專利名稱：一種單一型黑色素及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黑色素及其合成方法和在藥品及化妝品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黑色素(melanin)是不溶于水和幾乎所有溶劑的無(wú)定形小顆粒，黑色素廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中的非均質(zhì)的類多酚聚合體。目前天然黑色素的提取主要是用動(dòng)物組織 (烏骨雞、章魚(yú)等)、植物(黑米、黑芝麻等)、微生物(產(chǎn)黑色素放線菌、真菌等)。黑色素的應(yīng)用廣泛，能作為紫外線吸收劑、抗氧化劑、自由基清除劑、陽(yáng)離子螯合劑和新型天然的藥物載體，也可用來(lái)治療某些與黑色素缺乏有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。另外，黑色素在化妝品、染發(fā)劑的裝飾作用以及生物殺蟲(chóng)劑的光保護(hù)劑等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。早在1%4年Commoner在研究蛙卵的黑素組織工作中就提出黑素可以俘獲自由基，并把他們穩(wěn)定在黑素基質(zhì)中，亦即說(shuō)明黑色素中含有自由基。電子順磁共振(Electron Paramagnetic Resonance，EPR)的工作原理是未成對(duì)電子在外加磁場(chǎng)中吸收微波輻射會(huì)改變電子自旋的狀態(tài)，所以Era波譜可以用來(lái)檢測(cè)自由基是否存在、自由基濃度、順磁性物質(zhì)的電子順磁共振光譜及證明自由基的結(jié)構(gòu)，波峰大小代表未成對(duì)電子含量的多寡。由于黑色素不溶于水和其他的有機(jī)容易，不能用核磁共振等技術(shù)測(cè)定其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，而紅外光譜anfrared Spectroscopy, IR)可以測(cè)試固態(tài)的樣品，且測(cè)試迅速，操作方便，重復(fù)性好，靈敏度高。頂能夠提供許多關(guān)于官能團(tuán)的信息，可以幫助確定部分乃至全部分子類型及結(jié)構(gòu)，常用來(lái)測(cè)定黑色素等固態(tài)樣品。目前已知的黑色素是復(fù)合型黑色素，尚未見(jiàn)單一型黑色素的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是公開(kāi)一種單一型黑色素及其制備方法和在藥品及化妝品中的應(yīng)用。本發(fā)明所述黑色素的特征是黑色的高分子聚合物，不溶于水、強(qiáng)酸和其他有機(jī)溶劑，微溶于強(qiáng)堿，EI5R測(cè)試顯示其含有1，8-DHN自由基。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一是以1，8_ 二羥基萘為原料在酸性條件下與等摩爾的NaNOJt用，產(chǎn)物過(guò)濾后沉淀用乙酸乙酯洗三次，得到的黑色粉末即為粉末狀 DHN-melanin。二是以1，8-二羥基萘為原料在pH5的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液中加入真菌TLOl胞外粗蛋白(含有漆酶)進(jìn)行催化，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，水相/有機(jī)相界面有不溶物，收集不溶物，分別用水、甲醇漂洗，晾干后得到片狀DHN-melanin。一、粉末狀DHN-melanin的制備方法
(1)將1，8-DHN加入酸性緩沖液中，攪拌，
(2)攪拌過(guò)程中不斷加入NaNO2至等摩爾，室溫?cái)嚢璋胄r(shí)，
(3)將反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)濾，得到的沉淀分別用乙酸乙酯、甲醇、水漂洗兩次，
(4)沉淀自然晾干，經(jīng)過(guò)EI3R測(cè)試、IR測(cè)試、電鏡觀察證實(shí)為粉末DHN-melanin。
二、片狀DHN-melanin的制備方法
(1)硫酸銨濃縮法制備真菌IFB-TLOl(Maldinia eschscholzii IFB-TL01，現(xiàn)保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為=CCTCCM 207198，保藏日期是2007. 12. 13)胞外粗蛋白，利用ABTS法測(cè)定粗蛋白中含有漆酶等氧化酶，
