專利名稱：一種監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對(duì)于細(xì)胞增殖速度的有效和精確檢測(cè)具有廣泛用途和重要意義。例如，對(duì)抗癌藥物的篩選，在使用體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞時(shí)，通常使用MTT等細(xì)胞計(jì)數(shù)以及活細(xì)胞鏡檢計(jì)數(shù)等技術(shù)，統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量，然后做出變化曲線，從而判斷增殖速度的變化快慢。 當(dāng)進(jìn)行體內(nèi)成瘤分析時(shí)，是不可能針對(duì)同一個(gè)腫瘤結(jié)節(jié)進(jìn)行多次的細(xì)胞計(jì)數(shù)的?，F(xiàn)有的方法主要是通過測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)的直徑大小和數(shù)量，通過大量平行樣本的統(tǒng)計(jì)，來估算腫瘤的生長(zhǎng)體積變化，從而反映腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度變化。不但需要大量動(dòng)物和時(shí)間，也不夠精確。同時(shí)，這種整體性分析掩蓋了一個(gè)重要的現(xiàn)實(shí)，就是腫瘤細(xì)胞具有多樣性，有些細(xì)胞 (如腫瘤干細(xì)胞)可能是藥物不敏感的。因此，要能區(qū)分在藥物作用之下還依然能夠繼續(xù)增殖的細(xì)胞，分析它們的增殖變化才是評(píng)價(jià)藥物效果的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法。本發(fā)明所提供的輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法，包括如下步驟(1)用堿基類似物標(biāo)記待監(jiān)測(cè)細(xì)胞，標(biāo)記后的待監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)所有DNA雙鏈中的一條單鏈被標(biāo)記上所述堿基類似物，將標(biāo)記后的待監(jiān)測(cè)細(xì)胞記作未進(jìn)行細(xì)胞分裂的初始細(xì)胞；將標(biāo)記有堿基類似物的染色體記作標(biāo)記染色體；(2)按照如下1)或2)或3)所述方法確定初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；1)、觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中的每一個(gè)細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體，且單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量不能辨別，則觀察統(tǒng)計(jì)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體面積占單個(gè)子代細(xì)胞的細(xì)胞核面積的百分?jǐn)?shù)，記作面積百分比，當(dāng)所述面積百分比為71% -83%時(shí)，確定初始細(xì)胞候選分裂了一次，當(dāng)所述面積百分比為37% -53%時(shí)，確定初始細(xì)胞候選分裂了兩次；2)、觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中的每一個(gè)細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體，且單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量能夠辨別，則觀察統(tǒng)計(jì)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量，根據(jù)等式I得到初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；等式I :γ = -0. 51+6.93ΕΧΡ(-2.47Χ/Ν)，其中X表示單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量，Y表示初始細(xì)胞的分裂次數(shù)，N表示該種初始細(xì)胞的染色體總數(shù)；3)、觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中至少有一個(gè)細(xì)胞不含有標(biāo)記染色體，則觀察統(tǒng)計(jì)子代細(xì)胞中含有標(biāo)記染色體的細(xì)胞的數(shù)量占子代細(xì)胞中所有細(xì)胞數(shù)量的百分比，根據(jù)等式II得到初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；等式II :Υ = 0. 03+log2N+10. 12EXP (_2. 74X)，其中X表示所述百分比，Y表示初始細(xì)胞的分裂次數(shù)，N表示該種初始細(xì)胞的染色體總數(shù)；
所述初始細(xì)胞至少為一個(gè)；其中，所述觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體的方法包括如下步驟1)對(duì)所述子代細(xì)胞的標(biāo)記染色體進(jìn)行染色； 2)在步驟1)基礎(chǔ)上，觀察所述子代細(xì)胞中染色的標(biāo)記染色體。實(shí)際應(yīng)用時(shí)細(xì)胞或者組織切片經(jīng)過固定后直接染色就可以統(tǒng)計(jì)標(biāo)記染色體數(shù)。在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)等式計(jì)算出的結(jié)果可能是小數(shù)，如4. 1，此時(shí)可根據(jù)使用者的需求，自己定細(xì)胞分裂了 4次還是5次。用堿基類似物標(biāo)記待監(jiān)測(cè)細(xì)胞，標(biāo)記后的待監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)所有DNA雙鏈中的一條單鏈被標(biāo)記上所述堿基類似物，實(shí)際是利用DNA的半保留復(fù)制原理，在細(xì)胞分裂的S期，以堿基類似物為原料，進(jìn)行DNA合成，合成的DNA單鏈中即含有堿基類似物，從而所有DNA雙鏈中新合成的DNA單鏈被標(biāo)記堿基類似物。上述輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法中，所述進(jìn)行染色的方法包括如下步驟將所述子代細(xì)胞固定，再將一抗與所述固定后的細(xì)胞共同孵育，得到結(jié)合一抗的細(xì)胞；再將熒光染料標(biāo)記的二抗與所述結(jié)合一抗的細(xì)胞共同孵育，得到結(jié)合二抗的細(xì)胞；所述一抗為抗所述堿基類似物的IgG ；所述二抗為與所述一抗結(jié)合的抗體。上述輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法中，所述抗堿基類似物的IgG為小鼠抗堿基類似物的IgG ；所述二抗為驢抗小鼠的IgG ；所述熒光染料為FITC。本發(fā)明的另一目的是提供另一種輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法。本發(fā)明所提供的另一種輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法，包括如下步驟(1)用堿基類似物標(biāo)記待監(jiān)測(cè)細(xì)胞，標(biāo)記后的待監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)所有DNA雙鏈中的一條單鏈被標(biāo)記上所述堿基類似物，將標(biāo)記后的待監(jiān)測(cè)細(xì)胞記作未進(jìn)行細(xì)胞分裂的初始細(xì)胞；將標(biāo)記有堿基類似物的染色體記作標(biāo)記染色體；(2)按照如下1)或2)所述方法確定所述初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；1)、觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中的每一個(gè)細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體，則觀察統(tǒng)計(jì)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量，根據(jù)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量得出初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；2)、觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中至少有一個(gè)細(xì)胞不含有標(biāo)記染色體，則觀察統(tǒng)計(jì)子代細(xì)胞中含有標(biāo)記染色體的細(xì)胞的數(shù)量占子代細(xì)胞中所有細(xì)胞數(shù)量的百分比，根據(jù)所述百分比得出初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；所述初始細(xì)胞至少為一個(gè)。