專利名稱：單個量子點偶聯(lián)單個長鏈dna分子的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種單個量子點偶聯(lián)單個長鏈DNA分子的方法，屬于納米材料領域和分子生物學領域。
背景技術：
納米材料科學是目前研究的熱點。納米材料通常是指物質(zhì)粒徑其中任意一維的尺度在1 IOOnm之間，由于獨特的尺寸結構，使它們具有特異的物理和化學性質(zhì)。量子點 (quantum dots,QD)通常是指半導體熒光納米材料，由于其具有獨特的熒光性質(zhì)，已廣泛應用于生物科學和材料科學中。脫氧核糖核酸(DNA)由于其特有的納米尺度的雙螺旋結構， 并且具有許多不同的構象，堿基的互補配對，末端容易進行功能化修飾(如氨基、羧基等)， 在序列上具有可設計性，而且可通過酶延伸反應擴增、伸長，非常適合于構建功能性的納米材料。然而在目前的研究中，一個主要的困難是不能有效的控制量子點偶聯(lián)DNA的數(shù)量 (Chembiochem 2009，10，1781)，所以常需利用凝膠電泳的方法分離量子點表面偶聯(lián)不同數(shù)量DNA片段(J. Am. Chem. Soc. 2004,126,10832)。另一方面，由于空間位阻和靜電斥力的影響，傳統(tǒng)的偶聯(lián)方法只能在量子點表面偶聯(lián)短片段的DNA分子(小于100個堿基，Nano Iett 2001，1，32)。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)是現(xiàn)代生命科學研究中最常用的方法之一，可以合成長鏈DNA片段，并且在一個短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的目標DNA片段。通過現(xiàn)有技術檢索，發(fā)現(xiàn)中國專利申請?zhí)?00410018098. X公開的“基于納米粒子的PCR”已有報道，主要利用納米金和磁性納米粒子為材料，并且基于納米金的酶延伸(J. Am. Chem. Soc. 2002, 124，7314)也有報道。這些研究證明基于納米材料的PCR擴增以及酶延伸是可行的，但是并未報道得到單個量子點偶聯(lián)單個長鏈DNA分子的復合物。單個量子點偶聯(lián)單個長鏈DNA分子將使基于量子點的定量分析和單分子成像成為可能，并將在探針制備、納米結構組裝、納米尺度的生化反應等相關領域發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種單個量子點偶聯(lián)單個長鏈DNA分子的方法。本發(fā)明提供的單個量子點偶聯(lián)單個長鏈DNA分子的方法，包括如下步驟
1)根據(jù)所要得到的長鏈DNA片段，設計并合成一對寡核苷酸引物，并將其中一個引物的5’端進行化學修飾，使寡核苷酸引物通過化學鍵偶聯(lián)到量子點表面；
2)將偶聯(lián)了量子點的寡核苷酸引物與另外一個引物，以及含有目的片段的DNA模板一起加入聚合酶鏈式反應體系中，通過聚合酶鏈式反應得到長鏈DNA分子；
3)分離聚合酶鏈式反應得到的混合物，得到單個量子點偶聯(lián)單個長鏈DNA分子的復合物。進一步優(yōu)選的技術方案是為了減少寡核苷酸引物和量子點偶聯(lián)時的空間位阻，在對與量子點偶聯(lián)的寡核苷酸引物進行化學修飾之前，在5’端連上(CH2)6-TTTTTT。寡核苷酸引物和量子點的偶聯(lián)方法可以為氨基和羧基、巰基和馬來酰亞胺或巰基與金屬元素之間的化學反應。單個量子點偶聯(lián)單個長鏈DNA分子復合物是通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的。所述量子點為水溶性的，粒徑在1-100 nm范圍內(nèi)。作為聚合酶鏈式反應的模板可以是基因組DNA (包括植物、動物、微生物等)，也可以是質(zhì)粒DNA。所述PCR體系參見各種商業(yè)聚合酶說明書，以FERMENTAS公司Taq酶為例，PCR體系的組成為
