專利名稱：馬鈴薯致病疫霉△5去飽和酶基因PinD5的功能鑒定與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在馬鈴薯致病疫霉(Phytophthora infestans)超長鏈多不飽和脂肪酸合成代謝途徑中Δ 5去飽和酶基因PinD5的功能鑒定與應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
超長鏈多不飽和脂肪酸，一般含20-22個碳、4-6個順式雙鍵，例如花生四烯酸 (AA，20:4A5’8ai’14)、EPA(20:5A8’14’14’17)以及 DHA(226 Δ4’7a°’13’16’19)對人類營養(yǎng)和健康具有重要的作用。經(jīng)常補(bǔ)食EPA和DHA這類脂肪酸不僅對胎、嬰幼兒大腦皮層及神經(jīng)元的發(fā)育具有重要作用(Crawford，2000)，而且能夠降低心腦血管疾病、高血壓以及炎癥等疾病的發(fā)病率(Thies et al. ,2003 ；Kinsella et al. , 1990 ；Yamazaki et al.，1992)。目前，這類脂肪酸主要來源于深海魚油。由于過度捕撈，導(dǎo)致海洋野生魚資源日益枯竭，魚油產(chǎn)量已經(jīng)不能夠滿足人們正迅速增長的需要(Pauly et al.，2003)。此外，由于環(huán)境污染等，導(dǎo)致魚油中重金屬離子與有機(jī)氯等有毒物質(zhì)的含量升高，嚴(yán)重影響魚油的食用安全性(Yokoo et al. ,2003 ；Drexler et al.，2003)。因此，迫切需要一條持續(xù)、穩(wěn)定、安全的魚油替代生產(chǎn)途徑。高等植物能夠大量合成亞油酸(LA，18:2A9’12)和亞麻酸(ALA，183 Δ9’12’15)，但是不能夠合成超長鏈多不飽和脂肪酸。一些真菌和微藻等能夠?qū)⒆陨淼腖A和ALA通過“ Δ 6 去飽和途徑”中的一系列鏈延長酶和去飽和酶催化作用轉(zhuǎn)化生成EPA和DHA。LA和ALA 在Δ 6去飽和酶的催化作用下，生成Y-亞麻酸(GLA，18:3A6’9’12)和十八碳四烯酸(SDA， 18:4Δ6’9’12’15)，然后再在Δ 6鏈延長酶催化作用下生成二高-Y-亞麻酸(DGLAdOJA8’11’ 14)和二十碳四烯酸(ETA，20:4A8’"’14’17)。最后，在Δ5去飽和酶催化作用下生成AA和EPA。 EPA經(jīng)過一次Δ 5鏈延長和一次Δ 4去飽和生成DHA。通過代謝基因工程技術(shù)將海洋微藻或真菌中的超長鏈多不飽和脂肪酸合成代謝途徑移植到植物中，從而在植物特別是油料作物種子中生產(chǎn)此類脂肪酸，將是一條理想的魚油替代生產(chǎn)途徑。目前，此合成代謝途徑中的相關(guān)基因已經(jīng)陸續(xù)在高等植物、海藻、真菌、 線蟲、苔蘚以及動物等克隆到(Yadav et al.，1993 ；Wallis and Browse, 1999 ；Qi et al.， 2002 ；Michaelson et al. ,1998 ；Sayanova et al. ,2006 ；Kajikawa et al. ,2006 ；Cho et al.，1999 ；Sperling et al.，2000 ；Leonard et al.，2000 ；Watts and Browse, 1999)，并都已申請專利保護(hù)。盡快發(fā)掘克隆這類基因資源，獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因，為我國通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在油料作物中生產(chǎn)此類保健脂肪酸奠定基礎(chǔ)，是本項發(fā)明創(chuàng)造的重要目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先提取馬鈴薯致病疫霉總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用引物 5，-ATGACCACGGATGACATCAC-3，和 5，-CTCGAGTTAGCCCATGTGGACGGT-3，做 PCR，將擴(kuò)增的片段膠回收后，連接到克隆載體PMD18-T中。生物信息學(xué)分析，得到的cDNA片段開放閱讀框部分為1551bp，編碼516個氨基酸的多肽，具備“front-end”去飽和酶所具有的N端細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域(HPGG)，以及和電子傳遞有關(guān)的三個組氨酸框結(jié)構(gòu)域(HxxxH、HxxHH和 LNxQxxHHLFP)。該基因cDNA序列如下 序列表
(I)SEQ ID NO. 1 的信息
(a)序列特征 *長度1551堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型cDNA
(c)假設(shè)否
(d)反義否
(e)最初來源馬鈴薯致病疫霉(Phytophthorainfestans)
(f)序列描述=SEQIN NO. 11ATGACCACGGATGACATCACACTCCAATTCGCACTCACGGCCGGAAAGACCATCGGAACC
61TCTGCTTCCCCTGCATTGTCACCACTAATTGACGAAGTAGAAGCTGCCATGGCCCCTATC
121GAGACCGAGAAGACCATCGTTAACGAGGGTCTTTACCAGCGCAAGACTGCTGCTGATGCA
181GCTACTAACAAGTCTGCCGCCACCTACACGTGGCAGGACGTGGCCAAGCACAACACAGAC
241AACAGCGCTTGGGTCATCATCCGCGGAATCGTATACGACGTAACTGAATGGGCGGATCGC
301CACCCTGGAGGCCGTGAACTCGTGCTGCTGCACTCTGGTCGCGAGTGCACCGACACATTC
361GACTCGTACCACCCATTCTCTAACCGCGCCGAGAAGATCCTGGCCAAATACGCCATTGGC
421AAGCTTGTCGGAGGCTCCGAGTTCCCCACCTACAAGCCTGACACAGGTTTCTACAGGGAA