用堿基類似物標(biāo)記待監(jiān)測(cè)細(xì)胞，標(biāo)記后的待監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)所有DNA雙鏈中的一條單鏈被標(biāo)記上所述堿基類似物，實(shí)際是利用DNA的半保留復(fù)制原理，在細(xì)胞分裂的S期，以堿基類似物為原料，進(jìn)行DNA合成，合成的DNA單鏈中即含有堿基類似物，從而所有DNA雙鏈中新合成的DNA單鏈被標(biāo)記堿基類似物。上述另一種輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法中，所述步驟1)中，所述根據(jù)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量得出初始細(xì)胞的分裂次數(shù)的方法包括如下步驟將所述單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量代入等式I，得出初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；等式I :γ = -0. 51+6.93ΕΧΡ(-2.47Χ/Ν)，其中X表示單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量，Y表示初始細(xì)胞的分裂次數(shù)，N表示該種初始細(xì)胞的染色體總數(shù)；所述步驟2)中，根據(jù)所述百分比得出初始細(xì)胞的分裂次數(shù)的方法包括如下步驟 將所述百分比代入等式II，得出初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；等式II =Y = 0 . 03+log2N+10. 12EXP (-2. 74X)，其中X表示所述百分比，Y表示初始細(xì)胞的分裂次數(shù)，N表示該種初始細(xì)胞的染色體總數(shù)。在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)等式計(jì)算出的結(jié)果可能是小數(shù)，如4. 1，此時(shí)可根據(jù)使用者的需求，自己定細(xì)胞分裂了 4次還是5次。上述兩種輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法中，所述堿基類似物為胸腺嘧啶類似物、 腺嘌呤類似物、鳥嘌呤類似物、胞嘧啶類似物或尿嘧啶類似物；所述胸腺嘧啶類似物為 CldU, IdU、BrdU, EdU 或 H3_thymidine。上述兩種輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法中，所述用堿基類似物標(biāo)記待監(jiān)測(cè)細(xì)胞的方法包括如下步驟將處于有絲分裂中期的母細(xì)胞接于用于培養(yǎng)母細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中， 再向其中加入所述堿基類似物，培養(yǎng)至母細(xì)胞完成有絲分裂得到子細(xì)胞，所述子細(xì)胞即為所述待監(jiān)測(cè)細(xì)胞。上述兩種輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法中，所述待監(jiān)測(cè)細(xì)胞為植物細(xì)胞或離體的動(dòng)物細(xì)胞；上述兩種輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法中，所述離體的動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選為CHO細(xì)胞。上述兩種輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法中，所述細(xì)胞分裂為有絲分裂。上述兩種輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法中，所述分裂的次數(shù)為1-9次或1-5次或 2-5 次。上述任一所述輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法在輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞的增值速度中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法在篩選藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述在輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞的增值速度中的應(yīng)用在篩選藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述方法或應(yīng)用中，所述藥物可為抗腫瘤的藥物等。本發(fā)明的理論基礎(chǔ)本發(fā)明基于下述重要實(shí)驗(yàn)判斷1、BrdU等胸腺嘧啶類似物， 能夠摻入細(xì)胞新合成的DNA中，并長(zhǎng)期存留，2、在合適劑量下，對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響， 3、基于DNA的半保留復(fù)制和染色體的隨機(jī)對(duì)稱分配原則，被標(biāo)記的染色體將隨著細(xì)胞增殖分裂而逐代減半，4、摻入的標(biāo)記物通過對(duì)應(yīng)的熒光抗體可以識(shí)別，5、染色質(zhì)在間期(實(shí)際應(yīng)用中95%以上的細(xì)胞都處于細(xì)胞周期的間期)細(xì)胞核中各自占據(jù)獨(dú)立分隔的空間，因此標(biāo)記染色體的數(shù)量是可以計(jì)數(shù)的。因此，只需要通過最終一幅熒光圖像，計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)被標(biāo)記的染色體數(shù)量，就能夠計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞從標(biāo)記時(shí)刻以來所經(jīng)歷的增殖代次，并進(jìn)而可以提供增殖不同代次細(xì)胞的“地圖”。本發(fā)明提供了一種利用核苷酸類似物在活體細(xì)胞標(biāo)記DNA，經(jīng)過設(shè)定時(shí)間段后，通過直接計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)存留的標(biāo)記染色體數(shù)量來判斷各細(xì)胞所經(jīng)歷的增殖代次的技術(shù)方法，提供細(xì)胞增殖速度改變的時(shí)間和空間規(guī)律。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明方法的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在整個(gè)追蹤期間除了常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物飼養(yǎng)和最終的細(xì)胞染色操作外，無(wú)須額外操作。因此，本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力。本發(fā)明方法既可以觀察單一初始細(xì)胞的分裂次數(shù)，又可同時(shí)觀察多個(gè)初始細(xì)胞的平均分裂次數(shù)，既可實(shí)現(xiàn)對(duì)體外細(xì)胞分裂次數(shù)的監(jiān)測(cè)，又可以實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞分裂次數(shù)的監(jiān)測(cè)，因此可滿足不同的實(shí)際需要。具體地，可同時(shí)獲得不同組織或區(qū)域內(nèi)細(xì)胞增殖代次數(shù)據(jù)，例如癌與癌旁；具有自身對(duì)照，可在同一動(dòng)物中獲得不同階段增殖速度的比較數(shù)據(jù)，例如給藥前后。當(dāng)將本發(fā)明方法用于利用動(dòng)物進(jìn)行藥物篩選時(shí)，不須按時(shí)間點(diǎn)多次重復(fù)取樣，節(jié)省大量動(dòng)物(這是抗癌等藥物篩選的最大成本之一)，理論上只需一只動(dòng)物樣品，不須通過大量樣本的統(tǒng)計(jì)平均，可以針對(duì)每一個(gè)細(xì)胞直接確定其分裂次數(shù)。本發(fā)明方法還具有開發(fā)成自動(dòng)計(jì)數(shù)、自動(dòng)比較分析技術(shù)的潛力。