Taq酶IU10 X PCR緩沖液2. 5uLdNTP (2mM)2. 5uLMg2+ (25mM)1. 5uL寡核苷酸引物和量子點偶聯(lián)物(0. 4uM)IuL另一個引物(0. 4uM)IuL模板DNA50ng(MH2O補足總體積為25uL
將通過電泳分離得到的復合物，經(jīng)過原子力顯微鏡檢測，證實是單個量子點偶聯(lián)單個長鏈DNA分子的復合物。本發(fā)明得到的是單個長鏈的DNA分子偶聯(lián)單個量子點的復合物，并且可以得到含有任意的目的片段的長鏈DNA分子(100bp-2000bp)，這種偶聯(lián)物經(jīng)電泳檢測、原子力顯微鏡檢測、熒光光譜檢測，其量子點和DNA的特性都沒有改變(如圖1-圖3所示)，可以用于后續(xù)的操作。該方法操作簡單，適用范圍廣?？梢詰糜谔结樦苽?、納米結構組裝、納米介觀尺度的生化反應等相關領域。


圖1為實施例1聚合酶鏈式反應之后得到的量子點與長鏈DNA偶聯(lián)物的電泳圖， 反應了其偶聯(lián)物的遷移速率。圖2是對實施例1分離得到的復合物進行原子力顯微鏡的觀察，體現(xiàn)是單個量子點偶聯(lián)單個長鏈的DNA分子的復合物。圖3是對實施例1聚合酶鏈式反應產(chǎn)物進行熒光光譜分析，體現(xiàn)其量子點的熒光性質(zhì)沒有改變。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。實施例1
1)合成在5’端進行氨基修飾的寡核苷酸引物，序列為5’ -NH2-(CH2)6-TTTTTT"GGCCTTC AGAGACGAGGTTG-3’ ；
42)將寡核苷酸引物偶聯(lián)到羧基水溶性Cdk/ZnS量子點表面(產(chǎn)品型號W4- 605，武漢珈源量子點開發(fā)技術有限公司)；
3)將合成的寡核苷酸引物和羧基水溶性Cdk/ZnS量子點偶聯(lián)物作為引物1，引物2為 5，-GCTGTGCATCAGGAATAATTTG-3，，玉米基因組DNA作為模板，進行以羧基水溶性CcKe/ZnS 量子點為基礎的聚合酶鏈式反應，擴增/ai汴aldehyde dehydrogenase 7基因，得到480 bp長的DNA分子；
所述PCR體系參見各種商業(yè)聚合酶說明書，以FERMENTAS公司Taq酶為例，PCR體系的組成為
Taq酶IU10 X PCR緩沖液2. 5uLdNTP (2mM)2. 5uLMg2+ (25mM)1. 5uL引物 1 (0. 4uM)IuL引物 2 (0. 4uM)IuL模板DNA50ng(WH2O補足總體積為25uL
4)瓊脂糖凝膠電泳分離得到單個羧基水溶性Cdk/ZnS量子點偶聯(lián)單個480bp長的DNA 分子的復合物，如圖1所示，(a) EB染之前，(b) EB染之后。M道DNA marker (DL 2000)； 1道正常PCR產(chǎn)物；2道量子點為基礎的PCR產(chǎn)物；3道量子點與寡核苷酸引物的偶聯(lián)物；4道羧基水溶性Cdk/ZnS量子點。由于量子點的光學性質(zhì)，在EB染之前可以在2，3，4 道中看到帶，并且遷移率2<3<4，證明PCR延伸成功，量子點與寡核苷酸引物偶聯(lián)成功。而且我們看到2道中的帶要窄些，猜想在PCR過程中，由于空間位阻的影響，只有其中一個連接在量子點表面的寡核苷酸引物延伸成功。EB染之后，在1道中可以看到正常PCR產(chǎn)物的帶，并且在2道中看到了與1道遷移率一樣的一條帶，我們猜想可能在PCR過程中部分量子點與寡核苷酸引物脫離，進行了正常PCR的過程。5)將通過電泳分離得到的復合物，再進行原子力顯微鏡檢測，證實是單個羧基水溶性Cdk/ZnS量子點偶聯(lián)單個480 bp長的DNA分子復合物，如圖2所示。6)將以羧基水溶性Cdk/ZnS量子點為基礎的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物進行熒光光譜分析，如圖3所示，其熒光強度只是略微減少，熒光性質(zhì)沒有發(fā)生變化。
