專利名稱：一種分離脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于體外分離純化脂肪組織中無脂滴的有核細(xì)胞的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
脂肪組織中的干細(xì)胞種類與數(shù)量僅次于骨髓組織，是人體的第二大干細(xì)胞庫。臨床采集骨髓和采集腹部的脂肪，兩者相比，采集脂肪病人更容易接受，相比而言痛苦也小一點(diǎn)。近年來減肥的吸脂手術(shù)后可獲得大量的脂肪，這些脂肪為干細(xì)胞分離提取提供了非常便捷的來源。本試劑盒采用的方法法可將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，易于從外界吸收養(yǎng)分和排除代謝產(chǎn)物，這樣就可以很快得到大量活 細(xì)胞，細(xì)胞也可以在短時(shí)間內(nèi)生長成片?，F(xiàn)有技術(shù)中從脂肪中分離純化干細(xì)胞的方法存在著干細(xì)胞活率及回收率較低等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種用于體外分離純化脂肪組織中無脂滴的有核細(xì)胞的試劑盒以及該試劑盒的使用方法。采用本發(fā)明的試劑盒從脂肪中分離純化干細(xì)胞干細(xì)胞活率高及回收率高。本發(fā)明所述的試劑盒包括各自隔離包裝的消化液、純化液和懸浮液，其中消化液是溶于生理鹽水的蛋白酶，其重量體積濃度為0. 25% ;純化液是溶于生理鹽水的聚蔗糖，其重量體積濃度為10% ;懸浮液是生理鹽水，優(yōu)選地，各自獨(dú)立包裝。本發(fā)明所述的試劑盒，其中所述的消化液純化液懸浮液的體積比為(20-1500) (10-45) 20。本發(fā)明的試劑盒其中所述試劑盒中還包括使用說明書，所述說明書載明了所述試劑盒的使用方法，所述方法包括如下步驟(I)將抽取的500ml脂肪與500ml消化液完全混勻；(2)將混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小時(shí)；(3)孵育完成后，用100目的濾網(wǎng)過濾混合溶液；(4)將混合溶液以離心力400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm) IOmin的條件下離心，去除上清；(5)用IOOml生理鹽水重懸沉淀細(xì)胞；(6)將純化液按每管15ml加到50ml離心管中，將第5步中的細(xì)胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg (轉(zhuǎn)速2000rpm)，20分鐘離心；(7)離心后，吸取中間層細(xì)胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C,離心力400xg (轉(zhuǎn)速1500rpm), 8分鐘離心洗漆細(xì)胞兩次；(8)將洗后的細(xì)胞加到懸浮液中，備用。
本發(fā)明所述的試劑盒，用于體外分離純化脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞。本試劑盒利用蛋白酶分解脂肪的原理，采用梯度離心法分離純化脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞。本發(fā)明所述的試劑盒，使用的樣品類型為用于體外分離純化脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞，可以按照通用的方法收集脂肪樣本；脂肪收集后應(yīng)在6小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分離純化脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞。本發(fā)明所述的試劑盒，回收率可以達(dá)到》90%，分離的有核細(xì)胞活率> 96%，最大程度地維持了干細(xì)胞在體外微環(huán)境的恒定。本發(fā)明還公開了所述試劑盒的使用方法，包括如下步驟(I)將抽取的500ml脂肪與500ml消化液完全混勻； (2)將混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小時(shí)； (3)孵育完成后，用100目的濾網(wǎng)過濾混合溶液；(4)將混合溶液以離心力400xg (轉(zhuǎn)速1500rpm) IOmin的條件下離心，去除上清；(5)用IOOml生理鹽水重懸沉淀細(xì)胞；(6)將純化液按每管15ml加到50ml離心管中，將第5步中的細(xì)胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg (轉(zhuǎn)速2000rpm)，20分鐘離心；(7)離心后，吸取中間層細(xì)胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C,離心力400xg (轉(zhuǎn)速1500rpm), 8分鐘離心洗漆細(xì)胞兩次；(8)將洗后的細(xì)胞加到懸浮液中，備用。本發(fā)明的細(xì)胞活率是采用如下方法進(jìn)行檢測的I吸管吸取90微升分離純化后脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞懸液。2加入0. 2%的臺(tái)盼藍(lán)染色液10微升，混勻。3靜置3分鐘。4吸取混合溶液，滴一滴至細(xì)胞計(jì)數(shù)板，均勻鋪開后，顯微鏡下觀察。5顯微鏡下計(jì)數(shù)，藍(lán)染的細(xì)胞為死細(xì)胞(A)，無染色的細(xì)胞為活細(xì)胞(B)。有核細(xì)胞活率=B/(A+B)*100%
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I細(xì)胞處理試劑盒(脂肪)的制備方法消化液的制備125g蛋白酶溶解在50000ml生理鹽水中，濃度為0. 25%，37°C水浴，從水浴鍋溫度穩(wěn)定在37°C開始計(jì)時(shí)8小時(shí)。37°C水浴8小時(shí)后，從水浴鍋中取出，室溫半小時(shí)，用量筒量取500ml，裝入試劑瓶中，貼好標(biāo)簽，然后置于包裝盒中。純化液的制備聚蔗糖450g溶解在生理鹽水4500ml中，濃度為10%，37°C水浴，從水浴鍋溫度穩(wěn)定在37°C開始計(jì)時(shí)8小時(shí)。37°C 8小時(shí)后，從水浴鍋中取出，室溫半小時(shí)，用量筒量取45ml，裝入試劑瓶中，貼好標(biāo)簽，然后置于包裝盒中。懸浮液的制備生理鹽水2000ml 37°C水浴，從水浴鍋溫度穩(wěn)定在37°C開始計(jì)時(shí)8小時(shí)。37°C 8小時(shí)后，從水浴鍋中取出，室溫半小時(shí)，用量筒量取20ml，裝入試劑瓶中，貼好標(biāo)簽，然后置于包裝盒中。
細(xì)胞處理試劑盒(脂肪)F500型說明書廣品名稱通用名細(xì)胞處理試劑盒(脂肪)英文名CellIsolation Kit包裝規(guī)格F500型消化液500ml純化液45ml懸浮液20ml預(yù)期用途用于體外分離純化脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞作用原理利用蛋白酶分解脂肪的原理，采用梯度離心法分離純化脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞。