圖1 :CH0子代細(xì)胞在12h-60h中BrdU標(biāo)記的中期染色體鑒定。左側(cè)是BrdU染色 (綠色，F(xiàn)ITC)，中間是DNA染色(紅色，PI)，右側(cè)是疊加結(jié)果。圖2 =CHO子代細(xì)胞在12h-60h中BrdU標(biāo)記的染色單體百分比。圖中每個(gè)圓圈代表1個(gè)細(xì)胞，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)15個(gè)細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)方差。圖3 :CH0子代細(xì)胞在60h-108h中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)1000 個(gè)細(xì)胞，重復(fù)5次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)方差。圖4 =CHO子代細(xì)胞在12h和24h中BrdU陽(yáng)性的染色面積在細(xì)胞核面積中的百分比。圖中每個(gè)圓圈代表1個(gè)細(xì)胞，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)20個(gè)細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)方差。圖5 =CHO細(xì)胞的第1至5代的子代細(xì)胞中BrdU標(biāo)記染色體鑒定。其中第2代細(xì)胞的標(biāo)記染色體具有兩種不同的染色形態(tài)。第一種是斑塊型，如圖2中2nd-l，只能通過計(jì)算面積分析代次。第二種是散點(diǎn)型，如圖2中2nd-l，可以通過統(tǒng)計(jì)標(biāo)記染色體數(shù)來計(jì)算代次。左側(cè)是BrdU染色(綠色，F(xiàn)ITC)，中間是DNA染色(藍(lán)色，DAPI)，右側(cè)是疊加結(jié)果。圖6 肝細(xì)胞的第1至4代的子代細(xì)胞中BrdU標(biāo)記染色體鑒定。其中第2代細(xì)胞的標(biāo)記染色體具有兩種不同的染色形態(tài)。第一種是斑塊型，如圖2中2nd-l，只能通過計(jì)算面積分析代次。第二種是散點(diǎn)型，如圖2中2nd-l，可以通過統(tǒng)計(jì)標(biāo)記染色體數(shù)來計(jì)算代次。 左側(cè)是BrdU染色(綠色，F(xiàn)ITC)，中間是DNA染色(藍(lán)色，DAPI)，右側(cè)是疊加結(jié)果。圖7 針對(duì)肝再生第一階段增殖的肝細(xì)胞的代次作圖分析。左圖是BrdU染色(綠色，F(xiàn)ITC)。右圖是BrdU染色(綠色，F(xiàn)ITC)和DNA染色(藍(lán)色，DAPI)的疊加結(jié)果。下圖是根據(jù)左圖和右圖建立的肝細(xì)胞代次圖，其中紫色代表第一代細(xì)胞，藍(lán)色代表第二代細(xì)胞， 青色第三代細(xì)胞，綠色代表第四代細(xì)胞，空白代表非肝再生第一階段增殖的細(xì)胞和部分在樣品切片時(shí)細(xì)胞核破損的標(biāo)記細(xì)胞。圖8 每個(gè)子代細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體時(shí)的標(biāo)記染色體數(shù)量與細(xì)胞分裂次數(shù)的擬
合曲線。圖9 出現(xiàn)子代細(xì)胞不含有標(biāo)記染色體時(shí)的含有標(biāo)記染色體的子代細(xì)胞數(shù)量占所有子代細(xì)胞數(shù)量的百分比與細(xì)胞分裂次數(shù)的擬合曲線。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)設(shè)置的思路將初始CHO細(xì)胞進(jìn)行BrdU標(biāo)記，標(biāo)記后的細(xì)胞記作已經(jīng)分裂0次的初始細(xì)胞，即第0代細(xì)胞，此時(shí)間點(diǎn)記作第0小時(shí)；然后在如下時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)BrdU標(biāo)記的染色體，從而確定初始細(xì)胞的分裂次數(shù)第12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48 小時(shí)、60小時(shí)、72小時(shí)、84小時(shí)、96小時(shí)、108小時(shí)。若本發(fā)明方法的檢測(cè)結(jié)果與理論推測(cè)結(jié)果吻合，則證明本發(fā)明方法正確。實(shí)施例1、監(jiān)測(cè)體外細(xì)胞分裂次數(shù)的方法一、材料1. BrdU(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)2.小鼠抗 BrdU 的 IgG(Becton Dickinson, San Jose, CA)3. FITC 偶聯(lián)的驢抗小鼠的 IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)4. DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)5. PI (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)6. o-Phenylenediamine (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)7.Dulbecco' s modified Eagle' s medium(DMEM, Gibco, Long Island, NY)8. Fetal Bovine Serum(Gibco, New Zealand)9. CHO細(xì)胞系購(gòu)自ATCC，產(chǎn)品目錄號(hào)為CCL-61。10.多聚甲醛(Sigma-Aldrich，St. Louis, M0)二、CHO細(xì)胞在各監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)的理論分裂次數(shù)CHO細(xì)胞周期約12小時(shí)；CHO細(xì)胞的總?cè)旧w數(shù)量為19 (N = 19)。將待檢測(cè)細(xì)胞記作已經(jīng)分裂O次的第O代細(xì)胞，此第O代細(xì)胞所處的時(shí)間點(diǎn)記作分裂次數(shù)監(jiān)測(cè)過程的第O小時(shí)。那么從理論上得出從第O小時(shí)計(jì)起，在第12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)、72小時(shí)、84小時(shí)、96小時(shí)、108小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，待檢測(cè)細(xì)胞(第 0代細(xì)胞)的分裂次數(shù)理論上應(yīng)分別是第1次、第2次、第3次、第4次、第5次、第6次、第 7次、第8次、第9次。三、構(gòu)建標(biāo)記染色體數(shù)量與細(xì)胞分裂次數(shù)的關(guān)系等式，以及標(biāo)記細(xì)胞比例與細(xì)胞分裂次數(shù)的關(guān)系等式1、染色體標(biāo)記1) CHO細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37°C培養(yǎng)。2)第一次拍落中期細(xì)胞。當(dāng)CHO細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋70%附著表面時(shí)，輕拍細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁，每瓶100次，震落中期細(xì)胞(通常稱為Mitotic shaking)。3)迅速收集懸浮有中期細(xì)胞的培養(yǎng)上清，于IOOOrpm離心5分鐘收集細(xì)胞。4)BrdU標(biāo)記。吸棄上清后用DMEM培養(yǎng)基輕吹沉淀的細(xì)胞團(tuán)，均勻重懸，將重懸的中期細(xì)胞接種到新的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入BrdU至終濃度 10uM，避光培養(yǎng)一個(gè)細(xì)胞周期時(shí)長(zhǎng)12小時(shí)。