實施例2
1)合成在5’端進行氨基修飾的寡核苷酸引物，序列為5 ’ -NH2- (CH2) 6-TTTTTT-TCTGAGTACGCACGGCCGGT-3‘；
2)將寡核苷酸引物偶聯(lián)到PolyethyleneGlycol (PEG)Lipids修飾的CcKe/ZnS量子點表面(產(chǎn)品型號W1 - 605，武漢珈源量子點開發(fā)技術有限公司)；
3)將合成的寡核苷酸引物和PEGLipids修飾的Cdk/ZnS量子點偶聯(lián)物作為引物1， 引物2為5，-CATCGCCGGTCGGCATCGTT-3，，人基因組DNA作為模板，進行以PEG Lipids修飾的CcKe/ZnS量子點為基礎的聚合酶鏈式反應，擴增1然ribosomal 1基因，得到1046 bp 長的DNA分子；
所述PCR體系參見各種商業(yè)聚合酶說明書，以FERMENTAS公司Taq酶為例，PCR體系的組成為
權利要求
1.單個量子點偶聯(lián)單個長鏈DNA分子的方法，其特征在于包括如下步驟1)根據(jù)所要得到的長鏈DNA片段，設計并合成一對寡核苷酸引物，并將其中一個引物的5’端進行化學修飾，使寡核苷酸引物通過化學鍵偶聯(lián)到量子點表面；2)將偶聯(lián)了量子點的寡核苷酸引物與另外一個引物，以及含有目的片段的DNA模板一起加入聚合酶鏈式反應體系中，通過聚合酶鏈式反應得到長鏈DNA分子；3)分離聚合酶鏈式反應得到的混合物，得到單個量子點偶聯(lián)單個長鏈DNA分子的復合物。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于在對與量子點偶聯(lián)的寡核苷酸引物進行化學修飾之前，在5，端連上(CH2)6-TTTTTT。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于寡核苷酸引物和量子點的偶聯(lián)方法為氨基和羧基、巰基和馬來酰亞胺或巰基與金屬元素之間的化學反應。
4.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于單個量子點偶聯(lián)單個長鏈DNA分子的復合物通過瓊脂糖凝膠電泳分離。
5.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述量子點為水溶性的，粒徑在1-100 nm范圍內(nèi)。
6.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于作為聚合酶鏈式反應的模板是基因組 DNA或質(zhì)粒DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單個量子點偶聯(lián)單個長鏈DNA分子的方法。用偶聯(lián)有量子點的寡核苷酸引物代替聚合酶鏈式反應中的一個引物，通過聚合酶鏈式反應，得到目的片段的長鏈DNA(大于100堿基對)，并通過電泳分離的方法，進一步得到單個量子點偶聯(lián)單個長鏈DNA分子復合物。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)偶聯(lián)方法中不能在量子點表面偶聯(lián)長鏈DNA分子和不能控制偶聯(lián)DNA分子數(shù)量的問題，可以廣泛應用于探針制備、納米結構組裝、納米尺度的生化反應等相關領域。
文檔編號C12N15/11GK102181441SQ20111009507
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權日2011年4月15日
發(fā)明者何世斌, 龐代文, 李立家, 黃碧海 申請人:武漢大學