481TGCTGCGACCGTGTGCACCAGTACTTCAAGGACAACAACCTGGACCCTCGCAGTCCGTAC
541TCGGGTCTGTTGCGCATGCTTTTCGTGGCTATCCTTGGTGCGGTGTCCTACGTGGGTATG
601AACCAGCTGCTGTCCGACAACATCTACGCACACTACGCATGGGGCGCCCTCTTCGGTGCG
661TGCCAAGCTCTACCTTTGCTGCACGTGATGCACGATGCCTCACACGCGGCCATTACCAGC
721AGCCCTACAGGCTGGAGACTTATCGGGCGTCTTGCAATGGACTGGGTGGCCGGCGCCAAC
781ATGGTGTCTTGGCTCAACCAGCACGTTGTGGGCCACCACATCTACACGAACGTTGCGGGA
841GCTGACCCTGACCTTCCCGTGGACTTCAAGAGCGACGTGCGTCGCATAGTGTACCGCCAG
901GTGTTGCTTCCAATCTACAAGTTCCAACACATCTACCTACCTCCGCTCTACGGCGTGCTC
961GGCCTCMGTTCCGTGTTCAGGACATCTTTGAGACGTTCATCTCCCTCACCAACGGACCG
1021CTACGTGTGAACCCCCTCTCTATCGGTGACTGGGCTGAAATGATCATCTCCAAGGCCTTC
1081TGGGCGTTCTACCGCATCTACATCCCGCTGGTTGTGCTGC AGGTTAACCCCGCTCGCTTC
1141TGGGGTGTTTTCCTTCTGGCCGAGTTTGTG ACGGGCTGGTACTTGGCCTTCAACTTCCM
1201GTTAGTCACGTGTCCACGGCATGCGACTACCCTGGTGGTGATGAGGAGGTATCGGCTATC
1261GMGACGAGTGGGCTATCTCGCAGATCAAGTCATCGGTAG ACTACGCGCACGGCTCGTTC
1321CTCACGGCGTTCCTCACGGGTGCACTGAACTACCAGGTGACCCACCACCTCTTCCCCGGCa)序列特征
*長度516氨基酸 *類型氨基酸 *鏈型單鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型蛋白質(zhì)序列描述
Asp Asp
TGCTATCGCC CCGATCATCA TGGACGTGTG CAACAAGTAC GCCTACGTTC TCAGCGGCTC TGGCTGGACA CTTTGAGCAT GGGCAAGCGT GTGACCGTCC ACATGGGCTA A
MET 1
Lys Asp Ile Ala Lys Val Glu Asp Lys Tyr His Ser Ser
Thr Thr Glu Val Thr His Tyr Leu Ser Tyr Lys Gln Gly Tyr
Thr lie Val Asn Asn Asn Asp Val Tyr Ala Pro Tyr
Gly Glu Glu Lys Thr Val Leu His lie Asp Phe
Leu Leu
Val Gly
5
Thr 20 Ala 35 Gly 50 Ser 65 Asp 80 Thr 95 Leu 110 Pro 125 Gly 140 Thr 155 Lys 170 Arg 185 MET 200
lie Ser Ala Leu Ala Asn Glu His Phe Lys Gly Asp MET Asn
Thr Leu Ala Ser MET Ala Tyr Gln Ala Thr Ser Ala Trp Ala Ser Gly Ser Asn Leu Val Phe Tyr Asn Asn Leu Phe Gln Leu
Gln Pro Pro Arg Tyr Trp Asp Arg Arg Gly Arg Leu Val Leu
Phe 10 Ala 25 lie 40 Lys 55 Thr 70 Val 85 Arg 100 Glu 115 Ala 130 Gly 145 Glu 160 Asp 175 Ala 190 Ser 205
Ala Leu Thr Ala
Leu Ser Pro Leu
Glu Thr Trp lie
Thr Ala Gln lie
His Pro
Cys Glu Ser Cys Pro lie Asp
Thr Lys Glu Cys Arg Leu Asn
Glu Ala Asp Arg Gly Asp lie Phe Asp
Lys Asp Val Gly Gly Thr Leu Pro Arg
Ser Pro
Gly lie
Ala
Tyr
Gly 15 lie 30 Thr 45 Ala 60 Ala 75 lie 90 Arg 105 Phe 120 Ala 135 Thr 150 Val 165 Tyr 180 Val 195 Ala 210
權(quán)利要求
1.馬鈴薯致病疫霉八5去飽和酶基因？^105的應(yīng)用，其特征在于該基因(^嫩所編碼的蛋白能夠?qū)⒊L鏈多不飽和脂肪酸二高-Y-亞麻酸轉(zhuǎn)化成花生四烯酸，可以用于植物特別是油料作物中生產(chǎn)魚油。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種馬鈴薯致病疫霉Δ5去飽和酶基因PinD5的功能鑒定與應(yīng)用，通過RT-PCR的方法，在馬鈴薯致病疫霉中分離到與魚油合成相關(guān)的Δ5去飽和酶基因PinD5，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。經(jīng)過酵母表達(dá)鑒定，確定它是一個新的Δ5去飽和酶基因，其編碼的Δ5去飽和酶能夠?qū)⒍?γ-亞麻酸轉(zhuǎn)化成花生四烯酸，可以用于植物特別是油料作物中生產(chǎn)魚油。
文檔編號C12N15/53GK102220351SQ20111009457
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月4日
發(fā)明者亓寶秀, 孫全喜, 李新征 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)