5)第二次拍落中期細(xì)胞。當(dāng)BrdU標(biāo)記12小時(shí)后，輕拍細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁，每瓶100 次，震落中期細(xì)胞。6)迅速收集懸浮有中期細(xì)胞的培養(yǎng)上清，于IOOOrpm離心5分鐘收集細(xì)胞。此步驟重復(fù)3次以充分去除剩余的BrdU。每次吸棄上清后用DMEM培養(yǎng)基輕吹沉淀的細(xì)胞團(tuán)，均勻重懸后再次離心收集。7)取新的細(xì)胞培養(yǎng)皿加入細(xì)胞培養(yǎng)玻片，將離心收集的中期細(xì)胞均勻分散在玻片上，避光培養(yǎng)約2小時(shí)。此時(shí)中期細(xì)胞已經(jīng)貼壁并且完成分裂進(jìn)入Gl期，所有細(xì)胞的DNA 雙鏈中的一條單鏈已經(jīng)被完整復(fù)制并且充分標(biāo)記有BrdU。將此時(shí)的細(xì)胞記作已經(jīng)分裂0次的初始細(xì)胞，即第0代細(xì)胞，此時(shí)間點(diǎn)記作監(jiān)測(cè)過程的第0小時(shí)。2、觀察細(xì)胞分裂情況 在如下時(shí)間點(diǎn)(從第0小時(shí)計(jì)起，第12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí))，
觀察初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量。在如下時(shí)間點(diǎn) (從第0小時(shí)計(jì)起，第60小時(shí)、72小時(shí)、84小時(shí)、96小時(shí)、108小時(shí))，觀察統(tǒng)計(jì)子代細(xì)胞中含有標(biāo)記染色體的細(xì)胞的數(shù)量占子代細(xì)胞中所有細(xì)胞數(shù)量的百分比。其中，所述觀察統(tǒng)計(jì)方法包括如下步驟1)對(duì)所述子代細(xì)胞的標(biāo)記染色體進(jìn)行染色；2)在步驟1)基礎(chǔ)上，觀察所述子代細(xì)胞中染色的標(biāo)記染色體。其中染色等方法如下2-1 中期染色體鋪片1)根據(jù)CHO細(xì)胞周期約12小時(shí)，從第0小時(shí)計(jì)起，在第12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、 48小時(shí)、60小時(shí)，分別拍落細(xì)胞。2)將拍落收集的中期細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1. 5ml EP管中，加入PBS后IOOOrpm離心5分
鐘，棄盡上清，重復(fù)洗三次。3)逐滴加入Iml 37°C預(yù)熱的低滲液(0. 075mol/L KCl水溶液)，立即輕搖混勻，置于37°C水浴鍋內(nèi)作用20min，期間輕混。4)立即加入0. 5ml現(xiàn)配的固定劑(甲醇乙酸=3 1，體積比)混勻，室溫 (250C )作用lmin，800rpm離心IOmin收集細(xì)胞。棄盡上清，5)加入固定劑Iml重懸細(xì)胞，室溫作用lh，期間輕混。取出-20°C預(yù)冷的載玻片，以45°C角放置。調(diào)整細(xì)胞密度后，將細(xì)胞懸液從高度 1. 5m處逐滴滴落至載玻片上，自然干燥，4°C保存。2-2 染色方法1)根據(jù)CHO細(xì)胞周期約12小時(shí)，從第0小時(shí)計(jì)起，在第60小時(shí)、72小時(shí)、84小時(shí)、 96小時(shí)、108小時(shí)，分別將待檢測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)玻片置于PBS洗3次，每次5分鐘，然后置于預(yù)冷的4%多聚甲醛，于4°C固定30分鐘。2)取出細(xì)胞培養(yǎng)玻片或上述4°C保存的中期染色體鋪片，PBS洗3次，每次5分鐘。3)置于現(xiàn)配的2M Hcl中，于37°C水浴中作用30分鐘。4) PBS洗3次，每次10分鐘。5)加入封閉液，置于濕盒內(nèi)37 V封閉1小時(shí)。封閉液將5mg BSA、Img TritonXlOOUmg Tween20和PBS緩沖液混合，用PBS緩沖液定容至1升，得到的混合溶液即為封閉液。 6)吸棄封閉液，加入一抗(小鼠抗BrdU的IgG)，經(jīng)封閉液稀釋至工作濃度Iug/ ml，置于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。7)PBS洗3次，每次10分鐘。8)加入二抗(FITC偶聯(lián)的驢抗小鼠的IgG)，經(jīng)封閉液稀釋至工作濃度lOug/ml，置于濕盒內(nèi)37°C避光孵育1小時(shí)。9) PBS洗3次，每次10分鐘。10)加入DAPI或者PI，工作濃度lug/ml，室溫避光孵育5分鐘。11) PBS洗3次，每次10分鐘。12)加入含0. 5% o-Phenylenediamine和90%甘油的PBS，指甲油封片，避光保存。2-3、統(tǒng)計(jì)方法照相方法使用普通熒光顯微鏡。本實(shí)驗(yàn)中采用Carl Zeiss公司的倒置熒光顯微鏡(Axio Observer Zl)和激光共聚焦顯微鏡(LSM 700)。物鏡配置Plan-Neofluar 40Xoil (N. Α. 1. 30)和 Plan-Neofluar 63Χ oil (N. Α. 1. 40)，光學(xué)切片厚度 0. 5um。采用Origins. O軟件統(tǒng)計(jì)如下數(shù)量單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體面積占細(xì)胞核面積的百分?jǐn)?shù)、單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量、子代細(xì)胞中含有標(biāo)記染色體的細(xì)胞的數(shù)量占子代細(xì)胞中所有細(xì)胞數(shù)量的百分比。3、觀察結(jié)果及關(guān)系等式CHO細(xì)胞共有19條染色體，當(dāng)細(xì)胞分裂一次和兩次后，由于單個(gè)細(xì)胞內(nèi)剩余的標(biāo)記染色體數(shù)依然較多，大多數(shù)情況下觀察到的是細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)區(qū)域化的染色斑塊，尚未出現(xiàn)散點(diǎn)狀的清晰獨(dú)立的單個(gè)標(biāo)記染色體，因此無(wú)法準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)出標(biāo)記染色體數(shù)量。但可以統(tǒng)計(jì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)染色的標(biāo)記染色體面積占細(xì)胞核面積的百分?jǐn)?shù)。并且通過大量的細(xì)胞觀察顯示，第一次有絲分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中染色的標(biāo)記染色體面積占細(xì)胞核面積的百分?jǐn)?shù)均在 71% -83%之間；第二次有絲分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中染色的標(biāo)記染色體面積占細(xì)胞核面積的百分?jǐn)?shù)均在37% -53%之間(圖4)。從第0小時(shí)計(jì)起，第60小時(shí)內(nèi)，都觀察到由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的每一個(gè)子代細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體；且在第12小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)，48小時(shí)、60小時(shí)，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記的染色體會(huì)隨細(xì)胞分裂而逐代遞減，子代單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量占細(xì)胞內(nèi)所有染色體數(shù)量的百分比如圖2和圖1所示。