST-SSR markers and application for characterizing rye chromosomes added in wheat. Acta Agron Sin, 34:擬6-933)。Lee 等(2009)還報(bào)道了 6 個(gè) 2RL 染色體特異的 EST標(biāo)記(參考文獻(xiàn)Lee TG, Hong MJ, Johnson JW, Bland DE, Kim DY, Seo Yff. 2009. Development and functional assessment of EST-derived 2RL-specific markers for 2BS. 2RL translocations. Theor Appl Genet, 119: 663-673)。以普通小麥EST序列開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，這樣的分子標(biāo)記在其近緣物種中表現(xiàn)出很高的可轉(zhuǎn)移性(參考文獻(xiàn)Zhang LY, Bernard Μ, Leroy P, Feuillet C, Sourdille P.2005. High transferability of bread wheat EST-derived SSRs to other cereals. Theor Appl Genet, 111: 677-687)。Zhang 等(2007)(參考文獻(xiàn)Zhang LY, Bernard Μ, Ravel C, Balfourier F, Leroy P, Feuillet C, Sourdille P. 2007. Wheat EST-SSRs for tracing chromosome segments from a wide range of grass species. Plant Breeding, 126: 251-258)進(jìn)一步報(bào)道了小麥的EST標(biāo)記能夠被用來(lái)跟蹤其許多近緣種的染色體片段。因此，利用小麥的EST序列來(lái)開(kāi)發(fā)黑麥染色體特異的分子標(biāo)記十分可行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一套基于小麥染色體上的EST序列而設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)出的黑麥染色體特異的分子標(biāo)記，借助這些分子標(biāo)記能夠用普通PCR技術(shù)快速、準(zhǔn)確的鑒定小麥遺傳背景中的IR 7R全部黑麥染色體，為黑麥染色體上的有益基因轉(zhuǎn)移到栽培小麥背景中提供簡(jiǎn)便有效的分子鑒定方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
基于小麥EST序列的黑麥IR 7R染色體特異的分子標(biāo)記，這些分子標(biāo)記為根據(jù)小麥染色體上的EST序列而設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物，這些分子標(biāo)記為用于鑒定黑麥IR 7R 染色體的特異標(biāo)記，其堿基序列見(jiàn)表1，
表1.根據(jù)小麥染色體表達(dá)序列標(biāo)簽序列而設(shè)計(jì)的17對(duì)標(biāo)記引物序列
權(quán)利要求
1.基于小麥EST序列的黑麥IR 7R染色體特異的分子標(biāo)記，其特征在于這些分子標(biāo)記為根據(jù)小麥染色體上的表達(dá)序列標(biāo)簽EST序列而設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物，這些分子標(biāo)記為用于鑒定黑麥IR 7R染色體的特異標(biāo)記，其堿基序列見(jiàn)表1，表1.根據(jù)小麥染色體上的表達(dá)序列標(biāo)簽EST序列而設(shè)計(jì)的17對(duì)標(biāo)記引物序列
2.應(yīng)用權(quán)力要求1所述的基于小麥EST序列的黑麥IR 7R染色體特異的分子標(biāo)記對(duì)黑麥染色體進(jìn)行鑒定的方法，其特征步驟包括A、分子標(biāo)記的選定和制備根據(jù)所需鑒定的黑麥染色體選定分子標(biāo)記，比如，預(yù)備檢測(cè)的小麥與黑麥遠(yuǎn)緣雜交的后代材料當(dāng)中是否含有黑麥2R染色體，則選定4-SWES120分子標(biāo)記，然后根據(jù)權(quán)利要求1給出的序列合成此標(biāo)記引物；B、標(biāo)記引物的稀釋將上步合成的標(biāo)記引物，先用IXTE緩沖液溶解成IOOmmolL—1的母液放入-20°C的冰箱中保存，使用前吸取母液用超純水稀釋成IOmmol L—1的工作液待用； 其中 IXTE 緩沖液的配方為，IOmmol Γ1 Tris-HCl 與 Im mol Γ1 EDTA, pH=8. O ；C、黑麥染色體的特異標(biāo)記C-1、模板DNA的提取取待測(cè)物——小麥與黑麥的遠(yuǎn)緣雜交后代材料，對(duì)照物O——不包含待測(cè)黑麥染色體的樣品，對(duì)照物1——包含待測(cè)黑麥染色體的樣品，然后利用常規(guī)DNA 提取方法分別提取三者的DNA ；C-2、PCR擴(kuò)增以C-I所得DNA樣品為模板，利用步驟B所得工作液在PCR擴(kuò)增儀中分別對(duì)待測(cè)物、對(duì)照物O及對(duì)照物1進(jìn)行擴(kuò)增；C-3、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)步驟C-2所得的擴(kuò)增產(chǎn)物，用銀染法進(jìn)行染色，并在凝膠成像儀上照相；C-4、結(jié)果比對(duì)將待測(cè)遠(yuǎn)緣雜交后代材料的電泳圖譜分別與對(duì)照物O、對(duì)照物1的電泳圖譜進(jìn)行比對(duì)，如果待測(cè)遠(yuǎn)緣雜交后代材料和對(duì)照物1的電泳圖譜均有特異擴(kuò)增片段，說(shuō)明遠(yuǎn)緣雜交后代材料中有待測(cè)黑麥染色體；如果待測(cè)遠(yuǎn)緣雜交后代材料的電泳圖譜與對(duì)照物O的電泳圖譜一致，均不含有特異擴(kuò)增片段，說(shuō)明遠(yuǎn)緣雜交后代材料中不含有待測(cè)黑麥染色體。