主要組成組份L消化液(蛋白酶和磷酸鹽緩沖液)2.純化液(聚蔗糖和生理鹽水)3.懸浮液(生理鹽水)貯存條件及有效期2-8°C保存，有效期24個(gè)月。適用儀器低溫離心機(jī)、離心管和移液管要求使用一次性產(chǎn)品(使用者自備，推薦使用無菌產(chǎn)品)。樣本要求
本方法推薦的樣品類型為脂肪； 按照通用的方法收集所需的脂肪樣本； 脂肪收集后應(yīng)在6小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分離純化脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞； 微生物污染的樣本對測定結(jié)果的影響尚未確定。試驗(yàn)方法本試劑盒可分離純化脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞。細(xì)胞回收率和活率檢測I吸管吸取90微升分離純化后脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞懸液。2加入0. 2%的臺(tái)盼藍(lán)染色液10微升，混勻。3靜置3分鐘。4吸取混合溶液，滴一滴至細(xì)胞計(jì)數(shù)板，均勻鋪開后，顯微鏡下觀察。5顯微鏡下計(jì)數(shù)，藍(lán)染的細(xì)胞為死細(xì)胞(A)，無染色的細(xì)胞為活細(xì)胞(B)。有核細(xì)胞活率=B/(A+B)*100%操作步驟I將抽取的500ml脂肪與500ml消化液完全混勻。2將混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小時(shí)。3孵育完成后，用100目的濾網(wǎng)過濾混合溶液。4將混合溶液以離心力400xg (轉(zhuǎn)速1500rpm) IOmin的條件下離心，去除上清。5用IOOml生理鹽水重懸沉淀細(xì)胞。6將純化液按每管15ml加到50ml離心管中，將第5步中的細(xì)胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg(轉(zhuǎn)速2000rpm), 20分鐘離心。5離心后，吸取中間層細(xì)胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C,離心力400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細(xì)胞兩次。6將洗后的細(xì)胞加到懸浮液中，備用。
正常參考值分離脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞活率>96%。注意事項(xiàng)
本品用于體外分離純化脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞； 操作前應(yīng)仔細(xì)閱讀使用說明書，嚴(yán)格按說明書的操作程序進(jìn)行； 各試劑使用前應(yīng)觀察有無渾濁，如有則應(yīng)更換試劑，嚴(yán)格控制每步離心的時(shí)間和溫度。
權(quán)利要求
1.一種用于體外分離脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞的試劑盒，包括各自隔離包裝的消化液、純化液和懸浮液，其中消化液是溶于生理鹽水的蛋白酶，其重量體積濃度為0. 25% ;純化液是溶于生理鹽水的聚蔗糖，其重量體積濃度為10% ;懸浮液是生理鹽水。
2.如權(quán)利要求I的試劑盒，其中所述的消化液、純化液和懸浮液各自獨(dú)立包裝。
3.如權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述的消化液純化液懸浮液的體積比為(20-1500) (10-45) 20。
4.如權(quán)利要求1-3的任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中所述試劑盒中還包括使用說明書，所述說明書載明了所述試劑盒的使用方法，所述方法包括如下步驟 (1)將抽取的500ml脂肪與500ml消化液完全混勻； (2)將混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小時(shí)； (3)孵育完成后，用100目的濾網(wǎng)過濾混合溶液； (4)將混合溶液以離心力400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm)IOmin的條件下離心，去除上清； (5)用IOOml生理鹽水重懸沉淀細(xì)胞； (6)將純化液按每管15ml加到50ml離心管中，將第5步中的細(xì)胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg(轉(zhuǎn)速2000rpm)，20分鐘離心； (7)離心后，吸取中間層細(xì)胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C，離心力400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細(xì)胞兩次； (8)將洗后的細(xì)胞加到懸浮液中，備用。
5.如權(quán)利要求1-4的試劑盒的使用方法，包括如下步驟 (1)將抽取的500ml脂肪與500ml消化液完全混勻； (2)將混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小時(shí)； (3)孵育完成后，用100目的濾網(wǎng)過濾混合溶液； (4)將混合溶液以離心力400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm)IOmin的條件下離心，去除上清； (5)用IOOml生理鹽水重懸沉淀細(xì)胞； (6)將純化液按每管15ml加到50ml離心管中，將第5步中的細(xì)胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4 °C，離心力710 X g (轉(zhuǎn)速2000rpm)，20分鐘離心； (7)離心后，吸取中間層細(xì)胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C，離心力400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細(xì)胞兩次； (8)將洗后的細(xì)胞加到懸浮液中，備用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離脂肪中無脂滴的有核細(xì)胞的試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒包括各自隔離包裝的消化液、純化液和懸浮液，其中消化液是溶于生理鹽水的蛋白酶，其重量體積濃度為0.25％；純化液是溶于生理鹽水的聚蔗糖，其重量體積濃度為10％；懸浮液是生理鹽水。本發(fā)明還涉及該試劑盒的使用方法。采用本發(fā)明的試劑盒從脂肪中分離純化干細(xì)胞干細(xì)胞活率高及回收率高。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK102747031SQ201110097318
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者蔡云松, 遲明國 申請人:北京同盛頤和生物科技有限公司