其中，第12小時(shí)平均有13. 3條標(biāo)記染色體，第24小時(shí)平均有8. 2條標(biāo)記染色體，第36小時(shí)平均有5. 2條標(biāo)記染色體，第48小時(shí)平均有3. 1條標(biāo)記染色體，第60小時(shí)平均有2. 1條標(biāo)記染色體，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量符合指數(shù)衰減趨勢(shì)，即符合指數(shù)衰減等式Y(jié) = Y0+AXEXP(R0XX)。從第0小時(shí)計(jì)起，在第72小時(shí)觀察到由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中出現(xiàn)不含有標(biāo)記染色體的細(xì)胞；在第60小時(shí)、72小時(shí)、84小時(shí)，96小時(shí)、108小時(shí)檢測(cè)到的由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的含有標(biāo)記染色體的細(xì)胞的數(shù)量占子代細(xì)胞中所有細(xì)胞數(shù)量的百分比依次分別為100%、59% 士5%、50% 士4%、39% 士5%、27% 士3% (圖 3)，也符合指數(shù)衰減等式Y(jié) = Y0+AXEXP(R0XX)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果擬合回歸曲線。
擬合結(jié)果如下當(dāng)子代細(xì)胞中的每一個(gè)細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體，且單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量能夠辨別時(shí)，使用等式I ；擬合回歸曲線如圖8所示。當(dāng)子代細(xì)胞中至少有一個(gè)細(xì)胞不含有標(biāo)記染色體，使用等式II ；擬合回歸曲線如圖9所示。等式I :γ = -0. 51+6.93ΕΧΡ(_2.47Χ/Ν)，其中X表示單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量，Y表示初始細(xì)胞的分裂次數(shù)，N表示該種初始細(xì)胞的染色體總數(shù)；等式II =Y = 0. 03+log2N+10. 12EXP (_2. 74X)，其中X表示所述百分比，Y表示初始細(xì)胞的分裂次數(shù)，N表示該種初始細(xì)胞的染色體總數(shù)。四、本發(fā)明方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)
每個(gè)物種的染色體數(shù)量都是常見的基本信息資料，可以通過美國(guó)的國(guó)家生物技術(shù)信息中心National Center for Biotechnology Information (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)查詢。由于不同種類的人類腫瘤細(xì)胞的染色體數(shù)量差異非常大，例如Hela細(xì)胞有 60-70條，所以也可以通過中期染色體分離后計(jì)數(shù)的方法統(tǒng)計(jì)出初始細(xì)胞的染色體數(shù)量。(一)本發(fā)明方法步驟(1)用BrdU標(biāo)記CHO細(xì)胞，標(biāo)記后的CHO細(xì)胞內(nèi)所有DNA雙鏈中的一條單鏈被標(biāo)記上BrdU ；此標(biāo)記細(xì)胞定義為未進(jìn)行細(xì)胞分裂的初始細(xì)胞，即第0代細(xì)胞；將標(biāo)記有BrdU 的染色體定義為標(biāo)記染色體；將初始細(xì)胞所處的時(shí)間點(diǎn)記作監(jiān)測(cè)過程的第0小時(shí)；(2)在如下時(shí)間點(diǎn)(從第0小時(shí)計(jì)起，第12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)、72小時(shí)、84小時(shí)、96小時(shí)、108小時(shí))，觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，按照如下1)或2)或3)所述方法確定初始細(xì)胞的分裂次數(shù)1)、觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中的每一個(gè)細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體，且單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量不能辨別，則統(tǒng)計(jì)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體面積占單個(gè)子代細(xì)胞的細(xì)胞核面積的百分?jǐn)?shù)，記作面積百分比，當(dāng)所述面積百分比為77% 士6%時(shí)，確定初始細(xì)胞分裂了 1次，當(dāng)所述面積百分比為45% 士8% 時(shí)，確定初始細(xì)胞分裂了 2次；2)、觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中的每一個(gè)細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體，且單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量能夠辨別，則統(tǒng)計(jì)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量，根據(jù)等式I得到初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；等式I :γ = -0. 51+6.93ΕΧΡ(_2.47Χ/Ν)，其中X表示單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量，Y表示初始細(xì)胞的分裂次數(shù)，N表示該種初始細(xì)胞的染色體總數(shù)；3)、觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中至少有一個(gè)細(xì)胞不含有標(biāo)記染色體，則統(tǒng)計(jì)子代細(xì)胞中含有標(biāo)記染色體的細(xì)胞的數(shù)量占子代細(xì)胞中所有細(xì)胞數(shù)量的百分比，根據(jù)等式II得到初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；等式II =Y = 0. 03+log2N+10. 12EXP (_2. 74X)，其中X表示所述百分比，Y表示初始細(xì)胞的分裂次數(shù)，N表示該種初始細(xì)胞的染色體總數(shù)。其中，觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體的方法包括如下步驟1)對(duì)所述子代細(xì)胞的標(biāo)記染色體進(jìn)行染色；
2)在步驟1)基礎(chǔ)上，觀察所述子代細(xì)胞中染色的標(biāo)記染色體。( 二)本發(fā)明方法中所用的具體實(shí)驗(yàn)方法1、染色體的體外標(biāo)記方法(兩次拍落標(biāo)記法)1)CH0細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37°C培