(2)粗蛋白的最適pH在5，在IOmlpH5的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液中加入5 mg 1， 8-DHN、200U 的粗蛋白，28°C，180 rpm 反應(yīng) 8 h,
(3)將反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相/水相界面有不溶物，將不溶物收集，分別用甲醇、水漂洗兩次，晾干后得到片狀黑色固體，經(jīng)過(guò)EI3R測(cè)試、頂測(cè)試、電鏡觀察證實(shí)為片狀 DHN—melanin。melanin的EPR測(cè)試說(shuō)明片狀DHN-melanin相對(duì)粉末狀DHN-melanin含有較多的自由基。電鏡結(jié)果顯示粉末狀DHN-melanin是不均一的顆粒，大小在400-1200 nm之間；片狀DHN-melanin是不規(guī)則片狀。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在公開(kāi)了一種單一型的黑色素的制備方法，可以用在化妝品中起抗氧化和射線、清除自由基的作用，可以用在染發(fā)劑中起裝飾作用，也可用在生物殺蟲(chóng)劑方面起光保護(hù)劑的作用。


圖1為粉末狀DHN-melanin的電鏡照片圖2為粉末狀DHN-melanin的EI3R測(cè)試3為粉末狀DHN-melanin的頂測(cè)試圖
圖4為片狀DHN-melanin的電鏡照片圖5為片狀DHN-melanin的ESR測(cè)試6為片狀DHN-melanin的頂測(cè)試圖。
具體實(shí)施例方式通過(guò)下面給出的具體實(shí)施例可以進(jìn)一步了解本發(fā)明。但它們不是對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1 粉末狀DHN-melanin的制備方法
1)將1，8-DHN慢慢加入檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH5.0 )中，攪拌，
2)攪拌過(guò)程中不斷加入IM的NaNO2溶液至等摩爾，室溫?cái)嚢璋胄r(shí)，
3)將反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)濾，不溶物分別用乙酸乙酯、甲醇、水漂洗兩次，
4)沉淀自然晾干，經(jīng)過(guò)EI3R測(cè)試、IR測(cè)試、電鏡觀察證實(shí)為粉末DHN-melanin。實(shí)施例2 硫酸銨濃縮法制備真菌eschscholzii IFB-TL01胞外粗蛋白真菌IFB-TLOl在PDA平板上活化，將新鮮的菌體塊接種到1 L錐形瓶中，每瓶含有400
mL的ME培養(yǎng)基，接種5 - 6瓶于搖床上，在150 — 200 rpmJ8°C條件下培養(yǎng)4天后，將菌體過(guò)濾，菌液在4°C，10，000 rpm離心20 min出去殘留菌絲體；菌液中緩慢加入硫酸銨，使其終濃度為80%(每升菌液加入516g硫酸銨)，4°C下磁力攪拌器攪拌過(guò)夜使蛋白充分沉淀； 4°C下10，OOOrpm離心20 min后去除上清；沉淀用適量檸檬酸-Na2HPO4緩沖液溶解(濾紙過(guò)濾除去不溶物)；置于透析袋中透析；之后將酶液進(jìn)行凍干成褐色粉末。
實(shí)施例3 真菌IFB-TLOl胞外粗蛋白酶活測(cè)定
參照Robort Bourbounais方法，以3-乙基苯并噻唑_6_磺酸(ABTQ為底物，測(cè)定酶對(duì)其的氧化速率。具體方法為反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，總反應(yīng)體積為3 ml，包括0.5 ml 0.5 mmol/L ABTS和1. 5 ml 0. 1 mmol/L檸檬酸，添加1 ml發(fā)酵液，在420 nm下測(cè)定其吸光值的變化，酶的單位定義為每分鐘酶液吸光值增加量Δ 0D420/ (ml. min)，證明TLOl胞外粗蛋白有漆酶(或氧化酶)活性。實(shí)施例4 片狀DHN-melanin的制備方法
1)硫酸銨濃縮制備的粗蛋白的最適PH在5，在IOmlpH5的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液中加入 5 mg 1，8-DHN、200 U 的粗蛋白，28°C，180 rpm 反應(yīng) 8 h，