3.根據(jù)權(quán)力要求2所述的對(duì)黑麥染色體進(jìn)行鑒定的方法，其特征在于步驟A中選定的標(biāo)記引物由上海聯(lián)合基因有限公司合成。
4.根據(jù)權(quán)力要求2所述的對(duì)黑麥染色體進(jìn)行鑒定的方法，其特征在于步驟C-2中對(duì)所述待測(cè)物、對(duì)照物O及對(duì)照物1的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增的具體操作為，在體積為0. 2ml的 Eppendof 管中依次加入 30ng 的模板 DNA，IXPCR buffer, 1. 5mmol I/1 MgCl2, 200mmol Γ1 dNTP，正、反向引物各0. 2mmol L—SO. 5U Taq DNA聚合酶，最后用無(wú)菌超純水補(bǔ)充反應(yīng)體系至10ml，然后將Eppendof管放在GeneAmp9700基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)力要求4所述的對(duì)黑麥染色體進(jìn)行鑒定的方法，其特征在于所述擴(kuò)增反應(yīng)的具體程序?yàn)?，?4°C預(yù)變性5min ；然后94°C變性lmin，根據(jù)標(biāo)記引物的退火溫度退火 lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)38次；最后72°C延伸lOmin，10°C保存；其中各標(biāo)記引物的退火溫度為，1_STOS999，57 ；2-SWES1119, 51 ；3-SWES1128,49 ；4-SWES120, 55 ；5-SWES228,62 ； 6-KSUM62，62 ；7_CFE218，60 ；8-MAG1424,52 ；9-SWES180,53 ； 10-SWES182,58 ； 11-MAG1242， 55 ；12-SWES78,50 ；13-SWES206, 55 ； 14-SWES231,58 ； 15-DUPffl11, 58 ； 16-CFE228，60 ； 17-DUPW535,580
6.根據(jù)權(quán)力要求2所述的對(duì)黑麥染色體進(jìn)行鑒定的方法，其特征在于步驟C-3中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法具體為，在步驟C-2所得的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液2μ1，混勻之后取3μ1用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電泳電壓為150 180V，電泳1 池。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了17個(gè)基于小麥EST序列的黑麥1R～7R染色體特異的分子標(biāo)記，這些分子標(biāo)記為根據(jù)小麥染色體上的表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag,EST)序列而設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物，這些分子標(biāo)記為用于鑒定黑麥1R～7R染色體的特異標(biāo)記；應(yīng)用這些分子標(biāo)記對(duì)黑麥1R～7R染色體進(jìn)行鑒定的基本步驟包括A、標(biāo)記引物的選定和制備；B、標(biāo)記引物的稀釋?zhuān)籆、黑麥染色體的特異標(biāo)記C-1、模板DNA的提取，C-2、PCR擴(kuò)增，C-3、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，C-4、結(jié)果比對(duì)。本發(fā)明基于小麥染色體上的EST序列設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)出了一套黑麥染色體的特異分子標(biāo)記，借助這些分子標(biāo)記能夠用普通PCR技術(shù)快速、準(zhǔn)確的鑒定小麥遺傳背景中的1R～7R全部黑麥染色體，為黑麥染色體上的有益基因轉(zhuǎn)移到栽培小麥背景中提供了簡(jiǎn)便有效的分子鑒定方法。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102154286SQ201110092988
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者安調(diào)過(guò), 尹冬冬, 李立會(huì), 許紅星 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所