養(yǎng)。 2)第一次拍落中期細(xì)胞。當(dāng)CHO細(xì)胞培養(yǎng)至70%愈合度時(shí)，輕拍細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁， 每瓶100次，震落中期細(xì)胞。3)迅速收集懸浮有中期細(xì)胞的培養(yǎng)上清，于IOOOrpm離心5分鐘收集細(xì)胞。4)BrdU標(biāo)記。吸棄上清后用DMEM培養(yǎng)基輕吹沉淀的細(xì)胞團(tuán)，均勻重懸，將重懸的中期細(xì)胞接種到新的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入BrdU至終濃度 10uM，避光培養(yǎng)一個(gè)細(xì)胞周期時(shí)長(zhǎng)12小時(shí)。5)第二次拍落中期細(xì)胞。當(dāng)BrdU標(biāo)記12小時(shí)后，輕拍細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁，每瓶100 次，震落中期細(xì)胞。6)迅速收集懸浮有中期細(xì)胞的培養(yǎng)上清，于IOOOrpm離心5分鐘收集細(xì)胞。此步驟重復(fù)3次以充分去除剩余的BrdU。每次吸棄上清后用DMEM培養(yǎng)基輕吹沉淀的細(xì)胞團(tuán)，均勻重懸后再次離心收集。7)取新的細(xì)胞培養(yǎng)皿加入細(xì)胞培養(yǎng)玻片，將離心收集的中期細(xì)胞均勻分散在玻片上，避光培養(yǎng)約2小時(shí)。此時(shí)中期細(xì)胞已經(jīng)貼壁并且完成分裂進(jìn)入Gl期，所有細(xì)胞的DNA 雙鏈中的一條單鏈已經(jīng)被完整復(fù)制并且充分標(biāo)記有BrdU。將此時(shí)的細(xì)胞記作已經(jīng)分裂0次的初始細(xì)胞，即第0代細(xì)胞，此時(shí)間點(diǎn)記作監(jiān)測(cè)過程的第0小時(shí)。2、染色方法1)將待檢測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)玻片于PBS洗3次，每次5分鐘，然后置于預(yù)冷的4%多聚甲醛，于4°C固定30分鐘。2)取出細(xì)胞培養(yǎng)玻片，PBS洗3次，每次5分鐘。3)置于現(xiàn)配的2M Hcl中，于37°C水浴中作用30分鐘。4) PBS洗3次，每次10分鐘。5)加入封閉液，置于濕盒內(nèi)37 V封閉1小時(shí)。封閉液將5mg BSA、Img TritonXlOOUmg Tween20和PBS緩沖液混合，用PBS緩沖液定容至1升，得到的混合溶液即為封閉液。6)吸棄封閉液，加入一抗(小鼠抗BrdU的IgG)，經(jīng)封閉液稀釋至工作濃度Iug/ ml，置于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。7) PBS洗3次，每次10分鐘。8)加入二抗(FITC偶聯(lián)的驢抗小鼠的IgG)，經(jīng)封閉液稀釋至工作濃度lOug/ml，置于濕盒內(nèi)37°C避光孵育1小時(shí)。9)PBS洗3次，每次10分鐘。10)加入DAPI或者PI，工作濃度lug/ml，室溫避光孵育5分鐘。11) PBS洗3次，每次10分鐘。12)加入含0. 5% o-Phenylenediamine和90%甘油的PBS，指甲油封片，避光保存。
3、統(tǒng)計(jì)方法照相方法使用普通熒光顯微鏡。本實(shí)驗(yàn)中采用Carl Zeiss公司的倒置熒光顯微鏡(Axio Observer Zl)和激光共聚焦顯微鏡(LSM 700)。物鏡配置Plan-Neofluar 40Xoil (N. Α. 1. 30)和 Plan-Neofluar 63Χ oil (N. Α. 1. 40)，光學(xué)切片厚度 0. 5um。采用Origins. O軟件統(tǒng)計(jì)如下數(shù)量統(tǒng)計(jì)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體面積占單個(gè)子代細(xì)胞的細(xì)胞核面積的百分?jǐn)?shù)、統(tǒng)計(jì)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量、統(tǒng)計(jì)子代細(xì)胞中含有標(biāo)記染色體的細(xì)胞的數(shù)量占子代細(xì)胞中所有細(xì)胞數(shù)量的百分比。(三)本發(fā)明方法的結(jié)果 1、第1次和第2次分裂結(jié)果從第O小時(shí)計(jì)起，第24小時(shí)內(nèi)，都觀察到由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的每一個(gè)子代細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體并且單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量不能辨別 (圖 5)；從第O小時(shí)計(jì)起，第12小時(shí)時(shí)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體面積占單個(gè)子代細(xì)胞的細(xì)胞核面積的百分?jǐn)?shù)為83%，在71% -83%之間，表明初始細(xì)胞分裂了 1次；從第O小時(shí)計(jì)起，第24小時(shí)時(shí)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體面積占單個(gè)子代細(xì)胞的細(xì)胞核面積的百分?jǐn)?shù)為51%，在37% -53%之間，表明初始細(xì)胞分裂了 2次；結(jié)果與理論分析相符，表明本發(fā)明方法結(jié)果準(zhǔn)確。2、第3次至第5次分裂第O小時(shí)計(jì)起，第36小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)，都觀察到由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的每一個(gè)子代細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體，并且在第36小時(shí)，48小時(shí)、60小時(shí)時(shí)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量能夠辨別(圖5)；在第36小時(shí)，48小時(shí)、60小時(shí)時(shí)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量分別為5、3、 2，代入等式I，得到三個(gè)時(shí)刻的初始細(xì)胞的分裂次數(shù)為3. 2,4. 2,4. 8，即初始細(xì)胞在第36小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)時(shí)，初始細(xì)胞的分裂次數(shù)依次為3次、4次、5次。結(jié)果與理論分析相符，表明本發(fā)明方法結(jié)果準(zhǔn)確。3、第6次至第9次分裂從第0小時(shí)計(jì)起，在第72小時(shí)觀察到由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中出現(xiàn)不含有標(biāo)記染色體的細(xì)胞；在第60小時(shí)、72小時(shí)、84小時(shí)，96小時(shí)、108小時(shí)檢測(cè)到的由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的含有標(biāo)記染色體的細(xì)胞的數(shù)量占子代細(xì)胞中所有細(xì)胞數(shù)量的百分比依次分別為100%、59% 士5%、50% 士4%、39% 士5%、27% 士3%。得出在第72小時(shí)、84小時(shí)、96小時(shí)、108小時(shí)時(shí)，初始細(xì)胞的分裂次數(shù)依次為6次、 7次、8次、9次。結(jié)果與理論分析相符，表明本發(fā)明方法結(jié)果準(zhǔn)確。實(shí)施例2、監(jiān)測(cè)體內(nèi)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法材料1. BrdU(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)2.小鼠抗 BrdU 的 IgG(Becton Dickinson, San Jose, CA)3. FITC 偶聯(lián)的驢抗小鼠的 IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)4. DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)
5. η-propyl gallate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)6. SD 品系大鼠(Vital River Laboratories, Beijing)7.多聚甲醛(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)8.多聚賴氨酸(Sigma-Aldrich，St. Louis, MO)