2)將反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相/水相界面有不溶物，將不溶物收集，分別用甲醇、水漂洗兩次，晾干后得到片狀黑色固體，經(jīng)過(guò)EI3R測(cè)試、頂測(cè)試、電鏡觀察證實(shí)為片狀 DHN—melanin。實(shí)施例5 兩種melanin的· OH自由基清除活性測(cè)定
1)所需溶劑=CuSO4溶液，1. 14 mmol/ L ；苯甲酸溶液，0. 925 mmol/ L ；抗壞血酸(AA)， 0. 97mmol/ L溶液(使用前配制)；磷酸鹽緩沖溶液，pH7. 40。2)在IOmL的試管中依次分別加入5. 00 mL pH7. 4的磷酸鹽緩沖溶液，0. 30 mL 1.14 mol/ L CuSO4 溶液，1.20 L 0.925 mmol/ L 苯甲酸和 LOOmL 97 μ mol/ L AA，定容至10 ml搖勻，在室溫下放置90 min，取200μ 1加到黑色的96孔板上，然后在激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為四4 nm和414 nm下測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度。3)在以上體系中加入一定量的黑色素，測(cè)定熒光強(qiáng)度為Fs，未加黑色素的空白體系，其熒光強(qiáng)度為Ftl ；未加抗壞血酸及黑色素的體系，其熒光強(qiáng)度為F，則清除率
權(quán)利要求
1.一種單一型黑色素，其特征是黑色的高分子聚合物，不溶于水、強(qiáng)酸和其他有機(jī)溶劑，微溶于強(qiáng)堿，Era測(cè)試顯示其含有1，8-DHN自由基，紅外光譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述單一型黑色素的制備方法，其特征是由下列步驟組成(1)粉末狀DHN-melanin1)將1，8-DHN加入酸性緩沖液中，攪拌，2)攪拌過(guò)程中不斷加入NaNO2至等摩爾，室溫?cái)嚢璋胄r(shí)，3)將反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)濾，得到的沉淀分別用乙酸乙酯、甲醇、水漂洗兩次，4)沉淀自然揮干，經(jīng)過(guò)ESR測(cè)試、電鏡觀察證實(shí)為粉末DHN-melanin；(2)片狀DHN-melanin1)硫酸銨濃縮法制備真菌eschscholziiIFB-TL01胞外粗蛋白，利用ABTS 法測(cè)定粗蛋白中含有的漆酶，2)粗蛋白的pH為5，在10ml pH5的檸檬酸-Nei2HPO4緩沖液中加入5 mg 1，8_DHN、 200U 的粗蛋白，28°C，180 rpm 反應(yīng) 8 h，3)將反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相/水相界面有不溶物，將不溶物收集，分別用甲醇、水漂洗兩次，涼干即得到片狀黑色固體，經(jīng)過(guò)ESR測(cè)試、電鏡觀察證實(shí)為片狀 DHN-melaninο
3.權(quán)利要求1所述單一型黑色素在清除羥自由基中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述單一型黑色素在制備化妝品中起抗氧化和射線、清除自由基的作用。
5.權(quán)利要求1所述單一型黑色素在制備染發(fā)劑中起裝飾作用。
6.權(quán)利要求1所述單一型黑色素在制備生物殺蟲(chóng)劑中起光保護(hù)劑作用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種單一型黑色素及其制備方法和在藥品及化妝品中的應(yīng)用本發(fā)明一是以1，8-二羥基萘為原料在酸性條件下與NaNO2作用得到的黑色粉末即為粉末二羥基萘－黑色素(DHN-melanin)；二是以1，8-二羥基萘在真菌DaldiniaeschscholziiIFB-TL01胞外粗蛋白的催化下得到片狀的DHN-melanin。得到的兩種形態(tài)的黑色素均有較強(qiáng)的羥基自由基清除活性。本發(fā)明可以用在化妝品中起抗氧化和射線、清除自由基的作用，可以用在染發(fā)劑中起裝飾作用，也可用在生物殺蟲(chóng)劑方面起光保護(hù)劑的作用，適用于藥品及化妝品等生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12P1/02GK102225995SQ20111009949
公開(kāi)日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月20日
發(fā)明者宋勇春, 宋雅男, 汪偉, 沈薇, 譚仁祥 申請(qǐng)人:南京大學(xué)