9.冰凍切片機(jī)(Leica 3050S)肝再生背景已知肝細(xì)胞在正常情況下幾乎全部處于細(xì)胞周期的非增殖的靜止?fàn)顟B(tài)(G0期)，肝切除后將開始啟動(dòng)代償性增殖，大鼠肝再生持續(xù)7天，之后再生肝臟將恢復(fù)到手術(shù)前的重量，肝細(xì)胞停止增殖并重新回到靜止?fàn)顟B(tài)。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，肝切除后12h開始有肝細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期(S期)，24h達(dá)到高峰，30h降至12h水平。因此12h_30h是肝細(xì)胞增殖的第一個(gè)完整階段，在12h-30h進(jìn)行連續(xù)BrdU標(biāo)記，將能夠完整的標(biāo)記所有在此階段增殖細(xì)胞的全部染色體。根據(jù)等式I，大鼠肝細(xì)胞共有42條染色體。當(dāng)N = 42時(shí)，肝細(xì)胞第一至五代的標(biāo)記染色體的平均數(shù)量分別是28，19，12，7，4。按照實(shí)施例1中所述方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。不同的是體內(nèi)標(biāo)記方法不同。1、體內(nèi)標(biāo)記方法1)大鼠2/3肝切除手術(shù)(PHx)。按照Higgins (1931)方法，SD品系大鼠在上午 9:00-10:00之間手術(shù)。首先將大鼠用乙醚麻醉后，在胸骨劍突下方約Icm處縱向打開腹腔， 暴露出肝臟的中葉和左葉，約占肝臟自身重量的2/3，然后用醫(yī)用縫合線結(jié)扎其基部后完全切除，最后縫合關(guān)閉腹腔。此時(shí)即為術(shù)后Oh。2)術(shù)后12h開始給予BrdU標(biāo)記，腹腔注射，5mg/kg。已有文獻(xiàn)報(bào)道BrdU進(jìn)入體內(nèi) Ih后將從血液系統(tǒng)完全清除，為了盡可能充分標(biāo)記，從12h開始每3h給予一次腹腔注射， 5mg/kg，直到30h完成最后一次標(biāo)記，共標(biāo)記7次。完成標(biāo)記7次的細(xì)胞記作初始細(xì)胞。3)30h完成最后一次標(biāo)記之后大鼠正常飼養(yǎng)至術(shù)后第七天(168h)處死，取出肝臟置于4%多聚甲醛固定8h。4)冰凍切片。本例中考慮到肝細(xì)胞的細(xì)胞核在15um左右，為了盡可能保留完整的細(xì)胞核即保留所有的染色體，切片厚度20um。玻片提前經(jīng)過1 %多聚賴氨酸包被，防止切片脫落。2、染色方法、照相方法和統(tǒng)計(jì)分析方法與實(shí)施例1中所述一致。3、結(jié)果檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。結(jié)果觀察到如下4種細(xì)胞第一種細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量不能辨別，單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體面積占單個(gè)子代細(xì)胞的細(xì)胞核面積的百分?jǐn)?shù)為83%在71% -83%之間，表明初始細(xì)胞分裂了 1 次；第二種細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量不能辨別，單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體面積占單個(gè)子代細(xì)胞的細(xì)胞核面積的百分?jǐn)?shù)為51%在37% -53%之間，表明初始細(xì)胞分裂了 2 次；第三種細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量能辨別，細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量為12，代入等式I，得到其分裂次數(shù)為2. 9，即初始細(xì)胞分裂了 3次；
第四種細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量能辨別，細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量為6，代入等式I，得到其分裂次數(shù)為4. 4，即初始細(xì)胞分裂了 4次；結(jié)果顯示(圖6)，肝細(xì)胞的分裂速度并不同步， 共有四種不同代次的細(xì)胞，有的細(xì)胞分裂了 1次，有的細(xì)胞分裂了 2次，有的細(xì)胞分裂了 3次，有的細(xì)胞分裂了 4次。沒有觀察到更多的分裂代次，是因?yàn)楦吻谐蟾渭?xì)胞的增殖在7天后結(jié)束，進(jìn)入靜止期不在增殖。左圖是BrdU染色(綠色，F(xiàn)ITC)。右圖是BrdU染色(綠色，F(xiàn)ITC)和DNA染色(藍(lán)色，DAPI)的疊加結(jié)果。下圖是根據(jù)左圖和右圖建立的肝細(xì)胞代次圖，其中紫色(編號(hào)1) 代表第一代細(xì)胞，深藍(lán)色(編號(hào)2)代表第二代細(xì)胞，淺藍(lán)色(編號(hào)3)第三代細(xì)胞，綠色代 (編號(hào)4)表第四代細(xì)胞，空白代表非肝再生第一階段增殖的細(xì)胞和部分在樣品切片時(shí)細(xì)胞核破損的標(biāo)記細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法，包括如下步驟(1)用堿基類似物標(biāo)記待監(jiān)測(cè)細(xì)胞，標(biāo)記后的待監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)所有DNA雙鏈中的一條單鏈被標(biāo)記上所述堿基類似物，將標(biāo)記后的待監(jiān)測(cè)細(xì)胞記作未進(jìn)行細(xì)胞分裂的初始細(xì)胞；將標(biāo)記有堿基類似物的染色體記作標(biāo)記染色體；(2)按照如下1)或2)或3)所述方法確定初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；1)、觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中的每一個(gè)細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體，且單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量不能辨別，則觀察統(tǒng)計(jì)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體面積占單個(gè)子代細(xì)胞的細(xì)胞核面積的百分?jǐn)?shù)，記作面積百分比， 當(dāng)所述面積百分比為71% -83%時(shí)，確定初始細(xì)胞候選分裂了一次，當(dāng)所述面積百分比為 37% -53%時(shí)，確定初始細(xì)胞候選分裂了兩次；2)、觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中的每一個(gè)細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體，且單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量能夠辨別，則觀察統(tǒng)計(jì)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量，根據(jù)等式I得到初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；等式I :Y = -0. 51+6. 93ΕΧΡ(-2. 47Χ/Ν)，其中X表示單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量，Y表示初始細(xì)胞的分裂次數(shù)，N表示該種初始細(xì)胞的染色體總數(shù)；3)、觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中至少有一個(gè)細(xì)胞不含有標(biāo)記染色體，則觀察統(tǒng)計(jì)子代細(xì)胞中含有標(biāo)記染色體的細(xì)胞的數(shù)量占子代細(xì)胞中所有細(xì)胞數(shù)量的百分比，根據(jù)等式II得到初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；等式II =Y = 0. 03+log2N+10. 12EXP (-2. 74X)，其中X表示所述百分比，Y表示初始細(xì)胞的分裂次數(shù)，N表示該種初始細(xì)胞的染色體總數(shù)；所述初始細(xì)胞至少為一個(gè)；其中，所述觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體的方法包括如下步驟1)對(duì)所述子代細(xì)胞的標(biāo)記染色體進(jìn)行染色；2)在步驟1)基礎(chǔ)上，觀察所述子代細(xì)胞中染色的標(biāo)記染色體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述進(jìn)行染色的方法包括如下步驟將所述子代細(xì)胞固定，再將一抗與所述固定后的細(xì)胞共同孵育，得到結(jié)合一抗的細(xì)胞；再將熒光染料標(biāo)記的二抗與所述結(jié)合一抗的細(xì)胞共同孵育，得到結(jié)合二抗的細(xì)胞；所述一抗為抗所述堿基類似物的IgG ；所述二抗為與所述一抗結(jié)合的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述抗堿基類似物的IgG為小鼠抗堿基類似物的IgG ；所述二抗為驢抗小鼠的IgG ；所述熒光染料為FITC。
4.一種輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法，包括如下步驟(1)用堿基類似物標(biāo)記待監(jiān)測(cè)細(xì)胞，標(biāo)記后的待監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)所有DNA雙鏈中的一條單鏈被標(biāo)記上所述堿基類似物，將標(biāo)記后的待監(jiān)測(cè)細(xì)胞記作未進(jìn)行細(xì)胞分裂的初始細(xì)胞；將標(biāo)記有堿基類似物的染色體記作標(biāo)記染色體；(2)按照如下1)或2)所述方法確定所述初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；1)、觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中的每一個(gè)細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體，則觀察統(tǒng)計(jì)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量，根據(jù)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量得出初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；2)、觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中至少有一個(gè)細(xì)胞不含有標(biāo)記染色體，則觀察統(tǒng)計(jì)子代細(xì)胞中含有標(biāo)記染色體的細(xì)胞的數(shù)量占子代細(xì)胞中所有細(xì)胞數(shù)量的百分比，根據(jù)所述百分比得出初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；所述初始細(xì)胞至少為一個(gè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述根據(jù)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量得出初始細(xì)胞的分裂次數(shù)的方法包括如下步驟將所述單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量代入等式I，得出初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；等式I :Υ = -ο. 51+6. 93ΕΧΡ(-2. 47Χ/Ν)，其中X表示單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量，Y表示初始細(xì)胞的分裂次數(shù)，N表示該種初始細(xì)胞的染色體總數(shù)；所述步驟2)中，根據(jù)所述百分比得出初始細(xì)胞的分裂次數(shù)的方法包括如下步驟將所述百分比代入等式II，得出初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；等式II =Y = 0. 03+log2N+10. 12EXP (-2. 74X)，其中X表示所述百分比，Y表示初始細(xì)胞的分裂次數(shù)，N表示該種初始細(xì)胞的染色體總數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述堿基類似物為胸腺嘧啶類似物、腺嘌呤類似物、鳥嘌呤類似物、胞嘧啶類似物或尿嘧啶類似物；所述胸腺嘧啶類似物為 CldU、IdU、BrdU, EdU 或 H3-thymidine。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述用堿基類似物標(biāo)記待監(jiān)測(cè)細(xì)胞的方法包括如下步驟將處于有絲分裂中期的母細(xì)胞接于用于培養(yǎng)母細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，再向其中加入所述堿基類似物，培養(yǎng)至母細(xì)胞完成有絲分裂得到子細(xì)胞，所述子細(xì)胞即為所述待監(jiān)測(cè)細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述待監(jiān)測(cè)細(xì)胞為植物細(xì)胞或離體的動(dòng)物細(xì)胞；所述離體的動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選為CHO細(xì)胞；和/或，所述細(xì)胞分裂為有絲分裂；和/或，所述分裂的次數(shù)為1-9次或1-5次或2-5次。
9.權(quán)利要求1-8中任一所述的方法在輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞的增值速度中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1-8中任一所述的方法或權(quán)利要求9所述的應(yīng)用在篩選藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的輔助監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂次數(shù)的方法，包括如下步驟(1)用堿基類似物標(biāo)記待監(jiān)測(cè)細(xì)胞，標(biāo)記后的待監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)所有DNA雙鏈中的一條單鏈被標(biāo)記上所述堿基類似物，將標(biāo)記后的待監(jiān)測(cè)細(xì)胞記作未進(jìn)行細(xì)胞分裂的初始細(xì)胞；將標(biāo)記有堿基類似物的染色體記作標(biāo)記染色體；(2)按照如下1)或2)所述方法確定所述初始細(xì)胞的分裂次數(shù)；1)觀察由初始細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞中的標(biāo)記染色體，若子代細(xì)胞中的每一個(gè)細(xì)胞都含有標(biāo)記染色體，則觀察統(tǒng)計(jì)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量，根據(jù)單個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記染色體數(shù)量得出初始細(xì)胞的分裂次數(shù)。本發(fā)明方法的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在整個(gè)追蹤期間除了常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物飼養(yǎng)和最終的細(xì)胞染色操作外，無(wú)須額外操作。因此，本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102220416SQ201110099240
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月20日
發(fā)明者何大澄, 吳藝舟 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)